Injection intrathoracique pour l’étude du coeur de zebrafish adulte

Parmi les vertébrés, le zébrafish possède une capacité remarquable à régénérer son cœur^1,2. Cette aptitude a été rapportée dans plusieurs modèles de blessure, à savoir la résection ventriculaire de l’apex, la lésion cryogénique (ci) et l’ablation des cardiomyocytes génétiques^3,4,5,6,7. Après des lésions invasives, la paroi endommagée du ventricule se guérit de façon transitoire par le tissu fibrotique, qui est progressivement remplacé par un nouveau myocarde^8,9,10,11. La réaction de guérison des plaies précoces implique l’activation de l’épicardium et le recrutement des cellules immunitaires^12,13,14,15. En concomitance, les cardiomyocytes à proximité du myocarde blessé deviennent activés, dédifférencient, multiplient et remplacent progressivement la zone blessée dans les 30 − 90 jours¹⁶,¹⁷,^{18, 19}. des progrès substantiels ont été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires et cellulaires de la régénération cardiaque grâce à la disponibilité d’outils génétiques, tels que l’analyse du traçage des lignées cellulaires, la surexpression des gènes inductibles, lignées de reporter de tissus fluorescents, et mutagenèse de gène crispr/Cas9^20,21.

Nous avons récemment établi un modèle de préconditionnement cardiaque chez l’adulte poisson zèbre par thorotomie^22,23. Le préconditionnement augmente l’expression des gènes cardioprotecteurs et élève la rentrée dans le cycle cellulaire dans les cœurs intacts et régénérantes. Ces processus sont associés au recrutement de cellules immunitaires et de remodelage matriciel^22,24. Les mécanismes de préconditionnement sont mal compris, et l’établissement de nouvelles techniques est nécessaire pour favoriser ce domaine de recherche. En particulier, l’administration optimisée de protéines de signalisation sécrétées ou d’autres composés chimiques est essentielle pour approfondir ce sujet.

Étant des animaux aquatiques, le zébrafish peut naturellement absorber diverses substances dissoutes dans l’eau par leurs branles et leur peau. Ceci offre une possibilité pour la délivrance non invasive de médicaments par immersion de poissons dans des solutions avec divers produits chimiques, tels que les inhibiteurs pharmacologiques, les hormones stéroïdiennes, le tamoxifène, le BrdU et les antibiotiques. En effet, de nombreuses études de divers laboratoires, y compris les nôtres^25,26,27, ont profité de cette méthode, qui est particulièrement précieuse dans le domaine de la biologie régénérative^{6, 28}. cette approche n’est cependant pas appropriée pour la délivrance de peptides, d’ADN, d’ARN, de les morpholinos ou de molécules ayant une perméabilité tissulaire limitée. Dans ces cas, une livraison plus efficace est obtenue par microinjection dans le corps, par exemple, en insérant le capillaire dans le sinus veineux rétro-orbital, dans la cavité intrapéritonéale ou intrapéricardiques^29,30, au ³¹. Ici, nous décrivons une procédure d’injection intrathoracique d’une petite quantité de solution, comme une méthode appropriée pour étudier la régénération cardiaque et le préconditionnement chez les adultes de zébrafish.

Les soins aux animaux et toutes les procédures animales décrites dans le protocole suivant ont été approuvés par l’Office vétérinaire cantonal de Fribourg (Suisse).

1. outils et solutions pour les injections

1. Tirez les capillaires en verre borosilicate adaptés à la microinjection à l’aide d’un extracteur d’aiguilles selon la figure 1a. Conserver les capillaires tirés dans une boîte de Petri de 9 cm avec des rails d’argile à modeler ou de ruban adhésif.
2. En utilisant des ciseaux communs, coupez un morceau d’éponge (7 cm x 3 cm x 1 cm) et Sculptez une silhouette semblable à celle du poisson au milieu.
3. Préparez de petites aliquotes de solution injectable avec les protéines testées ou d’autres composés. Ajustez leur concentration de façon dépendante sur le dosage en diluant la substance dans une solution de sel équilibrée de Hanks (HBSS) complétée par 10% de phénol rouge.
   Remarque: Ici, la concentration de la protéine testée était de 100 ng/mL.
4. Pour préparer une solution de stock d’anesthésiques tricaïques tamponnés, dissoudre 4 g de tricaïne dans 980 mL d’eau distillée. Ajuster le pH à 7,0 − 7,4 à l’aide de 1 M de Tris-HCl pH 9 et remplir d’eau à 1 000 mL. Conserver la solution dans l’obscurité à 4 ° c.
5. Pour obtenir la concentration de travail des anesthésiques, ajouter 1 − 2 mL de solution de stock de tricaïne dans 50 mL d’eau de poisson dans un bécher.
   Remarque: La concentration de travail des anesthésiques tricaïque doit être préparée fraîchement avant utilisation.

2. préparation de la station d’injection

1. Allumez le stéréomicroscope avec la lumière du haut et ajustez le grossissement à 16x.
2. Imbibez l’éponge d’eau de poisson, placez-la sur une boîte de Petri de 9 cm au microscope et ajustez la mise au point.
3. Sous le stéréomicroscope, couper l’extrémité d’un microcapillaire à ~ 7 mm de la base à l’aide d’une iridectomie ciseaux comme illustré à la figure 1a. Le diamètre de pointe idéal serait ~ 20 μM.
   Remarque: Couper la pointe du capillaire d’une manière oblique est optimal pour les insertions dans le tissu.
4. Insérez le microcapillaire dans le porte-aiguille de l’appareil de micro-injecteur.
5. En utilisant des embouts de microchargeur, chargez une solution de contrôle (par exemple, 1x HBSS) pour mettre en place la pression d’injection, afin d’obtenir le débit approprié variant entre 0,3 μL/s et 0,5 μL/s. Videz l’aiguille.
6. Chargez le volume sélectionné de la solution d’injection (p. ex., facteur neurotrophique ciliaire [CNTF] dilué dans 1x HBSS) dans la pointe du capillaire (figure 1b). Il ne devrait pas y avoir de bulle d’air dans le capillaire.
   Remarque: Le volume maximal de la solution d’injection dépend de la taille du poisson. Pour une longueur standard de 2,5 − 3 cm (distance entre le museau et le pédoncule caudale), le volume maximal d’injection qui prévient le gonflement et le saignement thoraciques EXESSIFS a été déterminé à 5 μL (figure 1F). Des volumes plus importants pourraient être injectés à des poissons plus gros.

3. préparation du poisson pour l’injection intrathoracique

1. Attraper un poisson zèbre adulte (Danio rerio) avec un filet et le transférer dans la solution anesthésique.
2. Après 1 − 2 min, lorsque le poisson cesse de nager et que le mouvement de l’opercule est réduit, touchez le poisson avec une cuillère en plastique pour vous assurer qu’il ne réagit pas à tout contact.
3. Transférez rapidement et soigneusement le poisson avec la cuillère dans la rainure de l’éponge mouillée, avec le côté ventrale vers le haut. La tête du poisson doit pointer loin de la main dominante de l’opérateur.

4. microinjection dans le péricarde

1. Sous le stéréomicroscope, observez attentivement le mouvement du cœur battant sous la peau du poisson. Déterminer visuellement le point d’injection au-dessus du cœur battant et au milieu du triangle défini par les plaques cartilagineuses ventrales (figure 1d). Insérer la pointe du capillaire à un angle de 30 − 45 ° par rapport à l’axe du corps (figure 1e). Pénétrer doucement la peau avec la pointe du microcapillaire dans le péricarde (figure 1c). Un point d’entrée optimal est plus proche de l’abdomen que de la tête.
   Remarque: Ne pas insérer le capillaire trop profondément dans le corps et le cœur, car cela causera des blessures à l’organe. En cas de perforation cardiaque, l’aiguille se remplit généralement de sang. Si cela se produit, enlevez le capillaire et excluez le poisson de l’expérience.
2. Une fois que l’aiguille est à l’intérieur du péricarde, l’injection complète en appuyant sur la pédale du dispositif de micro-injecteur.
   Remarque: Veillez à ne pas injecter d’air dans la cavité thoracique.
3. Après l’injection, retirer délicatement le capillaire du thorax et transférer immédiatement le poisson dans un réservoir avec de l’eau du système pour la récupération.
4. Surveillez le poisson jusqu’à la récupération totale de l’anesthésie.
5. Recueillir le cœur au point de temps désiré et le préparer pour une analyse plus approfondie.
   Remarque: Dans le cas où le poisson ne reprend pas le mouvement de l’opercule dans les 30 s, Réanimez le poisson en serrant l’eau dans les branches avec une pipette en plastique.

Après des injections intrathoraciques (TI), les effets de la solution exogène peuvent être analysés. À cette fin, les poissons devraient être euthanasiés et les coeurs recueillis, fixés et traités histologiquement, selon les protocoles publiés antérieurement32,33.

Pour valider la méthode, nous avons d’abord effectué deux expériences de test en injectant de la couleur et des colorants fluorescents. Premièrement, nous avons euthanasié du poisson et post-mortem injecté 3 μL d’encre dans le thorax. Les coeurs ont été recueillis après 5 min, lavés dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), fixées en formol à 2%, lavées en PBS et photographiées sous le microscope. Deuxièmement, nous avons injecté 3 μL de 1 μg/mL de 4 ′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) in vivo, et fixé le cœur après 2 h. Dans les deux essais, l’analyse de la monture entière a révélé l’étiquetage de tout le cœur, y compris le ventricule, l’atrium et le Bulbus artériel (figure 2a, B). Ces résultats révèlent une propagation efficace de la solution injectée sur la surface du cœur.

Un protocole commun pour la délivrance de substances exogènes dans le poisson adulte est l’injection intrapéritonéale (IP). Pour comparer la pertinence de l’IT par rapport aux injections IP pour les études cardiaques, nous avons injecté une quantité similaire de DAPI en utilisant les deux méthodes et fixé les coeurs après 5 min et 120 min (figure 3A). Les coeurs ont été sectionnés et colorés avec phalloïdine Alexa Fluor (AF) 568 que les étiquettes F-actine dans le muscle cardiaque. Aucune cellule positive de DAPI n’a été observée dans les coeurs après l’injection IP aux deux points de temps (figure 3b). En revanche, l’injection de TI a entraîné la présence de noyaux marqués DAPI dans le myocarde (figure 3b). Ces résultats démontrent que l’injection de TI a amélioré la distribution du composé au cœur, par rapport à l’injection IP.

Pour tester la pertinence de cette méthode pour les études de régénération cardiaque, nous avons cryoblessé les ventricules8et effectué des injections de 3 μl de 1 μg/ml de DAPI et 1 μg/ml de phalloïdine AF649 à 3 et 7 jours après la cryolésion (dpci) (figure 4a). À 1 h après l’injection, les coeurs ont été recueillis, fixés, sectionnés et colorés avec de la phalloidine AF568 pour visualiser le myocarde intact. Nous avons constaté que le myocarde et le tissu blessé contenaient de nombreuses cellules positives de DAPI, ce qui indique une pénétration efficace de ce colorant dans le cœur intact et le tissu fibrotique (figure 4b). En outre, la phalloïdine injectée AF649 a également été incorporée par les cardiomyocytes de la zone péri-lésion et quelques fibroblastes recrutés dans la zone blessée. Cette expérience révèle que les médicaments peuvent traverser l’épicardium et pénétrer dans le myocarde sous-jacent.

Après avoir testé l’efficacité des injections informatiques à l’aide de colorants, nous avons analysé les effets des protéines injectées sur le cœur. Nous avons synthétisé une cytokine, appelée CNTF, qui est uprégulée après la thorotomie24. Nous avons étudié les effets du CNTF exogène sur divers procédés, à savoir la prolifération des cardiomyocytes, le dépôt matriciel extracellulaire, le recrutement de cellules immunitaires et l’expression des gènes cardioprotecteurs. Nous avons constaté que tous ces aspects biologiques ont été activés par l’injection de CNTF par l’IT, comparativement aux immunoglobulines de contrôle (figure 5)24. Ces résultats démontrent que la méthode d’injection intrathoracique fournit une stratégie appropriée pour l’administration ciblée de protéines pour étudier leurs effets sur des tissus cardiaques distincts dans une variété d’essais.

Figure 1: injection Intrathorascique (IT) chez le zébrafish adulte. (A) photographie d’un capillaire à microinjection tirée avec filament (6 ", 1,0 mm de diamètre) et valeurs du programme d’extracteur d’aiguilles utilisé. (B) photographie d’un capillaire à microinjection tirée avec un filament (6 ", 1,0 mm de diamètre) rempli de 2,5 μl de solution contenant 10% de phénol rouge. La pointe tirée de l’aiguille est d’une longueur maximale de 7 mm. C) Représentation schématique de la procédure d’injection de TI. (D) photographies de la procédure d’injection de TI. Ce chiffre a été modifié de bise et coll.24. Les nombres dans les panneaux C et D correspondent aux mêmes étapes de la procédure: (1) le poisson est placé côté ventrale vers le haut sur une éponge humidifiée. Le site de ponction (point rouge dans le triangle) est situé au centre de la poitrine près des branlades. (2) pénétration de l’aiguille dans le péricarde. Le point rouge indique le site de ponction. (3) l’injection est surveillée en observant la propagation de la solution rouge dans la cavité périardiale. (E) schéma de l’injection. L’angle entre le capillaire d’injection et l’axe du corps doit être compris entre 30 ° et 45 ° pour éviter la perforation du cœur. F) photographies de thorax de poissons à 1 heure après l’injection de volumes indiqués. Les flèches blanches pointent vers le tissu replat, ce qui pourrait indiquer une hémorragie interne. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: les solutions injectées par l’informatique se propagent presque uniformément sur la surface du cœur. (A) images stéréomicroscope de coeurs entiers de poissons soumis à une injection de TI post-mortem avec 2,5 ΜL de HBSS ou 2,5 μl d’encre. L’encre A teinté la surface du ventricule (V), de l’Atrium (A) et du Bulbus artériel (BA). Barre d’échelle = 300 μm. (B) images stéréomicroscope à champ lumineux et fluorescents de coeurs entiers de poissons soumis à l’injection de TI avec HBSS et 3 μl de 1 μg/ml de DAPI. La fluorescence DAPI est détectée sur les parties cardiaques peu après l’injection de TI. Barre d’échelle = 300 μm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3: Comparaison de deux méthodes d’injection pour la livraison de DAPI au cœur. A) schéma de la conception expérimentale. Des injections intrapéritonéales (IP) et Intrathorasciques (TI) ont été effectuées avec la même quantité de 1 μg/mL de DAPI (3 μL). Les coeurs ont été recueillis à 5 et 120 min après l’injection. (B) des images de microscopie confocale de sections cardiaques colorées avec de la phalloidine fluorescente (rouge) qui étiquette abondamment les fibres musculaires. Le DAPI injecté a été visualisé dans le canal approprié affiché en vert. Après l’injection IP, DAPI n’est pas détecté dans le cœur à tout moment. Après l’injection d’IT, les cellules positives de DAPI sont présentes dans le ventricule après les deux points de temps. Barre d’échelle = 500 μm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4: injection de TI pour étudier la régénération cardiaque. A) schéma de la conception expérimentale. À 3 et 7 jours après la cryolésion, un mélange de DAPI et de phalloïdine AF649 a été injecté par l’IT (3 μl de 1 μg/ml). Les coeurs ont été recueillis 1 heure après l’injection de TI, fixe, sectionné et teinté avec phalloïdine AF568 (rouge). B) des images de microscopie confocale de sections cardiaques longitudinales à 3 et 7 dpci. Cellules d’étiquetage DAPI (vertes) et phalloïdine AF649 (bleues) injectées de la zone lésée (délimitée par une ligne pointillée blanche) et du myocarde intact (coloration rouge). Les flèches blanches pointent vers la distribution de DAPI (vert) à travers des myocardies compactes et trabeculées intactes et l’épicardium. Barre d’échelle = 500 μm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5: le CNTF injecté par l’IT exogène stimule plusieurs processus biologiques dans le cœur. A) schéma de la conception expérimentale. Premièrement, 2,5 μL d’une solution contenant 250 ng de CNTF de zébrafish ou d’immunoglobulines de contrôle (hIgG) a été injecté dans le péricarde de poissons transgéniques exprimant des DsRed2 nucléaires dans les cardiomyocytes. Les coeurs ont été recueillis à 7 et 1 jours après l’injection (dpi) et analysés par immunofluorescence et hybridation in situ, respectivement. (B-D) Images de microscopie confocale de sections ventriculaires de contrôle et de coeurs injectés par le CNTF. (B) l’immunostation contre un marqueur de cycle cellulaire, composant complexe d’entretien des minichromosomes 5 (MCM5; vert), révèle un nombre plus élevé de cardiomyocytes proliférants en réponse à un CNTF exogène. Barre d’échelle = 500 μm. (C) immunostaining contre le collagène XII montre une augmentation du dépôt de collagène XII dans le myocarde après l’injection de CNTF. Dans le coeur de contrôle, le collagène XII est confiné à l’épicardium34. Barre d’échelle = 500 μm. (D) immunostaining contre un marqueur de cellules immunitaires, L-plastine, détecte un recrutement accru de cellules immunitaires dans le poisson injecté par le CNTF. Barre d’échelle = 500 μm. (E) les images du microscope à champ lumineux des sections transversales ventriculaires après hybridation in situ à l’aide d’une sonde d’ARNm antisens contre la cystatine, un facteur cardioprotecteur, affichent une uprégulation transcriptionnelle de ce gène dans le cœur des poissons injectés par le CNTF. Barre d’échelle = 500 μm. Ce chiffre a été modifié de bise et coll.24. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.