Summary
Nous présentons ici VirWaTest, qui est une méthode simple, abordable et portable pour la concentration et la détection des virus à partir d'échantillons d'eau au point d'utilisation.
Abstract
Les virus excrétés par les humains et les animaux peuvent contaminer les sources d'eau et présenter un risque pour la santé humaine lorsque cette eau est utilisée pour boire, irriguer, laver, etc. L'indicateur classique des bactéries fécales ne vérifie pas toujours la présence d'agents pathogènes viraux, de sorte que la détection des agents pathogènes viraux et des indicateurs viraux est pertinente afin d'adopter des mesures d'atténuation des risques, en particulier dans les scénarios humanitaires et dans les zones où les flambées virales d'origine hydrique sont fréquentes.
À l'heure actuelle, plusieurs tests commerciaux permettant la quantification des bactéries indicateurs fécales (FIB) sont disponibles pour des tests au point d'utilisation. Cependant, de tels tests commerciaux ne sont pas disponibles pour la détection des virus. La détection des virus dans les échantillons d'eau de l'environnement nécessite de concentrer plusieurs litres en plus petits volumes. De plus, une fois concentrés, la détection des virus repose sur des méthodes telles que l'extraction de l'acide nucléique et la détection moléculaire (p. ex., les essais en chaîne de polymérase (PCR] des génomes viraux).
La méthode décrite ici permet la concentration de virus à partir d'échantillons d'eau de 10 L, ainsi que l'extraction d'acides nucléiques viraux au point d'utilisation, avec un équipement simple et portable. Cela permet de tester des échantillons d'eau au point d'utilisation de plusieurs virus et est utile dans les scénarios humanitaires, ainsi que dans n'importe quel contexte où un laboratoire équipé n'est pas disponible. Alternativement, la méthode permet de concentrer les virus présents dans les échantillons d'eau et l'expédition du concentré à un laboratoire à température ambiante pour une analyse plus approfondie.
Introduction
Pendant les premières phases de toute urgence humanitaire, l'accès à l'approvisionnement en eau potable, à l'assainissement et à l'hygiène est essentiel à la survie des personnes touchées. Par conséquent, la surveillance de la qualité de l'eau est une priorité pour prévenir les flambées d'origine hydrique. Il est bien connu que l'eau contaminée est souvent à l'origine de maladies, mais il est souvent difficile de déterminer les sources d'éclosions virales telles que le virus de l'hépatite E (VHE), même avec la disponibilité de méthodes de laboratoire conventionnelles. Le contrôle de la qualité de l'eau est basé sur la quantification de FIB1,2,3,4. Cependant, il a été largement documenté qu'il n'y a aucune corrélation entre l'absence de FIB et la présence d'agents pathogènes d'origine hydrique virale tels que le rotavirus (RoV), le norovirus (NoV), ou le VHE5,6. Ainsi, l'utilisation des critères de qualité de l'eau basés sur la FIB pourrait entraîner une sous-estimation des risques associés à la présence d'agents pathogènes viraux d'origine hydrique. La surveillance de virus indicateurs, tels que les adénovirus humains (HAdV), ou d'agents pathogènes spécifiques serait utile pour définir l'exposition aux agents pathogènes viraux et identifier la source potentielle de l'infection humaine7,8, 9,10 et en validant l'efficacité des mesures d'assainissement11.
Jusqu'à présent, la détection des virus dans ces scénarios reposait sur un personnel qualifié et une logistique complexe. VirWaTest (virwatest.org) vise le développement d'une méthode simple, abordable et portable pour la concentration et la détection subséquente des virus à partir d'échantillons d'eau au point d'utilisation.
La concentration du virus est basée sur le principe de la flocculation organique de 10 Échantillons d'eau L, par lequel les virus sont récupérés en plus petits volumes12,13. Les flocs sont recueillis et ajoutés à un tampon qui lyse les virus et empêche les acides nucléiques de se dégrader lorsqu'ils sont stockés à température ambiante pendant au plus 2 semaines.
La méthode d'extraction de l'acide nucléique est basée sur l'utilisation de particules magnétiques auxquelles les acides nucléiques obtiennent adsorbed. Ils peuvent être transférés d'un tampon de lavage à un autre et enfin dans le tampon d'élution à l'aide d'une pipette magnétique à laquelle les particules se fixent. Les suspensions d'acide nucléique viral obtenues peuvent être expédiées à un laboratoire de référence où la détection peut être effectuée à l'aide de méthodes moléculaires basées sur pcR. Pour chaque extraction d'acide nucléique, deux quantités différentes sont testées pour exclure l'inhibition enzymatique provenant de l'échantillon. Alternativement, avec une disponibilité minimale de l'équipement, les tests PCR peuvent être exécutés au point d'utilisation. L'ensemble du processus est conçu pour être exécuté indépendamment d'une alimentation électrique (figure 1).
Un essai quantitatif de PCR pour détecter le HAdV, excrété par l'homme et trouvé dans des échantillons d'eaux usées en concentrations élevées, a été adapté pour être exécuté au point d'utilisation. Le VHA est utilisé comme indicateur viral fécal humain. Un PCR pour la quantification du bactériophage MS2 a également été adapté puisque MS2 est utilisé dans VirWaTest comme contrôle des processus. La méthode peut être personnalisée pour la détection de tout virus d'intérêt.
Après le développement, la méthode VirWaTest a été appliquée par les utilisateurs dans deux contextes différents en République d'Afrique centrale (RCA) et en Equateur, fournissant des commentaires sur l'application du protocole dans des situations réelles.
À notre connaissance, il s'agit de la première procédure qui permet la concentration et la détection des virus au point d'utilisation, indépendamment de toute alimentation électrique, de gros équipements et de conditions de congélation/refroidissement. Il est recommandé de prélever deux répliques de chaque échantillon d'eau afin d'obtenir des résultats robustes.
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Protocol
1. Préparation et emballage
REMARQUE : Les matériaux/équipements à emballés figurent dans le tableau 1. Utilisez des gants pour manipuler les réactifs nécessaires au contrôle des processus, les réactifs de concentration, les réactifs d'extraction d'acide nucléique et les réactifs de détection. Portez des lunettes de protection pour manipuler les réactifs requis pour l'extraction d'acide nucléique.
- Contrôle du processus
- Préparer la culture des stocks de bactériophages MS2 (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) contenant 1 x 1010 PFU/mL en laboratoire en suivant la procédure ISO 10705-1:199514.
- Ensuite, aliquot 10 l de la suspension par tube contenant 1 x 108 PFU en tubes de 10 ml et laisser l'eau s'évaporer à 37 oC. Utilisez un tube par échantillon d'eau.
- De plus, préparez un tube contenant 10 ml d'eau distillée stérile par échantillon prélevé.
- Réactifs de concentration
- Pour la solution de lait écrémé préfloculé (PSM), utilisez les quantités suivantes pour concentrer cinq échantillons d'eau de 10 L.
- Préparer un tube en plastique contenant 5 g de lait écrémé.
- Préparer un sac en plastique à fermeture éclair contenant 16,66 g de sels de mer.
- Préparer une bouteille en plastique contenant 500 ml d'eau distillée.
- Préparer les réactifs nécessaires à l'ajustement du pH. Utilisez les quantités suivantes pour ajuster le pH du MSP et de cinq échantillons d'eau de 10 L.
- Ajouter 5 g d'acide citrique 1 hydrate dans un tube en plastique de 10 ml.
CAUTION: L'acide citrique provoque une irritation grave quand il entre en contact avec les yeux. Si cela se produit, rincez l'œil avec précaution avec de l'eau pendant plusieurs minutes. Si l'irritation persiste, consulter un médecin. - Mettre 2 g d'hydroxyde de sodium dans un tube en plastique de 10 ml.
CAUTION : L'hydroxyde de sodium peut causer de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires. En cas d'ingestion, rincer la bouche. N'induisez pas de vomissements. S'il entre en contact avec les yeux, rincer prudemment à l'eau pendant plusieurs minutes. Ensuite, consultez un médecin. - Mettre 25 ml d'eau distillée stérile dans un récipient en plastique.
- Mettre 50 ml d'eau distillée stérile dans un récipient en plastique.
- Ajouter 5 g d'acide citrique 1 hydrate dans un tube en plastique de 10 ml.
- Préparer le sachet de conditionnement d'échantillon utilisé pour la flocculation, la solution de conservation utilisée pour préserver les acides nucléiques, et le sachet neutralisant pour neutraliser l'eau et les matériaux jetés. Utilisez les quantités suivantes pour chaque échantillon d'eau de 10 L à tester.
- Mettre 15 g de sels de mer et 8 g d'acide citrique 1 hydrate dans un sac en plastique à fermeture éclair pour le sachet de conditionnement.
- Ajouter 2 mL de tampon de lyse (Table des matériaux) et 0,3 ml d'agent de conservation de l'acide nucléique (Tableau des matériaux) à un tube de 5 ml.
CAUTION: Le tampon de Lysis contient de la guanidine thiocyanate et du Triton X-100. Le contact avec l'acide libère les gaz toxiques, et il est nocif s'il est avalé, inhalé, ou entre en contact avec la peau. En cas d'ingestion, rincer la bouche. N'induisez pas de vomissements. S'il entre en contact avec la peau, lavez-le avec beaucoup d'eau. Ensuite, consultez un médecin. L'agent de conservation de l'acide nucléique provoque une irritation de la peau et des yeux et est nocif s'il est avalé. S'il entre en contact avec la peau ou les yeux, rincer à l'eau abondante pendant plusieurs minutes. Dans tous les cas, surtout si avalé et se sentir mal, consulter un médecin. - Mettre 40 g de poudre de détergent dans quatre sacs en plastique à fermeture éclair.
CAUTION : Le détergent à poudre cause l'irritation d'oeil. S'il entre en contact avec les yeux, rincer à l'eau abondante pendant plusieurs minutes. Si l'irritation persiste ou si elle est avalée, consultez un médecin.
- Pour la solution de lait écrémé préfloculé (PSM), utilisez les quantités suivantes pour concentrer cinq échantillons d'eau de 10 L.
- Réactifs d'extraction d'acide nucléique
- Mettre 50 l de particules magnétiques (Tableaudes matériaux)et 1 ml d'éthanol 96 % dans un tube de 5 ml qui constitue le tampon de liaison.
CAUTION: Le tampon de particules magnétiques contient de l'azide de sodium, qui forme un gaz toxique lorsqu'il entre en contact avec des acides ou des ions métalliques lourds et est toxique s'il est ingéré ou lorsqu'il entre en contact avec la peau. En cas d'ingestion ou en contact avec la peau, rincez la bouche ou la peau avec de l'eau abondante et consultez un médecin. L'éthanol est un liquide et une vapeur hautement inflammables qui causent une irritation oculaire grave. Éloignez-vous de la chaleur, des surfaces chaudes, des étincelles et de toute autre source d'inflammation. S'il entre en contact avec la peau ou les yeux, rincer à l'eau abondante. En cas d'ingestion de grandes quantités d'eau et/ou en cas d'inhalation, aller à l'extérieur dans l'air frais. Dans tous les cas, consulter un médecin. - Ajouter 500 l, 600 l et 200 l de tampons de lavage 1, 2 et 3, respectivement (Tableau des matériaux), à trois tubes de 2 ml.
CAUTION : Les tampons de lavage contiennent du piocyanate de guanidinium et du chlorure de guanidinium, qui sont nocifs s'ils sont inhalés ou avalés et irritent la peau et les yeux. Le contact avec les acides libère des gaz très toxiques. S'ils entrent en contact avec la peau ou les yeux, rincez avec de l'eau abondante. En cas d'ingestion, rincer la bouche avec de l'eau abondante. N'induisez pas de vomissements. Consultez toujours un médecin. - Ajouter 120 l de tampon d'élution (Table des Matériaux) à un tube de 0,5 ml.
- Mettre 50 l de particules magnétiques (Tableaudes matériaux)et 1 ml d'éthanol 96 % dans un tube de 5 ml qui constitue le tampon de liaison.
- Réactifs de détection HAdV et MS2
REMARQUE : Deux réactions différentes d'extraction d'acide nucléique peuvent être analysées simultanément dans chaque analyse de PCR si un thermocycler de 8 puits est employé. Pour tous les essais de PCR, préparer l'eau de biologie moléculaire aliquoted dans des tubes de 1,5 ml.-
Détection hAdV
- Préparer un mélange contenant 10 l d'amorce adflade AdF de 22,5 M, 10 l d'amorce inversée AdR de 22,5 M, et 5 l de sonde AdP de 11,25 M (tableau 2).
- Ajouter 2,5 l de l'mélange dans les tubes 1 à 8 d'une bande tubulaire. Laissez-le sécher à température ambiante, fermez les tubes et protégez-les de la lumière.
- Couper la bande en la divisant en deux bandes : tubes 1-5 et tubes 6-8.
- Préparer une dilution en série des suspensions d'ADN contenant la séquence nucléotide de la région amplifiée de HAdV. Sécher à l'air 1 l de suspensions contenant 1 x 105, 1 x 107, et 1 x 109 GC/mL dans des tubes 6-8.
REMARQUE : Gardez les tubes contenant les amorces, la sonde et les suspensions séchées à l'air à l'abri de la lumière.
-
Détection MS2
- Préparer un mélange contenant 10 'L de 25 'M pecson-2F amorce avant, 10 'L de 25 'M pecson-2R amorce inversée, et 2,5 'L de 25 'M pecP-2 sonde (tableau 2).
- Ajouter 2,25 l de l'mélange dans les tubes 1 à 8 d'une bande tubulaire. Laissez-le sécher à température ambiante, fermez les tubes et protégez-les de la lumière.
- Couper la bande en la divisant en deux bandes : tubes 1-5 et tubes 6-8.
- Procédez comme à l'étape 1.4.1.4 mais utilisez une suspension standard conçue pour MS2 à la place.
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Détection hAdV
2. Concentration virale
REMARQUE : Utilisez des gants en tout temps pendant la collecte de l'échantillon, la préparation du réactif, la flocculation, la collecte des flocs et les procédures d'élimination des déchets. Portez des lunettes de protection pendant la procédure de préparation du réactif.
- Collecte d'échantillons
- Recueillir un échantillon d'eau de 10 L dans un seau à fond plat avec un couvercle. Recueillir un minimum de deux répliques pour chaque échantillon.
REMARQUE : Il est important d'utiliser des seaux clairs pour visualiser le granule. Si l'échantillon d'eau contient du matériel en suspension (p. ex. sable, algues), laissez-le sédimenter et, ensuite, recueillir le supernatant d'eau dans un nouveau seau. - Enregistrez le volume recueilli, ainsi que l'emplacement et la date de collecte, pour chaque échantillon d'eau.
- Placez un agitateur magnétique relié à une batterie sous un support de seau et placez le seau contenant l'échantillon d'eau sur son support.
REMARQUE : Recherchez une surface plane dans un endroit frais et gardez les seaux contenant les échantillons d'eau de la lumière directe du soleil.
- Recueillir un échantillon d'eau de 10 L dans un seau à fond plat avec un couvercle. Recueillir un minimum de deux répliques pour chaque échantillon.
- Préparation des réactifs
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réagents d'ajustement de pH
- Verser la poudre d'acide citrique et les granulés d'hydroxyde de sodium dans les pots contenant 25 et 50 ml d'eau distillée, respectivement.
- Secouez doucement à la main jusqu'à ce que l'acide citrique et l'hydroxyde de sodium soient complètement dissous.
ATTENTION : Ne versez pas l'eau sur les granulés d'hydroxyde de sodium. Au lieu de cela, versez les granulés d'hydroxyde de sodium sur l'eau.
-
Lait écrémé préfloculé
- Placez un sac de stand-up sur un agitateur magnétique et versez 500 ml d'eau distillée dedans. Déposez un aimant remuant à l'intérieur du sac et allumez l'agitateur magnétique.
- Verser le contenu d'un sachet de sel de mer et d'un tube de lait écrémé dans le sac de stand-up et remuer pendant 5 minutes à vitesse moyenne pour les dissoudre.
- Ajouter 3 ml d'acide citrique à la solution PSM à l'aide d'une pipette Pasteur pour s'assurer que le pH se situe entre 3,4 et 3,6. Mesurez le pH de la solution PSM à l'aide de bandes d'indicateur de pH. Ajoutez de plus petites quantités d'acide citrique et d'hydroxyde de sodium à mesure que le pH se rapproche de 3,5.
- Éteignez l'agitateur magnétique et assurez-vous que les flocs sont visibles. Utilisez une lampe de poche pour aider à visualiser les flocs.
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réagents d'ajustement de pH
- Floculation
- Déposez un aimant remuant dans l'eau, installez l'agitateur magnétique à une vitesse maximale et allumez-le. Assurez-vous que l'aimant en remuant commence à tourner.
- Ajouter 10 ml d'eau distillée dans un tube de contrôle des processus. Inverser le tube à quelques reprises pour réhydrater le bouillon viral et verser la solution dans l'eau.
- Verser le contenu d'un sachet de conditionnement d'échantillon dans l'eau et remuer pendant 5 min.
- Mesurer le pH de l'échantillon d'eau à l'aide de bandes d'indicateur de pH. Ajoutez quelques gouttes d'acide citrique ou d'hydroxyde de sodium à l'échantillon d'eau pour vous assurer que le pH se situe entre 3,4 et 3,6. Ajoutez de plus petites quantités d'acide citrique et d'hydroxyde de sodium à mesure que le pH se rapproche de 3,5.
- Ajouter 100 ml de la solution PSM à l'aide d'un contenant de 100 ml.
- Scellez le seau avec le couvercle, régler l'agitateur magnétique à vitesse minimale, et laisser l'eau en remuant pendant 8 h.
- Éteignez l'agitateur magnétique et laissez l'eau immobile pendant au moins 5 h pour permettre aux flocs de se déposer.
- Collection Floc
- Construire un système de siphonnage composé d'un contrôleur de pipette, deux pipettes, et un tube en plastique, pour aspirer le surnatant d'eau pour décharger l'eau sur les flocs.
- Fixez une pipette à extrémité de bande de 10 ml au contrôleur de pipette. Ensuite, attachez la pointe de la pipette au tube en plastique.
- Retirez le filtre d'une pipette à pointe ouverte de 10 ml à l'aide d'une pince à épiler et attachez la pipette au tube en plastique.
- Placez un seau vide sur le sol.
- Immerger le bout de la pipette à pointe ouverte dans l'eau. Assurez-vous de le garder près de la surface de l'eau pour éviter de déranger les flocs. Aspirez le surnatant d'eau jusqu'à ce qu'il atteigne la pipette à extrémité du ruban adhésif.
- Pincer le tube en plastique à l'extrémité attaché à la pipette à l'extrémité du ruban adhésif et le détacher de la pipette.
- Placer le tube dans un seau vide. Relâchez la pression sur le tube pour laisser l'eau s'écouler dans le seau vide.
- Pincez le tube en plastique pour arrêter le débit d'eau lorsque le niveau d'eau est sur le point d'atteindre l'aimant en mouvement et déplacer la pipette loin du seau.
- Secouez le seau pour resuspendre les flocs et versez-les dans un sac en plastique de 500 ml. Laisser les flocs se contenter de 1 h de plus.
- Aspirez soigneusement le supernatant d'eau à l'aide d'une pipette de 50 ml et d'un contrôleur manuel de pipette, évitant de déranger les flocs.
- Aspirez les flocs à l'aide d'une pipette de 100 ml et transférez-les dans un tube de centrifugeuse gradué de 50 ml. Notez le volume final du concentré d'échantillon et transférez 1 ml de celui-ci dans un tube de 5 ml contenant la solution de conservation, à l'aide d'une pipette Pasteur.
REMARQUE : Il est important que le tube de centrifugeuse soit gradué afin que le volume final de l'échantillon concentré puisse être mesuré aussi précisément que possible et enregistré. - Effectuer l'extraction d'acide nucléique dans le champ. Vous pouvez également entreposer la solution de conservation contenant les virus à 20-30 oC pendant une durée pouvant aller jusqu'à 15 jours ou les expédier à un laboratoire de référence pour une analyse plus approfondie.
- Construire un système de siphonnage composé d'un contrôleur de pipette, deux pipettes, et un tube en plastique, pour aspirer le surnatant d'eau pour décharger l'eau sur les flocs.
- Élimination des déchets et réutilisation des matériaux
- Ajouter le contenu d'un sachet d'agent neutralisant dans le seau contenant l'eau jetée. Mélanger l'eau, puis, laisser encore pendant 30 min.
- Disposer de l'eau traitée comme déchets généraux.
- Placez les pipettes et le tube en plastique à l'intérieur du seau. Remplissez le seau d'eau et versez le contenu d'un sachet d'agent neutralisant.
- Lavez-les pendant au moins 30 minutes pour les stériliser et rincez-les avec de l'eau propre abondante pour enlever tout agent neutralisant restant.
3. Extraction d'acide nucléique
REMARQUE : Utilisez des gants et portez toujours des lunettes de protection pendant la procédure d'extraction de l'acide nucléique.
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Opération pipette magnétique
- Familiarisez-vous avec le fonctionnement de la pipette magnétique avant d'effectuer l'extraction.
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Extraction d'acide nucléique
- Disposer les tubes contenant les réactifs nécessaires à l'extraction dans un rack, de gauche à droite : tampon de liaison, tampons de lavage et tampon d'élution. Définir le nombre approprié de tubes en fonction du nombre d'échantillons ou de répliques analysés.
- Transférer 1 ml de concentré d'échantillon dans le tube contenant le tampon de liaison, à l'aide d'une pipette Pasteur jetable. Inverser le tube 8x à 10x pour homogénéiser la solution.
- Incuber la solution à température ambiante pendant 10 min tout en mélangeant continuellement, soit à l'aide d'une orbitale solaire, soit manuellement.
- Recueillir les particules magnétiques à l'aide de la pipette magnétique et une pointe propre, qui peut être réutilisée pour les trois tampons de lavage.
- Relâchez les particules magnétiques dans le tube contenant 500 l de tampon de lavage 1. Lavez-les en secouant doucement la solution avec la pointe pendant 30 s et collectez-les.
- Transférer les particules magnétiques dans le tube contenant 600 l de tampon de lavage 2. Lavez-les en secouant doucement la solution avec la pointe pendant 30 s et collectez-les.
- Transférer les particules magnétiques dans le tube contenant 200 l de tampon de lavage 3. Lavez-les en secouant doucement la solution avec la pointe pendant 30 s et collectez-les.
- Relâchez les particules magnétiques dans le tube contenant le tampon d'élution et jetez la pointe.
- Incuber la solution à température ambiante pendant 5 min tout en mélangeant continuellement, en utilisant l'orbitale solaire.
REMARQUE : Le mélange des particules magnétiques dans le tampon d'élution est une étape cruciale. En cas d'absence d'orbitale, mélanger continuellement à la main pendant le temps d'incubation. - Remplacez la pointe de la pipette magnétique par une nouvelle et collectez les particules magnétiques du tampon d'élution. Assurez-vous d'enlever complètement les particules magnétiques du tampon d'élution, car elles peuvent interférer avec les méthodes de détection moléculaire.
- Jetez la pointe avec les particules qui y sont attachées. Procédez à l'analyse PCR, expédions le tampon d'élution à un laboratoire de référence, ou stockez le tampon d'élution à 4 oC pour une analyse plus approfondie.
4. Détection virale à l'aide d'un thermocycleur en temps réel à huit tubes à piles
REMARQUE : Utilisez des gants et portez toujours des lunettes de protection pendant la procédure de détection de l'acide nucléique. Remplacez les gants pour les nouveaux lors de l'exécution d'une nouvelle expérience PCR pour éviter la contamination croisée.
-
HAdV quantitative PCR
- Ajouter 14 ll d'eau sans nucléane aux tubes 2, 4 et 5.
- Ajouter 4 ll de mélange PCR dans les tubes 1-5.
- Ajouter 14 L d'extraction d'acide nucléique de l'échantillon A au tube 1 et 14 L de l'échantillon B au tube 3.
- Ajouter 2 ll d'acides nucléiques extraits de l'échantillon A au tube 2 et 2 L de l'échantillon B au tube 4. Fermez la bande à cinq tubes.
- Ajouter 14 ll d'eau sans nucléane aux tubes 6, 7 et 8.
- Ajouter 4 ll de ce mélange dans les tubes 6, 7 et 8, et les fermer.
- Mettre les deux bandes dans le thermocycler et sélectionner la course appropriée (tableau 3).
- Jeter le tube d'eau et garder l'acide nucléique extrait dans le congélateur, si possible, ou, si ce n'est pas le cas, dans un endroit frais protégé de la lumière au cas où un deuxième essai doit être effectué.
- Nettoyez les micropipettes, la grille, le matériel de travail et tout le matériel correctement avec un nettoyant à l'acide nucléique, et jetez le sac en plastique contenant la pointe utilisée, les gants et les tubes.
CAUTION: Démaquillant d'acide nucléique est un liquide très inflammable et de la vapeur. Ne respirez pas la brume de pulvérisation et évitez tout contact du liquide avec les yeux ou la peau. Sinon, rincez immédiatement avec de l'eau abondante et consultez un médecin. - Recueillir les résultats et analyser les données obtenues.
-
MS2 PCR quantitatif
- Ajouter 14 ll d'eau sans nucléane aux tubes 2, 4 et 5.
- Ajouter 4 L de mélange PCR et 0,5 l d'enzyme de transcriptase inversée dans les tubes 1-5.
- Ajouter 14 L d'extraction d'acide nucléique de l'échantillon A au tube 1 et 14 L de l'échantillon B au tube 3.
- Ajouter 1 l d'acides nucléiques extraits de l'échantillon A au tube 2 et 1 L de l'échantillon B au tube 4. Fermez la bande à cinq tubes.
- Ajouter 15,5 l d'eau sans nucléane dans les tubes 5, 6, 7 et 8, et les fermer.
- Ajouter 4 ll de mélange PCR et 0,5 l d'enzyme de transcriptase inversée aux tubes 6, 7 et 8.
- Mettre les deux bandes dans le thermocycler et sélectionner la course appropriée (tableau 3).
- Procédez comme décrit dans les étapes 4.1.8 à 4.1.10.
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Representative Results
Développement de méthodes
Cette procédure a été développée dans le Laboratoire des virus contaminants de l'eau et de l'alimentation avec la collaboration de GenIUL et d'Oxfam Intermon. Il se compose de trois étapes différentes. La première, la concentration virale de particules, est une adaptation d'une méthode de flocculation du lait écrémé précédemment décrite12,17,18. La méthode originale a été modifiée pour être indépendante d'une alimentation, plus simple, et sans étapes de centrifugation.
La récupération de la méthode de concentration VirWaTest a été testée dans des échantillons d'eau souterraine à pointes de bactériophage HA2 et MS2. La récupération virale de la méthode de concentration et d'extraction de VirWaTest a été estimée à 3,01 % à 18,02 % pour mS2 et de 17,52 % à 44,22 % pour le VHA. Ces récupérations ont été calculées à partir des valeurs obtenues par PCR quantitative au cours de l'élaboration de la méthode par rapport aux concentrations initiales de VhA et de MS2 dans les échantillons d'eau après les avoir échantillonnés avec des concentrations connues de ces stocks viraux.
L'extraction d'acide nucléique magnétique VirWaTest a été comparée à un mini kit commercial d'ARN (p. ex., QIAamp Viral RNA Mini Kit), une méthode d'extraction à base de colonnes utilisée en laboratoire, en testant 33 échantillons de rivières et d'eaux souterraines avec hAdV et MS2 et concentrés par flocculation de lait écrémé. Les résultats de comparaison ont montré que la récupération de la méthode VirWaTest était plus élevée dans 23/33 cas pour le VHA, ainsi que pour le MS2 (tableau 4). Un test de Wilcoxon a montré des valeurs pde 0,0005569 pour le VHA et de 0,02791 pour mS2. L'extraction d'acide nucléique VirWaTest procure des récupérations virales significativement plus élevées que la récupération virale.
Détection du VHA dans les échantillons d'eau environnementale concentrés par la méthode VirWaTest
Pour tester la méthode développée pour la concentration virale sur le terrain, l'équipe d'Oxfam Eau, Assainissement et Hygiène (WASH), située à Banghi (RCA) en mars 2017, a recueilli et concentré des virus à partir de cinq échantillons d'eau de puits.
Par ailleurs, dans la région de Pedernales (Équateur), touchée par des tremblements de terre en 2016 et 2017, six échantillons d'eau de puits ont été prélevés par une équipe d'Oxfam WASH en février 2017, et ses virus ont été concentrés par la méthode de concentration VirWaTest. Des concentrés viraux des deux milieux ont été envoyés au laboratoire de Barcelone pour l'extraction d'acide nucléique VirWaTest et la quantification virale.
En Equateur, le VHA d'origine naturelle a été détecté dans six des six échantillons analysés, avec des valeurs de concentration allant de 3,27 x 101 à 1,80 x 102 GC/L, alors qu'un sur cinq échantillons prélevés et concentrés à Banghi (RCA) testés positif pour le VHA, à une concentration de 3,46 x 102 GC/L (tableau 5).
MS2, ajouté à tous les échantillons testés comme contrôle interne des processus, a été détecté dans tous les échantillons testés, ce qui montre que la méthode a été correctement effectuée de la concentration à la détection.
Figure 1 : Méthode VirWaTest. Aperçu des étapes de la méthode VirWaTest est composé de. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Matériaux | concentration | Extraction d'acide nucléique | découverte |
| équipement | Magnetic Stirrer (2 Unités) Batterie (2 Unités) Connexions batterie/Stirrer (2 unités) Adaptateurs de puissance (2 unités) Soutien au seau (2 unités) Corde (1 Unité) Aimant en remuant (3 unités) Pinceà d'œil (1 unité) Silicon Tubing (1 Unité) Pipette Controller (1 Unité) Marqueur (1 Unité) |
Pipette magnétique (1 unité) Plateforme solaire Rotary (1 unité) Rack de tube multi-taille (1 unité) Minuterie (1 Unité) |
Thermocycler (1 Unité) Batterie (1 Unité) ordinateur Tube Rack (1 Unité) 0,5 L - 10 L Micropipette (1 Unité) 2 L - 20 L Micropipette (1 Unité) |
| Consommables et réactifs (pour chaque 2 échantillons d'eau/répliques) | Seau (3 Unités) Bandes d'indicateurs de pH Pipette de 10 ml (2 unités) Open-Tip 10 ml Pipette (2 Unités) Pipette de 50 ml (2 unités) Pipette de 100 ml (2 unités) Pasteur Pipette (4 unités) Sac en plastique Stand-Up (4 unités) Récipient en plastique avec 25 ml d'eau distillée (1 unité) Récipient en plastique avec 50 ml d'eau distillée (1 unité) Conteneur vide de 100 ml (1 unité) Gants (6 paires) Contrôle des processus (2 tubes) Tube avec 10 ml d'eau distillée (2 unités) Acide citrique (1 tube) Hydroxyde de sodium (1 tube) Lait écrémé (1 tube) Sachet d'acide citrique (1 unité) Eau distillée (1 500 ml Bouteille) Conditionnement de l'échantillon (2 Sachets) Solution de conservation (2 tubes) Agent neutralisant (4 Sachets) |
Conseils magnétiques Pipette (2 unités) Pasteur Pipette (2 Unités) Tampon de liaison (2 tubes) Tampon de lavage 1 (2 tubes) Tampon de lavage 2 (2 tubes) Tampon de lavage 3 (2 tubes) Elution Buffer (2 Tubes) Gants (6 paires) |
10 L Micropipette Conseils (1 boîte) 20 Conseils Micropipette L (1 boîte) Mix QPCR D'ADN (1 tube) ARN qPCR Mix (1 Tube) Enzyme de Transcriptase inverse (1 Tube) Eau de biologie moléculaire (1 Tube) Bande de tube de HAdV avec amorces, sonde et norme (1 unité) MS2 Tube Strip avec amorces, sonde et standard (1 Unité) Démaquillant d'acide nucléique Gants (6 paires) |
Tableau 1 : Contenu VirwaTest. Équipement, consommables et réactifs qui doivent être préparés pour la concentration, l'extraction et la détection des virus dans deux échantillons d'eau/répliques.
| virus | Amorces | Genbank Accession No. | position | Séquence (5'u20123') | longueur | référence | ||
| Adenovirus humain (HAdV) | Adf | J01917.1 | en 18869-u201218887 | CWTACATGCACATCKCSGG | 19 ans, états-unis qui | Hernroth et coll., 200215 | ||
| Adr | en 18919-u201218937 | CRCGGGCRAAYTGCACCAG | 19 ans, états-unis qui | |||||
| AdP1 Annonces | en 18890-u201218916 | 6-FAM-CCGGGCTCAGGTACTCCGAGGCGTCCT-BMN-Q535 | 27 Annonces | |||||
| Bactériophage MS2 (MS2) | pecson-2F | NC-001417.2 | 344-u2012363 | AAGGTGCCTACAAGCGAGAAGT | 20 Ans, états-unis | Pecson et coll., 200916 | ||
| pecson-2R | 659-u2012678 | TTCGTTTAGGGCAAGGTAGC TTCGTTTAGGGCAAGGTAGC TTCGTTTAGGGCAAGGTAGC | 20 Ans, états-unis | |||||
| PecP-2 (PecP-2) | 369-u2012388 | 6-FAM-ATCGTGGGGTCGCCCGTACG-BHQ-1 | 20 Ans, états-unis | |||||
Tableau 2 : Oligonucleotides pour les expériences quantitatives de PCR. Amorces et sonde conçues pour se lier aux séquences d'acide nucléique de HAdV et MS2.
| température | temps | Cycles | température | temps | Cycles |
| 95 oC | 12 min | 1 Fois | 55 oC | 15 min | 1 Fois |
| 95 oC | 10 min | 1 Fois | |||
| 95 oC | 15 s | 40 ans, états-unis ( | 95 oC | 15 s | 40 ans, états-unis ( |
| 60 oC | 1 min | 60 oC | 1 min |
Tableau 3 : Conditions thermiques pour les expériences quantitatives de PCR. Température, temps et cycles utilisés pour l'amplification du VHA et du MS2.
| Qiagen | Virwatest VirwaTest | Qiagen | Virwatest VirwaTest | ||
| médiane | 2,53 x 103 | 2,43 x 103 | 4,74 x 104 | 5,13 x 104 | |
| signifier | 1,74 x 104 | 3,12 x 104 | 4,24 x 104 | 5,97 x 104 | |
| Sd | 5,66 x 105 | 2,23 x 106 | 4,49 x 104 | 1,63 x 105 | |
| p-valeur (Wilcoxon) pour HAdV: 0.0005569 | |||||
| p-valeur (Wilcoxon) pour MS2: 0.02791 | |||||
| Virus testé | Échantillons testés | Qiagen | Test Virwa | ||
| HAdv HAdv | 33 Ans, états-unis ( | 10 Ans et plus | 23 Ans, états-unis | ||
| MS2 (en) | 33 Ans, états-unis ( | 10 Ans et plus | 23 Ans, états-unis | ||
Tableau 4 : Développement de l'extraction d'acide nucléique VirWaTest. Valeurs médianes, moyennes et DD obtenues en comparant les méthodes d'extraction de Qiagen et virWaTest dans 33 échantillons d'eau souterraine pour le VHA et le MS2.
| pays | site | échantillon | HAdV GC/L |
| Rca | Eau de la SODECA | 1 Fois | Nd |
| Ile Bongossoua, Village 1 | 2 (en) | Nd | |
| Ile Bongossoua, Village 3 | 3 (en) | Nd | |
| Bangui, Quartier Fondo | 4 ( en plus) | Nd | |
| Bangui, Quartier Yambassa | 5 Annonces | 3,64 x 102 | |
| Équateur | Trou de forage A | 6 Annonces | 7,96 x 101 |
| Trou de forage B | 7 Annonces | 1,80 x 102 | |
| Trou de forage C | 8 Annonces | 8,88 x 101 | |
| Eau de puits A | 9 (en) | 6,06 x 101 | |
| Puits d'eau B | 10 Ans et plus | 1,12 x 102 | |
| Puits d'eau C | 11 Ans, états-unis ( | 3,27 x 101 |
Tableau 5 : Quantification du VHA à l'aide de la méthode VirWaTest. Résultats quantitatifs de PCR, exprimés en GC/litre, pour le VhA quantifié dans les échantillons d'eau prélevés et concentrés à partir de RCA et de l'Équateur.
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Discussion
La méthode VirWaTest permet la concentration de virus et l'extraction d'acide nucléique à partir d'échantillons d'eau au point d'utilisation par des utilisateurs non expérimentés. Il s'agit d'un protocole abordable, rapide et simple. La concentration est basée sur le principe de la flocculation organique à l'aide de lait écrémé, par lequel le pH faible et les conditions de conductivité élevée font des protéines de lait écrémés agréger en flocs les virus adsorb à. Lorsque les flocs se sédimentent, il est facile de les recueillir, ce qui permet de concentrer 10 L d'eau, alors que l'ultracentrifugation traditionnelle ne peut pas faire face à de gros volumes d'eau.
La méthode a été modifiée pour être praticable au point d'échantillonnage sans utiliser d'équipement électrique à l'exception d'un agitateur magnétique à piles. D'autres approches basées sur la filtration de l'eau ont été adaptées à la concentration de virus et peuvent également être réalisées au point d'utilisation. Cependant, les matériaux suspendus présents dans les échantillons d'eau obstruent souvent les filtres; ainsi, le petit volume qui peut être concentré avec ces systèmes est une limitation sérieuse.
Il s'agit de la première description d'une méthode de concentration des virus à partir d'échantillons d'eau au point d'utilisation, quelle que soit la turbidité de l'échantillon. La méthode de concentration VirWaTest permet de traiter plusieurs échantillons simultanément si le matériel approprié est disponible. En outre, la flocculation de lait écrémé s'est avérée utile pour la concentration de bactéries et de parasites19.
La préparation du matériel approprié est cruciale pour l'exécution correcte de la procédure. Considérez le nombre d'échantillons d'eau à analyser et préparez les réactifs et le matériel avant de se déplacer à l'endroit où le test est nécessaire pour la préparation des réactifs et du matériel. Plusieurs échantillons peuvent être traités en même temps si la quantité appropriée de matériel est disponible.
Avant de commencer la concentration d'un échantillon d'eau, une concentration connue d'un stock viral sera utilisée pour piquer l'échantillon comme contrôle de processus. Cette méthode utilise un bouillon viral séché qui est réhydraté avec de l'eau distillée avant d'être ajouté à l'échantillon d'eau au point d'utilisation. Ceci est utile pour exclure les résultats faux-négatifs à la fin de la procédure et donne une indication de la performance de la méthode.
Les concentrés viraux obtenus avec le VirWaTest peuvent être testés sur le terrain en appliquant les méthodes d'extraction et de détection de l'acide nucléique VirWaTest ou, alternativement, des concentrés peuvent être envoyés à un laboratoire de référence à température ambiante. La solution de conservation ajoutée au concentré permet aux virus de rester stables jusqu'à 2 semaines (résultats non publiés).
L'extraction d'acide nucléique VirWaTest est une méthode à base de particules magnétiques. Il est facile et rapide et permet à plusieurs échantillons d'être traités en même temps et montre l'efficacité de récupération équivalente et encore meilleure que les méthodes actuellement utilisées pour les extractions d'acide nucléique viral. Les acides nucléiques peuvent être envoyés à des laboratoires de référence à température ambiante ou, si les utilisateurs sont confiants dans l'exécution de la détection moléculaire, un test quantitatif DE PCR peut être effectué au point d'utilisation de l'échantillon d'eau original.
En outre, si une petite installation de laboratoire est disponible, le protocole de concentration VirWaTest peut être couplé à des kits standard d'extraction d'acide nucléique qui dépendent d'une centrifugeuse et des méthodes standard basées sur pcR qui nécessitent un congélateur pour maintenir les réactifs, mais qui utilisent thermocycles standard, qui sont moins chers que ceux à piles.
Cependant, comme une alimentation n'est parfois pas disponible, nous avons optimisé les tests de détection pour les bactériophages MS2 comme contrôle des processus et hAdV comme indicateur fécal viral, et la méthodologie peut être personnalisée pour tout autre virus d'intérêt, comme l'hépatite virus, RoV, NoV, ou d'autres, à exécuter sur le terrain sans avoir besoin d'un congélateur pour l'entretien des réactifs, ni thermocycles conventionnels, mais seulement un batterie. Plusieurs thermocycles à piles sont disponibles dans le commerce. Alternativement, si une alimentation est disponible, d'autres équipements qPCR conventionnels peuvent être utilisés. Si un thermocycleur à huit tubes est utilisé, jusqu'à deux extractions d'acide nucléique (deux échantillons différents ou deux répliques du même échantillon) peuvent être testées dans le même test de PCR. Pour chaque extraction d'acide nucléique, deux quantités différentes seront testées pour exclure l'inhibition enzymatique provenant de l'échantillon. L'adaptation est basée sur la préparation précédente de tubes PCR par des amorces sèche-air, des sondes et des suspensions standard. Plusieurs solutions commerciales lyophilisées qPCR existent qui pourraient être utilisées en appliquant la même procédure que décrite ici. Nous avons décrit une possibilité que nous considérions comme facile à réaliser.
Les analyses comparatives effectuées au cours du développement de la méthode ont montré que les méthodes virWaTest de concentration, d'extraction et de détection sont efficaces pour la quantification des virus dans les échantillons d'eau.
La limite de détection (LOD) de la procédure décrite est variable puisque le volume collecté après concentration est variable. En outre, le LOD peut être légèrement différent pour différents virus. Si un volume d'environ 10 L est recueilli, le LOD pour le VHA serait d'environ 1 x 102 GC/L viral. Ainsi, des concentrations relativement faibles de HAdV peuvent être détectées par la méthode VirWaTest. À Pedernales (Équateur), six des six échantillons testés présentaient le VHA, dans des concentrations proches du LOD, allant de 3,27 x 101 à 1,80 x 102 GC/L. À Banghi (RCA), le VHA a été détecté dans un des cinq échantillons analysés, à une concentration de 3,46 x 102 GC/L. La présence de HAdV, ainsi que la présence de MS2 comme processus de contrôle dans les échantillons testés, montre que la méthode est utile pour la récupération des particules virales à partir d'échantillons d'eau, même lorsqu'elle est effectuée par des utilisateurs non expérimentés.
Les commentaires obtenus jusqu'à présent indiquent que la concentration virale est une procédure facile à effectuer, sans problèmes majeurs lorsqu'ils sont appliqués au point d'utilisation des échantillons, bien que 8 h et 5 h étapes sont nécessaires. Il est important de noter que ces étapes se produisent sans aucune aide humaine. En outre, une méthode plus rapide basée sur la filtration est en cours de développement comme une alternative pour les eaux non turpées. Cependant, la flocculation semble être, jusqu'à présent, la méthode unique qui permet la concentration d'échantillons présentant une forte turbidité. Les concentrés viraux peuvent ensuite être envoyés à n'importe quel laboratoire du monde entier à température ambiante, ce qui facilite également l'essai des virus puisque les zones d'échantillonnage ne disposent pas toujours de bons services de transport offrant des conditions de refroidissement. Alternativement, les protocoles d'extraction et de détection présentés ici permettent de tester la détection virale au point d'utilisation des échantillons.
Pour autant que nous sachions, c'est la première méthode signalée pour être utile pour la concentration et l'essai de la présence de virus dans les échantillons d'eau dans le champ. D'autres efforts devraient être déployés pour appliquer la procédure à l'évaluation de la présence d'agents pathogènes viraux humains d'intérêt dans plusieurs autres scénarios de crise humanitaire. En outre, la rétroaction de l'utilisateur sera nécessaire pour fournir un aperçu de la mise en œuvre potentielle pour rendre la procédure plus conviviale.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
VirWaTest était un projet de recherche financé par le programme HIF (Fonds humanitaire d'innovation) de l'ELHRA (Améliorer l'apprentissage et la recherche pour l'aide humanitaire). Les auteurs reconnaissent les équipes wash qui ont gentiment collaboré à cette étude. L'analyse des échantillons en Equateur a été financée par Oxfam Equateur et Direccion de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT.17.01). S. Bofill-Mas est boursier Serra-Hunter à l'Université de Barcelone.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | - | - | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
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