Summary
Descritto qui è un metodo semplice per la purificazione di un prodotto genetico in Streptococcus mutans. Questa tecnica può essere vantaggiosa nella purificazione delle proteine, in particolare le proteine della membrana e le proteine ad alta massa molecolare, e può essere utilizzata con varie altre specie batteriche.
Abstract
La chiarificazione della funzione di un gene comporta in genere il confronto dei tratti fenotipici dei ceppi e dei ceppi di tipo selvaggio in cui il gene di interesse è stato interrotto. La perdita di funzione dopo l'interruzione genica viene successivamente ripristinata mediante l'aggiunta esogena del prodotto del gene interrotto. Questo aiuta a determinare la funzione del gene. Un metodo descritto in precedenza comporta la generazione di un ceppo Streptococcus mutans interrotto dal gene gtfC. Qui, viene descritto un metodo poco impegnativo per purificare il prodotto genico gtfC dal ceppo S. mutans appena generato dopo la rottura genica. Si tratta dell'aggiunta di una sequenza di codifica della polihistidina alla fine del gene di interesse, che consente una semplice purificazione del prodotto genetico utilizzando la cromatografia dell'affinità metallica immobilizzata. Non sono necessarie reazioni enzimatiche diverse da PCR per la modificazione genetica in questo metodo. Il ripristino del prodotto genetico mediante aggiunta esogena dopo la perturbazione genica è un metodo efficace per determinare la funzione genica, che può anche essere adattata a diverse specie.
Introduction
L'analisi della funzione di un gene di solito comporta il confronto dei tratti fenotipici dei ceppi di tipo selvaggio ai ceppi in cui il gene di interesse è stato interrotto. Una volta prodotto il ceppo dirompente genico, l'aggiunta esogena del prodotto genetico consente il ripristino funzionale.
Il metodo più comune per ottenere i prodotti genici purificati necessari per il successivo restauro è eseguendo un'espressione eterologa in Escherichia coli1. Tuttavia, l'espressione di proteine della membrana o di proteine di massa molecolari elevate è spesso difficile da usare in questo sistema1. In questi casi, la proteina bersaglio è solitamente isolata dalle cellule che sintetizzano nativamente la proteina attraverso una complessa serie di passaggi, che possono portare alla perdita del prodotto genetico. Per superare questi problemi, è stata sviluppata una semplice procedura per la purificazione del prodotto genico a seguito di un metodo di interruzione genica2, del metodo di giunzione del DNA basato su PCR3 (PCR di fusione in due fasi) e dell'elettroporazione per la genetica trasformazione in Streptococcus mutans. L'aggiunta di un tag polihisinoso (His-tag) al capo-terminus del prodotto genetico ne facilita la purificazione mediante cromatografia di affinità metallica immobilizzata (IMAC).
Per isolare il ceppo che esprime tag His, l'intero DNA genomico del gene di interesse (in questo ceppo disgregazione genica che esprime i suoi tag) viene sostituito da un gene marcatore resistente agli antibiotici. La procedura per generare la varietà His-tag-expressing è quasi identica a quella per generare un ceppo genico-interrotto come descritto in precedenza4,5. Pertanto, i metodi per la perturbazione genica e l'isolamento del prodotto genico dovrebbero essere eseguiti come esperimenti seriali per l'analisi funzionale.
Nel lavoro attuale, una sequenza di codifica della polihisina è collegata al gene gtfC (GenBank locus tag SMU_1005), codificando glucosyltransferase-SI (GTF-SI) in S. mutans6. Quindi, sono stati eseguiti studi di espressione in una specie streptococcale. Raggiungere l'espressione eteologa di gtfC da parte di E. coli è difficile, probabilmente a causa dell'alta massa molecolare di GTF-SI. Questo ceppo si chiama S. mutans His-gtfC. Un'illustrazione schematica raffigurante l'organizzazione della cassetta del gene gtfC e della spettromica (spcr)7 loci in Wild-type S. mutans (S. mutans WT) e i suoi derivati è mostrato in Figura 1. Il GTF-SI è una proteina secretoria che contribuisce allo sviluppo del biofilm dentale cariogenico6. Sotto la presenza di saccarosio, un biofilm aderente è osservato su una superficie di vetro liscia in WT S. mutans ceppo ma non nella deformazione S. mutans gtfC-interrotto (S. mutans -gtfC)2,5 . La formazione di biofilm viene ripristinata in S. mutans gt -fC dopo l'aggiunta esogena del ricombinante GTF-SI. Il ceppo, S. mutans His-gtfC, viene quindi utilizzato per produrre il ricombinante GTF-SI.
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Protocol
NOT: Generazione di S. mutans -gtfC, in cui l'intera area di codifica del gene gtfC viene sostituita con spcr, deve essere completata prima di eseguire questi protocolli. Fare riferimento all'articolo pubblicato per informazioni dettagliate sulla generazione5.
1. Progettazione di Primer
-
Preparare primer per la costruzione di S. mutans His-gtfC.
NOT: Le sequenze di primer utilizzate in questo protocollo sono mostrate nella Tabella 1. Il metodo PCR di fusione in due fasi per la generazione di S. mutans His-gtfC è illustrato in modo schematico nella Figura 2.- Primer di progettazione (gtfC-reverse e spcr-forward) per l'attaccamento della sequenza di codifica His-tag, intervenendo tra il gene gtfC e spcr (Figura 2A).
- Includere linker GS e sequenza His-tag-coding in entrambi gtfC-reverse e spcr-forward primers, in cui 24 basi alle regioni 5' sono complementari tra loro.
NOTA: La sequenza degli amminoacidi del linker GS e His-tag (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His) è collegata al C-terminus di GTF-SI attraverso la traduzione genica. - Progettare un primer gtfC-forward per indirizzare il gene gtfC nel genoma S. mutans WT >1 kb a valle del gene e il primer spcr-reverse per indirizzare la regione di fianco a valle di spcr nel S. mutans -gtfC. Impostare la temperatura di fusione8 (Tm) del gtfC-forward and spcr-reverse primers in modo che corrispondano alle temperature di fusione del gtfC-reverse and spcr- primer in avanti, rispettivamente.
- Includere linker GS e sequenza His-tag-coding in entrambi gtfC-reverse e spcr-forward primers, in cui 24 basi alle regioni 5' sono complementari tra loro.
- Progettare i numeri primi annidati (nested-forward e nested-reverse) per la seconda PCR (Figura 2B).
- Primer di progettazione (gtfC-avanti e colonia-inversione) specifici per il DNA genomico del trasformativo (Figura 2C; i primer vengono utilizzati per la colonia PCR).
NOT: Gli amplificatori a cavallo del bordo tra gtfC e spcr. Il primer gtfC-forwardpuò essere applicato come primer in avanti. - Progettare primer (avanti e inbasso) per la conferma finale della generazione di S. mutans His-gtfC (Figura 2C; il prodotto PCR amplificato dai primer viene utilizzato per il sequenziamento del DNA).
- Primer di progettazione (gtfC-reverse e spcr-forward) per l'attaccamento della sequenza di codifica His-tag, intervenendo tra il gene gtfC e spcr (Figura 2A).
2. Estrazione del DNA genomico da S. mutans
NOT: Ogni ceppo S. mutans deve essere coltivato in mezzi di infusione del cuore cerebrale (BHI) a 37 gradi centigradi in condizioni anaerobiche. I ceppi mutanti di S. mutans -gtfC e S. mutans His-gtfC sono coltivati in BHI integrati con 100 spectinomycin s/mL.
- Streak S. mutans WT e S. mutans -gtfC separatamente su ciascuna delle piastre di agar BHI. Incubarli durante la notte a 37 .
- Scegli singole colonie di S. mutans WT o S. mutans -gtfC utilizzando uno stuzzicadenti sterilizzato e inoculare in 1,5 mL di brodo BHI. Incubarli durante la notte a 37 .
NOT: Le colonie possono essere utilizzate come fonte di DNA modello per la prima PCR (passaggio 3.1). - Trasferire 1 mL di ogni coltura batterica in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare la coltura per 1 min a 15.000 x g.
- Rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL del buffer Tris-EDTA (pH 8.0) per risospendere il pellet cellulare.
- Centrifugare la sospensione per 1 min a 15.000 x g. Togliete il super-acletterante. Risospendere il pellet cellulare in 50 : L di buffer Tris-EDTA (pH 8.0).
- Riscaldare la sospensione con un'incubatrice a blocchi per 5 minuti a 95 gradi centigradi. Centrifugare la sospensione per 5 min a 15.000 x g.
- Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 mL (il supernatante servirà come DNA modello per il primo PCR).
3. Amplificazione PCR
NOT: Le tabelle 1, tabella 2e 3 riepilogano rispettivamente i primir, i reagenti e i cicli di amplificazione PCR.
- Eseguire il primo PCR utilizzando il S. mutans WT e S. mutans -genoma gtfC come i modelli PCR. Amplificare le regioni che ospitano la parte a valle del gene gtfC e quelle che ospitano spcr utilizzando i primer descritti nel passaggio 1.1.1.2 (Figura 2A).
- Elettroforizzare ogni prodotto PCR su 1% gel di agarose. Accise i frammenti di DNA desiderati di circa 1.000 bp e 2.000 bp. Purificare i frammenti dai gel utilizzando il metodo di estrazione del gel a base di membrana di silice.
NOT: Le procedure di base per PCR9, elettroforesi gel di DNA10e purificazione del DNA11 sono dettagliate altrove. - Eseguire una seconda PCR utilizzando i prodotti del primo PCR (approssimativamente equimolar) come modelli PCR con le primer nested forward e nested-reverse (Figura 2B).
- Elettroforese un decimo della miscela PCR sul gel di agarose. Confermare la generazione dell'amplificatore appropriato di circa 3.000 bp.
-
Far precipitare il prodotto PCR rimanente.
NOTA: La purificazione del prodotto PCR non è necessaria, perché gli amplificatori non specifici generati dalla seconda PCR non interferiscono con la ricombinazione omologa.- Aggiungere acqua priva di nuclenonità alla miscela PCR e portare il volume totale a 100 gradi centigradi, seguito da 0,1 volume (10 M) di acetato di sodio da 3 M (pH 5,2) e 2,5 volumi (250 ) di etanolo assoluto. Mescolare e conservare la miscela per 10 min a temperatura ambiente (RT).
- Centrifugare il campione per 20 min a 15.000 x g a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Aggiungere 1 mL di 70% di etanolo per lavare il pellet di DNA.
- Centrifugare il campione per 5 min a 15.000 x g a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Asciugare all'aria e sciogliere il pellet di DNA con 10 gradi di acqua priva di nuclea.
4. Trasformazione delle celle
- Preparare l'competente S. mutans WT per introdurre il secondo prodotto PCR seguendo i passaggi descritti nella precedente pubblicazione5. Conservare le celle a -80 gradi centigradi.
NOT: Per questo esperimento, le cellule WT S. mutans competenti sono già state conservate in -80 gradi centigradi per generare S. mutans -gtfC. - Mescolare 5 l del secondo prodotto PCR concentrato al 50 -L aliquota di celle competenti ghiacciate congelate in precedenza. Aggiungere il composto in cuvette di elettroporazione. Dare un singolo impulso elettrico (1,8 kV, 2,5 ms, 600, 10 f) alle celle utilizzando l'apparato di elettroporazione.
- Risospendere le cellule in 500 . Immediatamente, stendete 10-100 gradi nidi delle sospensioni su piastre di agar BHI contenenti spettronomica. Incubare le piastre per 2-6 giorni a 37 gradi centigradi fino a quando le colonie non sono cresciute abbastanza per essere raccolte.
5. Verifica della ricombinazione e dell'immagazzinamento dell'enome G
- Esegui la colonia PCR, usando i primer gtfC-forward e colony-reverse per la ricombinazione. Elettroforizzare ogni costatunitense prodotto PCR su un gel di agarose. Confermare il frammento di DNA di circa 1.500 bp.
- Scegli una delle colonie positive usando uno stuzzicadenti sterilizzato e la sottocoltura le cellule durante la notte in 2 mL di brodo BHI contenente spettronomina.
- Mescolare 0,8 mL di coltura batterica con 0,8 mL di legalo sterile 50% e fare scorta a -80 o -20 gradi centigradi.
- Trasferire il rimanente 1 mL di sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Ripetere i passaggi da 2,3 a 2,7 per estrarre il DNA genomico dalle cellule.
- Esegui la PCR usando i primer up-forward e down-reverse e il DNA genomico come modello. Ripetere il passaggio 3.2 per purificare il prodotto di DNA amplificato dai gel.
- Determinare la sequenza del DNA dell'amplificatore purificato mediante il sequenziamento del DNA.
NOT: Assicurati di confermare la generazione di S. mutans His-gtfC dal sequenziamento del DNA.
6. Purificazione della GTF-SI con tag poliistino
- Streak S. mutans His-gtfC su una piastra di BHI agar contenente spettromicina. Incubarli durante la notte a 37 .
- Raccogliere una singola colonia utilizzando uno stuzzicadenti sterilizzato e cellule secondarie in 3 mL di brodo BHI. Incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi.
- Preparare due flaconi conici con 1 L di brodo BHI senza spettronomia. Inoculare 1 mL della sospensione della coltura notturna in 1 L del brodo BHI. Incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi.
- Concentrare le proteine della coltura supernatante dalla precipitazione solfato di ammonio.
NOTA: Estrarre dai corpi cellulari se una proteina bersaglio è intracellulare. Le procedure di base per le precipitazioni di solfato di ammonio sono descritte altrove12.- Centrifugare la sospensione della coltura batterica per 20 min a 10.000 x g a 4 gradi centigradi. Recuperare la coltura supernatant in un bicchiere di vetro 3L.
- Aggiungere 1.122 g di solfato di ammonio a 2 L del supernatante (80% di saturazione) con agitazione vigorosa utilizzando un agitatore magnetico. Lasciare che il precipitato si formi per 4 ore o più a 4 gradi centigradi con agitazione.
NOTA: La formazione precipitata può essere continuata durante la notte. - Centrifugare la soluzione di solfato di ammonio a 15.000 x g per 20 min a 4 gradi centigradi. Decant il super-natante.
- Raccogliere il precipitato con una spatola e trasferire in un bicchiere di vetro 200 mL. Risospendere i pellet in 35 mL di buffer di rilegatura (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 5 mM imidazole, pH 8.0).
- Dialisi la sospensione contro 2.500 mL del tampone di legame utilizzando un tubo di dialisi cellulosa rigenerato, a 4 gradi centigradi, con agitazione. Sostituire la soluzione di dialisi dopo 2 h e continuare la dialisi durante la notte.
- Sostituire nuovamente la soluzione di dialisi. Continuare a dialisire per altre 2 h.
- Centrifugare la sospensione diallym a 20.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Filtrare il supernatante attraverso un filtro a membrana utilizzando attrezzature di filtrazione di aspirazione. Trasferire il filtrato in un pallone da 75 cme 2.
- Frazionare il GTF-SI con etichettatura polihistista dalla sospensione filtrata dalla cromatografia di affinità metallica immobilizzata (IMAC).
- Trasferire 2 mL di liquami in resina Ni-charged IMAC (circa 1 mL di resina) in una colonna cromatografica il cui sbocco è montato su un tubo di silicone. Rimuovere la soluzione di stoccaggio dal flusso di gravità.
ATTENZIONE: Non lasciare asciugare la resina in tutto l'IMAC. - Aggiungere 3 mL di acqua distillata nella colonna per lavare la resina. Aggiungere 5 mL del buffer di rilegatura per equilibrare la resina.
- Spegnere il flusso con un cazzo di pizzico Hoffmann. Aggiungere 5 mL della sospensione filtrata dal passaggio 6.5 per creare il liquame.
- Aggiungere tutti i liquami alla sospensione filtrata rimanente. Swirl il composto delicatamente per 30 min a 4 gradi centigradi.
- Caricare nuovamente la miscela sulla colonna. Rimuovere la sospensione dal flusso di gravità. Lavare la resina IMAC con 20 mL di buffer di rilegatura.
NOT: Regolare la portata a circa 2 mL/min con un pizzico Hoffmann in tutto l'IMAC successivo. - Eluire il ricombinante GTF-SI con 20 mL del tampone di eluizione (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 8.0).
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. L'eluate deve essere conservato a 4 gradi centigradi. La resina IMAC può essere riutilizzata. Fare riferimento alle istruzioni per la resina IMAC.
- Trasferire 2 mL di liquami in resina Ni-charged IMAC (circa 1 mL di resina) in una colonna cromatografica il cui sbocco è montato su un tubo di silicone. Rimuovere la soluzione di stoccaggio dal flusso di gravità.
- Sostituire il buffer di elusione con il buffer di memorizzazione (buffer di fosfato da 50 mM, pH 6.5) e concentrare la soluzione GTF-SI ricombinante a circa 1 mL utilizzando un'unità di ultrafiltrazione centrifuga. Conservare la soluzione GTF-SI ricombinante a 4 gradi centigradi.
NOT: Confermare la purificazione GTF-SI con etichetta polihistide utilizzando SDS-PAGE13 e western blotting14 utilizzando un anticorpo monoclonale anti-polihisdano coniugato in zapsia di rafano. Aggiunta di CHAPS (concentrazione finale, 0,1%) all'eluente può essere richiesto per evitare l'adsorbimento non specifico all'unità, a seconda della proteina bersaglio.
7. Restauro funzionale di Recombinante GTF-SI
- Streak ogni S. mutanceppo su una piastra di agar BHI individualmente. Incubare le piastre durante la notte a 37 .
- Utilizzando uno stuzzicadenti sterilizzato, raccogliere una singola colonia per inoculare in 2 mL di brodo BHI. Incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi.
- Utilizzare 20 l della coltura notturna di S. mutans -gtfC per inoculare 2 mL di brodo BHI contenente 1% di saccarosio senza antibiotici in una provetta di vetro. Aggiungere il GTF-SI o un volume equivalente del veicolo per la coltura S. mutans -gtfC, e la coltura le cellule con il tubo posto in una posizione inclinata durante la notte.
NOT: Sterilizzare la soluzione GTF-SI con un filtro sterile di siringa e determinare la concentrazione di proteine utilizzando un test proteico acido bicinchoninico15 prima dell'uso. - Agitare le sospensioni di coltura con un mixer vortice per 10 s. Decant le sospensioni. Lavare le provette con una quantità sufficiente di acqua distillata.
- Macchiare i biofilm sulla parete del tubo con 1 mL di 0.25% Coomassie brillante blu (CBB).
- Decantare la soluzione di colorazione dopo 1 min. Asciugare all'aria le provette.
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Representative Results
Figura 3 Mostra la dimensione di ogni amplificatore dal primo PCR (Figura 3A) e secondo PCR (Figura 3B). La dimensione di ogni amplificatore corrispondeva alla dimensione prevista, come descritto nella Tabella 1. La figura 4A mostra le colonie di S. mutans trasformate con il secondo prodotto PCR e placcate sulle piastre di agar BHI contenenti spettronomia. I prodotti PCR della colonia sono stati poi eseguiti sul gel di agarose (Figura 4B). Ogni amplificatore era della dimensione prevista, come descritto nella Tabella 1. Figura 5 Mostra le immagini di SDS-PAGE e macchia occidentale. La proteina purificata con IMAC è stata osservata come una singola banda da SDS-PAGE(Figura 5A). La macchia occidentale è stata eseguita utilizzando l'anticorpo antipoligliedne per confermare che la banda osservata era la proteina con etichettatura polihisdina prevista (Figura 5B) di 160 kDa. La figura 6 mostra la capacità di formazione di biofilm derivata dal saccarosio di ogni ceppo S. mutans. Solo S. mutans WT e S. mutans His-gtfC potrebbero formare un biofilm aderente sulla parete del tubo in presenza di 1% di saccarosio. Questo non è stato osservato in S. mutans gt -fC (Figura 6A). Tuttavia, l'aggiunta del GTF-SI ricombinante ha ripristinato l'abilità di formazione di biofilm aderente in S. mutans -gtfC (Figura 6B).
Figura 1: Organizzazione di gtfC e spcr loci nel genoma UA159 S. mutans e dei suoi derivati. Illustrazione schematica del tag His tra gtfC e spcr. Le lunghezze dei geni e delle lacune non sono in scala. Pentagono ombreggiato: SMU_1004; pentagono solido: SMU_1006. Questa cifra è stata modificata da una precedente pubblicazione2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Strategia per la fusione PCR in due fasi. Illustrazione schematica di S. mutans La sua costruzionegtfC. Le lunghezze dei geni e delle lacune non sono in scala. I siti di associazione di primer nel modello sono indicati da modelli. (A) Le regioni che ospitano parte del gene gtfC nel genoma S. mutans WT e che ospitano spcr nei genoma di S. mutans -gtfC sono state amplificate utilizzando la prima PCR. (B) La seconda PCR è stata eseguita con primer nidificati utilizzando i due frammenti che sono stati amplificati dalla prima PCR come modelli, ed è stato ottenuto un costrutto di DNA per la ricombinazione omologa. (C) Il ceppo mutante è stato generato su ricombinazione omologa nei batteri. Questa cifra è stata modificata da una precedente pubblicazione2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: elettroforesi gel Agarose di prodotti PCR primo e secondo. (A) Vengono mostrati i prodotti della prima PCR di una parte di gtfC (gtfC; immagine sinistra) e della regione che ospita l'spcr (spcr; immagine a destra). La singola immagine elettroforetica è divisa per etichettare le bande di marcatori. (B) Vengono mostrati i secondi prodotti PCR amplificati con i primer nidificati. Ogni freccia indica la dimensione prevista di ogni prodotto PCR. M - marcatore molecolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Colonia PCR per la generazione di schermo di S. mutans His-gtfC. (A) vengono mostrate le colonie S. mutans trasformate dal secondo prodotto PCR. L'ID colonia è indicato da numeri cerchiati. (B) Viene mostrata l'elettroforesi gel di agarose dei prodotti PCR colonia. Il numero di corsia cerchiato corrisponde all'ID colonia nella figura 4A. M - marcatore molecolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Conferma della purificazione GTF-SI con tag polihisdina. ( A ) Vienevisualizzatal'immagine rappresentativa SDS-PAGE. (B) Viene mostrata un'immagine commerciale rappresentativa. Una membrana di nitrocellulesa su cui è stato trasferito GTF-SI è stata sondata con un anticorpo monoclonale anti-polihisideo perossico di rafano. Le bande immunoreattive sono state visualizzate usando una reazione di chemiluminescenza. Le punte di freccia indicano la dimensione prevista del GTF-SI ricombinante. M: marcatore molecolare; 1 - campione prima dell'IMAC; 2 - campione ottenuto dall'IMAC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Ripristino funzionale mediante l'aggiunta del GTF-SI ricombinante. (A) La capacità di formazione di biofilm aderente derivata dal saccarosio è mostrata per ogni ceppo S. mutans. (B) La capacità di formare biofilm aderenti è stata ripristinata in S. mutans ,gtfC, con l'aggiunta di GTF-SI ricombinante (25 g). WT - S. mutans WT; S'inn: gtfC - S. mutans -gtfC; His-gtfC - S. mutans His-gtfC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Coppie di primer | Sequenza (da 5 a 3) | Dimensioni della banda previste (bp) | ||
| 1o PCR | ||||
|
gtfC-avanti gtfC-reverse A,B |
TAAAGGTTATGTTTATTCAGAGGTAACC ATGATAGATAGATAGATAGACTACCACCACCTCC AAATCTCTAAGAAGATGTCAA |
1,090 | ||
|
spcr-forward A,C spcr-reverse |
GGTGGTAGTCATCATCATCATCAT GATTO TAAATCGATTTTTGTTCGTGAAT TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC |
2,232 | ||
| 2a PCR | ||||
| Avanzamento annidato Inverti annidato |
TGGTATTATTTCGATAATAACGGTTATATGGTCAC GCCATACTTAGAGAAATTCTTTTGCTAAATTCTTG |
3,179 | ||
| Verifica della ricombinazione | ||||
| Colonia PCR | ||||
|
gtfC-avanti Colonia-reverse |
TAAAGGTTATGTTTATTCAGAGGTAACC CCACTCTCAACTCCTGATCCAAAACATGTAGTACCACC |
1,482 | ||
| Verifica finale | ||||
| Avanti in avanti Inverti in basso |
TACGGCCGTATCAGTTATTACGATCTCTCTCTGGGGGG TTGTCTCTTACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG |
6,173 | ||
Tabella 1: Primer utilizzati nel protocollo. A A Le sequenze sottolineate di 'gtfC-reverse e spcr-forward' sono complementari e il sequencescode in grassetto per il tag His (gtfC-reverse; ATGATIGATIG, spcr-forward; CATCATCATCATCATCAT) e linker GS (gtfC-reverse; ACTACCACCTCC, spcr-forward; GGTGGTAGT). B Il codon di arresto del DNA di gtfC è stato rimosso. C Un codone di arresto del DNA (TAA) è stato aggiunto immediatamente dopo le sequenze di codifica polihisina.
| Reagente | Concentrazione della soluzione di stock | volume | Concentrazione finale |
| premiscela di polimerasi del DNA | 2x (2x) | 25 ll | 1x (in modo non il |
| Primer in avanti | 5 M | 2 ll | 0,2 M |
| Primer inverso | 5 M | 2 ll | 0,2 M |
| Modello DNA | variabile | variabile | variabile |
| Acqua deionizzata | - | Fino a 50 l | - |
Tabella 2: Reagenti PCR: Per la prima PCR, sono stati aggiunti 2 L del modello di DNA. Per la seconda PCR, è stato aggiunto alla miscela di reazione 0,5-2 l del primo amplificatore PCR. Per la colonia PCR, le cellule batteriche sono state aggiunte direttamente alla miscela di reazione.
| passo | temperatura | ora | Numero di cicli |
| Denaturazione iniziale | 98 gradi centigradi | 2 min | 1 |
| Denaturazione ricottura interno |
98 gradi centigradi 50 gradi centigradi 72 gradi centigradi |
10 s 5 s Dipendente da un'ampia (1 min/1 kbp) |
35 |
| Estensione finale | 72 gradi centigradi | Dipendente da un'ampia (1 min/1 kbp) |
1 |
Tabella 3: cicli di amplificazione PCR.
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Discussion
La progettazione dei primer è il passo più critico del protocollo. Le sequenze dei primer gtfC-reverse e spcr-forward sono state determinate automaticamente in base alle sequenze sia della regione finale 3 di gtfC che della regione finale 5 di spcr. Ogni primer include 24 basi complementari che codificano un linker GS e una sequenza His-tag-coding nelle loro regioni 5'. L'interruzione delle sequenze normative native situate nelle regioni di fianco a monte può essere evitata con l'aggiunta di sequenze His-tag-coding alla fine 3. Il codone di arresto del DNA deve essere rimosso dal primer gtfC-reverse e aggiunto al primer spcr-forward. Inoltre, il gtfC-forward e spcr-reverse dovrebbe essere progettato per amplificare le regioni di fianco di circa 1 kb a monte e a valle della regione target di ricombinazione omologa nel genoma S. mutans WT, rispettivamente. L'aggiunta di lunghe sequenze di fiancheggiamento migliora l'efficienza della ricombinazione omologa. I primer nidificati sono stati progettati per essere utilizzati al posto della coppia di primer più esterna (gtfC-forward e spcr-reverse) in questo protocollo. L'inclusione di primer nidificati è necessaria per la seconda PCR, come descritto altrove5.
La trasformazione mediante elettroporazione è efficiente1 e le procedure per la preparazione delle cellule competenti che precedono l'elettroporazione sono anche molto più semplici rispetto ai metodialternativi 16,17,18, anche se è necessario un apparato di elettroporazione. Si raccomanda vivamente di preparare di nuovo S. mutans WT competente in caso di colonie mancanti sulla piastra dopo l'elettroporazione. Sebbene l'incubazione per un paio d'ore dopo l'elettroporazione possa migliorare l'efficienza della trasformazione, l'incubazione supplementare non influisce sul successo della trasformazione. Le celle nella fase di crescita del log devono essere utilizzate per la preparazione competente delle celle, come descritto in precedenza5.
Poiché la quantità di proteine ricombinanti dipende dall'espressione nativa del gene, la coltura scale-up può essere necessaria nei casi di proteine con espressione inferiore. Il metodo qui presentato è limitato dall'applicazione del saggio di restauro funzionale. L'aggiunta di gene di interesse non può essere applicata alle proteine intracellulari esogenamente. Tuttavia, il metodo sviluppato presenta notevoli vantaggi in termini di struttura, efficienza e costi (ad esempio, nessuna reazione enzimatica diversa dalla PCR) quando si lavora con la proteina bersaglio extracellulare. Inoltre, la purificazione della proteina ricombinante e la conferma dell'effettiva espressione genica possono essere eseguite semplicemente utilizzando applicazioni His-tag comuni, come illustrato nella Figura 5.
L'attuale metodo, compresa la perturbazione genica e l'isolamento del prodotto genico, può essere adattato per un uso futuro in altre specie come esperimenti seriali per l'analisi funzionale di un gene di interesse.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (numeri di sovvenzione 16K15860 e 19K10471 a T. M., da 17K12032 a M. I., e da 18K09926 a N. H.) e dalla SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (numero di sovvenzione 2018.09.10 n. 10).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
- Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Wingfield, P. T.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Smith, P. K., et al.
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
