Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kinetisk screening af Nukleaseaktivitet ved hjælp af nukleinsyre sonder

Published: November 1, 2019 doi: 10.3791/60005
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,3, 1,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Physics, Chemistry and Biology, Linköping University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine (WCMM), 3Nucleic Acids Technologies Laboratory (NAT-lab), Linköping University
* These authors contributed equally

Summary

Ændret nukleaseaktivitet har været forbundet med forskellige menneskelige forhold, underliggende dets potentiale som en biomarkør. Den modulære og nem at implementere screeningmetode præsenteret i dette papir giver mulighed for udvælgelse af specifikke nukleinsyre sonder til at udnytte nuclease aktivitet som en biomarkør af sygdom.

Abstract

Nukleaser er en klasse af enzymer, der nedbryder nukleinsyrer ved at katalysere hydrolyse af fosfodiester bindinger, der forbinder de ribose sukkerarter. Nukleaser viser en række vitale fysiologiske roller i prokaryotiske og eukaryotiske organismer, der spænder fra at opretholde genom stabilitet til at yde beskyttelse mod patogener. Ændret nukleaseaktivitet har været forbundet med flere patologiske tilstande, herunder bakterielle infektioner og kræft. Til dette formål har nukleaseaktiviteten vist et stort potentiale for at blive udnyttet som en specifik biomarkør. En robust og reproducerbar screeningsmetode, der er baseret på denne aktivitet, er dog fortsat meget ønskelig.

Heri introducerer vi en metode, der gør det muligt at screene for nukleaseaktivitet ved hjælp af nukleinsyre sonder som substrater med omfanget af differentiering mellem patologiske og sunde tilstande. Denne metode giver mulighed for at designe nye sonde biblioteker, med stigende specificitet, på en iterativ måde. Således er flere runder af screening er nødvendige for at raffinere sonder ' design med forbedrede funktioner, drage fordel af tilgængeligheden af kemisk modificerede nukleinsyre syrer. Den foreslåede teknologis betydelige potentiale ligger i dens fleksibilitet, høje reproducerbarhed og alsidighed til screening af nukleaseaktiviteten i forbindelse med sygdomstilstande. Det forventes, at denne teknologi vil gøre det muligt at udvikle lovende diagnostiske værktøjer med et stort potentiale i klinikken.

Introduction

Nukleaser er en klasse af enzymer, der kan kløende fosfodiester-obligationerne, som danner rygraden i nukleinsyremolekyler. Den store mangfoldighed af nukleaser gør deres klassificering temmelig vanskelig. Der er dog nogle almindelige kriterier, der anvendes til at beskrive nukleaser, såsom substrat præference (deoxyribonukleinsyre (DNA) eller ribonukleinsyre (RNA)), spaltning site (endonukleaser eller exonucleaser), eller metal ion afhængighed, blandt andre1. Nukleaser er stærkt bevaret katalytiske enzymer, der har fundamentale roller i både prokaryotiske og eukaryotiske organismer og er blevet brugt, og fortsat anvendes, som genredigerings værktøjer2. De er også grundlæggende aktører inden for DNA-vedligeholdelse og-replikering, hvilket medvirker til at bevare genomstabiliteten og deltage i korrekturlæsning3. I bakterier, for eksempel, er nukleaser blevet identificeret som vigtige virulensfaktorer, i stand til at fremme bakteriel overlevelse ved at reducere effektiviteten af værtens immunsystem4,5,6,7 ,8. I pattedyr, er nukleaser blevet foreslået at være impliceret i apoptose9, mitokondrie Biogenese og vedligeholdelse10 og mægling af antibakterielle og antiviral medfødte immunrespons11. Ikke overraskende, nuclease aktivitet ændringer, uanset om forbedring eller mangel på, har været impliceret i en bred vifte af sygdomme hos mennesker. Disse sygdomme spænder fra en bred vifte af kræftformer12,13 til Hjertehypertrofi10 eller autoimmune sygdomme14. Derfor er nukleaser blevet interessante kandidater som biomarkører for en uensartet gruppe af menneskelige forhold. Faktisk har nukleaser allerede vist deres potentiale som vellykkede diagnostiske værktøjer til påvisning af infektioner forårsaget af specifikke bakterielle agenser, såsom Staphylococcus aureus eller Escherichia coli15, 16. i mange kræfttyper, udtryk for stafylokok nuclease domæne-holdige protein 1 (SND1) ribonuklease er tegn på dårlig prognose17. Hos patienter med kræft i bugspytkirtlen er forhøjet ribonuklease i (RNase i) serumniveauer blevet rapporteret18 og foreslået at være associeret med kræft celle fænotyper19. I iskæmiske hjertelidelser, såsom myokardieinfarkt eller ustabil angina pectoris, har deoxyribonuclease i (DNase i) serumniveauer vist sig at være en gyldig diagnostisk markør20,21.

Det har været en hypotese, at den globale plan for nukleaseaktivitet kan være forskellige i raske og sygdomstilstande. Faktisk har nylige rapporter brugt forskelle i nukleaseaktivitet til at skelne mellem sunde og kræft fænotyper22 eller til at identificere sygdomsfremkaldende bakterielle infektioner på en artsspecifik måde15,23. Disse fund har åbnet en ny Avenue for brugen af nukleaser som biomarkører af sygdom. Der er derfor en nødvendighed for at udvikle en omfattende screeningsmetode, der systematisk kan identificere sygdomsrelaterede forskelle i nukleaseaktiviteten, hvilket er af afgørende betydning for udviklingen af nye diagnostiske værktøjer.

Heri introducerer og beskriver vi en ny in vitro-screening tilgang (figur 1) for at identificere følsomme og specifikke sonder, der kan diskriminere mellem nukleaseaktiviteten i sund og usund, eller aktivitet, der er specifik for en type celle eller bakterier. Ved at udnytte nukleinsyrer modularitet designede vi et første bibliotek af dæmpede fluorescerende oligonukleotidsonder bestående af et omfattende sæt af forskellige sekvenser og kemi, som begge er vigtige parametre for Biblioteks design. Disse oligonukleotidsonder flankeres af en fluoroforet (fluorescein amidite, Fam) og en QUENCHER (tidevands QUENCHER 2, TQ2) ved henholdsvis 5 ' og 3 ' enderne (tabel 1). Ved at bruge denne fluorometriske analyse af energioverførsel (FRET) til måling af den enzymatiske nedbrydnings kinetik var vi i stand til at identificere kandidat sonder med potentiale til at diskriminere differentialmønstre af nukleaseaktivitet forbundet med raske eller sygdomstilstande. Vi designede en iterativ proces, hvor nye biblioteker oprettes baseret på de bedste kandidat sonder, som gør det muligt at identificere stadigt mere specifikke kandidat sonder i efterfølgende Screenings trin. Desuden udnytter denne fremgangsmåde den katalytiske karakter af nukleaser for at øge følsomheden. Dette opnås ved at drage fordel af den aktivatable karakter af reporter sonder og evne til nukleaser til kontinuerligt at behandle substrat molekyler, begge repræsenterer de vigtigste fordele i forhold til alternative antistof eller små molekyle-baserede screeningmetoder.

Denne tilgang tilbyder et yderst modulært, fleksibelt og let at gennemføre screeningsværktøj til identifikation af specifikke nukleinsyre sonder, der kan diskriminere mellem raske og sygdomstilstande, og en fremragende platform for udvikling af nye diagnostiske værktøjer, der kan tilpasses til fremtidige kliniske anvendelser. Som sådan blev denne metode anvendt til at identificere nukleaseaktiviteten afledt af salmonella typhimurium (i det følgende benævnt salmonella) til den specifikke identifikation af disse bakterier. I den følgende protokol rapporterer vi om en metode til at screene for bakteriel nukleaseaktivitet ved hjælp af kinetisk analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. oligonukleotid bibliotek design og forberedelse

  1. Biblioteks design
    1. Baseret på følgende kriterier designe et bibliotek af standset fluorescerende oligonukleotid sonder mellem 8 og 12-Mer lang for at undgå sekundær struktur dannelse, med samme længde for alle sonder.
      1. Omfatte mindst ét DNA og en RNA-tilfældig sekvens, der indeholder en kombination af adenin (A), guanin (G), cytosin (C) og thymin (T)/uracil (U) (DNA og RNA-Proder i tabel 1).
        Bemærk: de DNA-og RNA-sekvenser, der er beskrevet i tabel 1 , har været nyttige som Initial substrater til klassificering af en ukendt type nukleaseaktivitet, enten DNase eller RNase. Disse to sekvenser anbefales som udgangspunkt for enhver screening, da de har vist en bred evne til at detektere nuclease aktivitetsprofiler i bakterier og vævsprøver. Hvis der ikke observeres nukleaseaktivitet med disse DNA-og RNA-sekvenser, er det nødvendigt at designe yderligere oligonukleotider.
      2. Omfatter polynucleotid sekvenser bestående af en enkelt type af nukleotid til at bestemme sekvens afhængighed for en given nuclease aktivitet (DNA-poly A, DNA-poly T, DNA-poly C, DNA-poly G, RNA-poly A, RNA-poly U, RNA-poly C og RNA-poly G i tabel 1).
      3. Ved hjælp af den samme sekvens af nukleotidrester som de oprindelige DNA-og RNA-sekvenser, omfatter sekvenser, der indeholder nukleosid analoger husly kemiske modifikationer på 2 '-positionen af ribose sukker, såsom 2 '-fluoro og 2 '-O-methyl, som et stramt skridt for at øge selektiviteten af nukleaser.
        1. Omfatter fuldt modificerede sekvenser, der udelukkende består af 2 '-fluoro nucleosid analoger eller 2 '-O-methyl-nukleosid analoger (alle 2 '-F og alle 2 '-OMe, tabel 1)
        2. Omfatter chimeriske sekvenser bestående af umodificerede naturlige puriner og 2 '-fluoro pyrimidin nukleosid analoger (RNA Pyr-2'F, tabel 1).
        3. Omfatter chimeriske sekvenser bestående af umodificerede naturlige puriner og 2 '-O-methyl-pyrimidin-nukleosid-analoger (RNA Pyr-2'OMe, tabel 1).
        4. Omfatter chimeriske sekvenser bestående af ikke-modificerede naturlige pyrimidiner og 2 '-Fluorpurin-nukleosid-analoger (RNA PUR-2'F, tabel 1).
        5. Omfatter chimeriske sekvenser bestående af umodificerede naturlige pyrimidiner og 2 '-O-Methylpurin nukleosid-analoger (RNA PUR-2'OMe, tabel 1).
  2. Klargøring og opbevaring af oligonukleotid-sonde
    Bemærk: oligonukleotider syntetiseres ved phosphoramidite-metoden. Efter syntesen renses oligonukleotider ved hjælp af højtydende væskekromatografi (HPLC), og massen måles ved massespektrometri.
    1. Spin ned de frysetørte oligonukleotidsonder ved hjælp af en centrifuge og fortynde dem i Tris-EDTA (t) buffer for at forhindre nuklease nedbrydning. Fortyndings volumenet bestemmes i overensstemmelse med udbyttet for hver sonde for at gengive en stamopløsning med en koncentration på 500 pmol/μL.
    2. Opbevar frysetørnede oligonukleotider ved 4 °C eller stuetemperatur i en kort periode. Til langtidsopbevaring (måneder til år) opbevares frysetørret oligonukleotider ved-20 °C. Ved opblanding af lyofiliserede oligonukleotider i te opbevares stamopløsninger ved-20 °c eller fortrinsvis ved-80 °c.

2. bakteriel kultur

  1. Tag en porøs glasperle fra det kryogene opbevarings hætteglas under sterile forhold.
  2. For at isolere individuelle bakterielle kolonier (salmonella og E. coli) skal du bruge kvadrant metoden24 ved at streaking/rulle perlen direkte på en Petri skål, der indeholder Tryptic Soy agar (TSA) medium suppleret med defibrerede får Blod.
  3. Inkubatér kulturen ved 37 °C i 24 timer.

3. fremstilling af supernatant

  1. Overføre en enkelt koloni fra solide medier til 50 mL Tryptic soja bouillon (TSB) og inkubere ved 37 °C i 24 timer ved 200 rpm.
  2. Kulturen (1:500) fortyndes i TSB (sub-kultur) og Inkubér ved 37 °C i 24 timer ved 200 rpm i en ryste inkubator.
    Bemærk: efter 24 timers inkubation forventes de bakterielle kulturer i stationær fase at nå værdier, der er højere end 109 CFU/ml.
  3. Efter inkubationstiden, overføres kulturerne til udjævnede sterile rør og centrifugeres ved 4.500 x g i 30 min.
  4. Saml supernatanten og brug den med det samme. Alternativt opbevares Supernatanterne ved 4 °C eller-20 °C.

4. analyse af nukleaseaktivitet

  1. Forberedelse af arbejds løsninger
    1. Der fremstilles en 20 μL arbejdsopløsning for hver sonde i 1,5 mL nukleasefri mikrocentrifuge glas ved fortynding (1:10 ratio) stamopløsningen (500 pmol/μL) for en endelig arbejds koncentration på 50 pmol/μL. Til dette formål blandes 18 μL fosfat buffer saltvand (PBS) indeholdende MgCl2 og CaCl2 med 2 μl Probe stamopløsning.
      Bemærk: Vær opmærksom på, at i arbejdsopløsningen er oligonukleotider mere sårbare over for nukleasenedbrydning, derfor anbefales det at forberede arbejds løsningerne lige før du indstiller reaktionen.
    2. Undgå direkte lys kontakt under forberedelsen og holde i mørke (indpakket i folie), når der beskæftiger sig med fluorophorer.
  2. Reaktion oprettet
    1. Forvarm fluorometeret (f. eks. Cytation 1) til 37 °C.
    2. Der forberedes et sæt (et rør/sonde) på 1,5 mL nukleasefri mikrocentrifuge glas til hver prøve (TSB, E. coli og salmonella) og etiketten i overensstemmelse hermed.
    3. Tilsæt forsigtigt 96 μL TSB sterile kultur medier, salmonella supernatanten eller E. coli supernatanten (fra trin 3,4.). Derefter tilsættes 4 μL/tube sonde arbejdsopløsning i overensstemmelse hermed. Udfør dette trin ved stuetemperatur.
      Bemærk: 10 sonder blev anvendt til den første runde af screeningen og 6 sonder for anden runde.
    4. Bland grundigt ved pipettering op og ned for at opnå en homogen opløsning. Undgå at introducere luftbobler i prøverne, mens du blander.
    5. Indlæs 95 μL af hver opløsning (sonde + supernatanten eller kultur medier) i en separat brønd af en sort bund, ikke-behandlet 96 brønd plade. Minimer dannelsen af bobler i brøndene ved lastning ved at dispensere forsigtigt med spidsen tæt på væggen af brønden.
    6. Dæk pladen med låget. Inspicer låget visuelt, og kontroller, om der er penne eller støvpartikler, som kan introducere måle artefakter. Udskift låget for en ny, hvis det er tilfældet.
  3. Opsætning af måling
    1. Åbn anskaffelses softwaren (Gen5 3,05) ved at klikke på ikonet software genvej (figur S1A).
    2. Vælg Læs nu i vinduet Jobliste, og vælg ny... for at oprette den kinetiske MÅLINGS protokol (figur S1B).
    3. Klik på Indstil temperatur i dialogvinduet med titlen Procedure og vælg 37 °c. Bekræft og Gem indstillingerne ved at trykke på OK (figur S1C).
    4. Klik på Start Kinetics i dialogvinduet med titlen procedure. Så i pop-up dialogvindue, titlen Kinetic Step, Vælg 2 h i Run time input boks og 2 min i interval input boks. Bekræft og Gem indstillingerne ved at trykke på OK (figur S1D).
    5. Klik på Læs i dialogen vindue med titlen procedure. Så i pop-up dialogvindue, med titlen Read metode, Vælg fluorescens intensitet som en detekterings metode, Endpoint/Kinetic som en læse type og filtre som optiktype. Bekræft og Gem indstillingerne ved at trykke på OK (figur S1E).
    6. Vælg grøn i filter sætteti pop op-dialogvinduet med titlen læse trin (Kinetic). Bekræft og Gem indstillingerne ved at trykke på OK (figur S2A).
    7. I dialogvinduet med titlen procedure, skal du vælge Brug låg og klik på Valider for at sikre, at den oprettede protokol er gyldig. Dette bekræftes af et pop-up dialogvindue (figur S2B).
    8. Vælg protokol på menulinjen, og vælg procedure (figur S2C).
    9. Definer de brønde, der skal måles (figur S2D), i dialogvinduet med titlen procedure.
    10. Indtast eksperimentets navn i indtastningsfeltet filnavn (figur S2E).
    11. Læg pladen med låget i plade læseren. Sørg for, at pladen er i den rigtige retning.
    12. Start købet ved at klikke på knappen Læs ny på værktøjslinjen (figur S2F).
  4. Data analyse
    1. Klik på en af de målte brønde i dialogvinduet med titlen plade 1 (figur S3A).
    2. Klik på Vælg brønde , og Medtag alle de målte brønde i dialogvinduet til valg af brønd . Bekræft og Gem indstillingerne ved at trykke på OK. (Figur S3B).
    3. Vælg data i dialogvinduet med titlen plade 1 for at visualisere de tabulerede resultater (figur S3C).
    4. Eksporter dataene til et opslags blad ved at vælge hurtig eksport i genvejsmenuen (figur S3C).
    5. Mærk datakolonnerne i opslags arket i overensstemmelse hermed for hver prøve og sonde.
    6. Generer kinetiske grafer, ved hjælp af linje med markører stil, ved at plotte relative fluorescens enheder (RFU) versus tid (x-akse: tidslinje for reaktionen og y-aksen: rfus).
      Bemærk: beskrivelsen af generering af en graf er anvendelig, når du bruger regnearksprogrammer (f. eks. Men, alle andre programmer kan bruges til at generere grafer fra de rå data opnået, ved at plotte RFU versus tid.
    7. Beregn hastigheden af den enzymatiske reaktion for hvert målt interval i henhold til følgende formel25: rate = Equation 1 , hvor Hvis er RFU ved det maksimale interval tidspunkt og II er RFU ved det minimale interval tidspunkt, og TF og ti er henholdsvis de maksimale og minimale interval tidspunkter.
    8. Vælg satsen med den højeste værdi (RMax) for hver kurve. Hvis der er mere end én RMaks pr. prøve, skal du vælge den, der forekommer ved det tidligste målingstidspunkt.
    9. Beregn forholdet mellem RMax og gennemsnitsværdien af det tidsinterval, hvor rMax forekommer: sats koefficient =Equation 2
    10. Fold forskellen (FD) beregnes mellem den procentsats koefficient for salmonella og E. coli for hver sonde.
    11. Overvej en fold difference værdi højere end 3 som signifikant.
    12. Overvej de signifikante sonder med de højeste fold difference værdier (FD) som kandidat sonder og som grundlag for Biblioteks designet i den næste screening runde.

5. Screenings runder udvælgelseskriterier (figur 1)

  1. Første runde af screening
    1. Udfør nukleaseaktivitetsanalysen (som beskrevet i afsnit 4) ved hjælp af DNA, RNA og polynucleotidsonder.
    2. Evaluer præferencen for DNA-kemi eller RNA-kemi ved at sammenligne antallet og ydeevnen (FD-værdien) af DNA-og RNA-kandidat sonder.
    3. Vælg typen af nukleinsyre kemi, der gengiver det største antal kandidat sonder, som illustreret i figur 1.
  2. Anden runde af screening
    1. Udfør nukleaseaktivitetsanalysen (som beskrevet i afsnit 4) ved hjælp af fuldt modificerede sonder og chimeriske sonder, der er konstrueret ud fra det nukleinsyre substrat, der blev valgt i den første screening runde.
    2. Vurder præferencen mod sekvenser, der indeholder 2 '-fluoro-og 2 '-O-methyl-nukleosid-analoger ved at sammenligne de opnåede resultater for 2 '-fluoro-og 2 '-O-methyl-modificerede kandidat sonder.
    3. Vælg den type nukleoside analog modifikation, der gengiver det største antal kandidat sonder, som illustreret i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser arbejdsstrømmen for denne metode, som er opdelt i to screening runder. I den første runde af screening, vi brugte 5 DNA-sonder (DNA, DNA poly A, DNA poly T, DNA poly C og DNA poly G) og også 5 RNA prop'er (RNA, RNA poly A, RNA poly U RNA poly C og RNA poly G). De rå data for denne screening runde kan findes i supplerende tabel 1. I anden runde blev kemisk modificerede sonder syntetiseret ved at udskifte RNA-sekvensen med kemisk modificerede Nukleosider (alle 2 '-fluoro og alle 2 '-OMethyl) eller ved kombinationen af RNA og puriner eller pyrimidiner, der er kemisk modificerede (RNA Pyr-2'F, RNA Pyr-2'OMe, RNA PUR-2'F og RNA PUR-2'OMe). De rå data for denne screening runde kan findes i supplerende tabel 2. En detaljeret beskrivelse af sekvenserne findes i tabel 1. Resultaterne fra den første screening runde er vist i figur 2, hvor salmonella kulturen supernatanter rapporterer en klar præference for RNA-sonder over DNA-sonder. I modsætning hertil viser E. coli og Culture Media Controls meget begrænset evne til at nedbryde RNA-sonder. Derudover har vi beregnet foldnings forskellen (FD) mellem rente koefficienterne for salmonella og E. coli (supplerende tabel 3 og supplerende tabel 4) for at identificere de bedst ydende sonder. Beregningerne blev udført som beskrevet i afsnittet protokol.

Disse resultater tyder på tilstedeværelsen af en RNase type aktivitet afledt af salmonella. Baseret på identifikationen af RNA som den foretrukne nukleinsyre type for salmonella nucleaser, har vi designet et nyt bibliotek ved hjælp af kemisk modificerede nukleotider, der skal anvendes i anden screening runde med henblik på at øge specificiteten af Sonder. Figur 3 viser de kinetiske profiler af sonderne, der indeholder kemisk modificerede nukleotider. Interessant nok viser RNA Pyr-2'OMe og RNA PUR-2'OMe den bedst ydende kinetiske adfærd sammenlignet med henholdsvis RNA Pyr-2'F og RNA PUR-2'F.

Disse resultater tyder på, at salmonella har en vigtig RNase aktivitet, der kan bruges til at vælge sonder i stand til specifikt at anerkende denne bakterier. Desuden bemærkede vi, at 2 '-OMe kemisk modificerede Nukleosider er mere velegnede til den type RNAses, der udskilles af salmonella. Med dette i tankerne, den protokol, der er beskrevet i dette bidrag giver mulighed for at udforske brugen af nuclease aktivitet som en biomarkør.

Figure 1
Figur 1: bakteriekulturer og arbejdsgange i screeningsprocessen. Fremstilling af bakteriekulturer og supernatanter (venstre). Beskrivelse af arbejdsprocessen for de to Screenings runder. Første screening: præference for DNA eller RNA evalueres ved hjælp af 10 sonder. Anden screening: på baggrund af nukleinsyre præference evalueres yderligere sonder indeholdende kemisk modificerede nukleotider for at identificere de bedst ydende substrater for en given nukleaseaktivitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: første kinetiske screening runde. Kinetiske profiler af salmonella, E. coli og Culture Media (TSB) ved hjælp af DNA og RNA-sonder. Nukleaseaktiviteten repræsenteres af relative fluorescens enheder (RFU). Graferne er repræsentative for mindst 3 individuelt udførte eksperimenter. De forskellige prøver er mærket som angivet i grafen forklaring. Fold difference (FD) værdier blev beregnet ved hjælp af satsen koefficienter for salmonella og E. coli for hver sonde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: anden kinetisk screening runde. Kinetiske profiler af salmonella, E. coli og kultur medier (TSB) ved hjælp af kemisk modificerede sonder. Nukleaseaktiviteten repræsenteres af relative fluorescens enheder (RFU). Graferne er repræsentative for mindst 3 individuelt udførte eksperimenter. De forskellige prøver er mærket som angivet i grafen forklaring. Fold difference (FD) værdier blev beregnet ved hjælp af satsen koefficienter for salmonella og E. coli for hver sonde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Table 1
Tabel 1: sonde sekvenser for nukleinsyre. Liste over alle de nukleinsyre-sonder, som blev anvendt i dette studie. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1: Opsætning af målinger. Knap Klik og dialogvinduer, der beskriver den trinvise proces, der udføres i anskaffelses softwaren for at opsætte de forskellige målings parametre. (A) Desktop-ikonet. (B) dialogvinduet Jobliste. (C) procedure og temperatur opsætning af dialogvinduer. (D) procedure og kinetisk trin dialogvinduer. (E) procedure og læse metode dialogvinduer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 2
Supplerende figur 2: Opsætning af målinger. Knap Klik og dialogvinduer, der beskriver den trinvise proces, der udføres i anskaffelses softwaren for at opsætte de forskellige målings parametre. (A) procedure og læse trin (Kinetic) dialog vinduer. (B) procedure dialogvindue (C) "Protocol" menulinje. (D) velvalgs dialogvindue. (E) filnavn indtastningsfelt. (F) Kør nyt ikon, der bruges til at starte købet inden for softwaren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 3
Supplerende figur 3: analyse af data. Knap Klik og dialogvinduer, der beskriver den trinvise proces, der udføres i anskaffelses softwaren for at eksportere erhvervede data til et opslags blad til yderligere analyse. (A) plade matrix dialogvindue. (B) dialogvinduer til valg af plade og godt udvalg. (C) plade dialogvindue og hurtig eksport kontekst menu. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 4
Supplerende figur 4: tredje screening runde (sekvens præference optimering). Beskrivelse af de forskellige trin, der er involveret i en yderligere screening runde med henblik på at vurdere sekvens variationer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 5
Supplerende figur 5: fjerde screening runde (specificitets evalueringsrunde). Beskrivelse af de forskellige trin, der er involveret i en yderligere screening runde med henblik på at øge specificiteten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 6
Supplerende figur 6: femte screening runde (optimering af reaktionsparametre). Beskrivelse af de forskellige trin, der er involveret i en yderligere screening runde med henblik på at reducere ikke-målkrydsreaktivitet ved at moduere nukleaseaktiviteten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Table 1
Supplerende tabel 1: rå data fra den første screening runde. For hver sonde (mærket med rødt, øverst) blev anskaffelses tiden og de rå fluorescens værdier indberettet for TSB, E. coli og salmonellasammen med den beregnede kursværdi for hvert interval. Beregningerne blev udført som beskrevet i afsnittet metoder. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplementary Table 2
Supplerende tabel 2: rå data fra den anden screening runde. For hver sonde (mærket med rødt, øverst) blev anskaffelses tiden og de rå fluorescens værdier indberettet for TSB, E. coli og salmonellasammen med den beregnede kursværdi for hvert interval. Beregningerne blev udført som beskrevet i afsnittet metoder. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplementary Table 3
Supplerende tabel 3: data analyse for den første screening runde. For hver sonde (mærket med rødt, øverst) blev følgende værdier opnået for TSB, E. coli og salmonella: maksimalsats værdier, minimal og maksimal interval tidspunkter, sats koefficient, fold forskel værdier mellem salmonella og e. coli over TSB og fold forskel værdier mellem salmonella og E. coli (fremhævet med gult). Beregningerne blev udført som beskrevet i afsnittet metoder og beregningsformlerne og de trinvise beregninger vises i regnearket. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplementary Table 4
Supplerende tabel 4: data analyse for den anden screening runde. For hver sonde (mærket med rødt, øverst) blev følgende værdier opnået for TSB, E. coli og salmonella: maksimalsats værdier, minimal og maksimal interval tidspunkter, sats koefficient, fold forskel værdier mellem salmonella og e. coli over TSB og fold forskel værdier mellem salmonella og E. coli (fremhævet med gult). Beregningerne blev udført som beskrevet i afsnittet metoder og beregningsformlerne og de trinvise beregninger vises i regnearket. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ændringer af nukleaseaktivitet har været forbundet med en bred vifte af sygdoms fænotyper, herunder forskellige typer af kræft og bakterielle infektioner. Disse ændringer foreslås at være det udløsende middel for en betingelse14, mens de i andre tilfælde er konsekvensen af en skadelig fysiologisk hændelse20 eller sygdomsfremkaldende agens16,26. Ikke overraskende, forsøg på at bruge nukleaser og nuclease aktivitet som en diagnostisk biomarkør er blevet beskrevet15,22,23,26, med betydelige løfte. Derfor forekommer det relevant at etablere en robust og reproducerbar screeningmetode til systematisk vurdering af nukleaseaktivitet i sygdom og til identifikation af specifik og følsom reporter. For at imødegå denne nødvendighed har vi udviklet en robust, modulær og nem at implementere screening platform baseret på en fluorescens analyse, der tillader opdagelsen af nye sygdoms biomarkører og identifikation af følsomme og specifikke nukleinsyre sonder i parallel, ved hjælp af den katalytiske handling af nukleaser.

Kraftfulde Screenings værktøjer såsom lille molekyle High gennemløb screening (HTS)27, systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX)28 eller fagtypning display29 er tidligere blevet rapporteret, hvilket gør det muligt identifikation af højaffinitets genkendelses molekyler (f. eks. små molekyler, aptamere eller bindende peptider). Til sammenligning, screening tilgang præsenteret her giver mulighed for udvælgelse af sonder, som kan identificere kendte og ukendte nuclease aktivitet. Denne fremgangsmåde er desuden forenelig med in vitro-, ex vivo-og in vivo-Screenings modeller. Desuden giver den reaktive karakter af nukleaser en indlysende fordel i forhold til de førnævnte tilgange, idet Probe-nuclease interaktion ikke er en statisk, men en dynamisk proces. Det betyder, at nukleases ' aktivitet bliver et indbygget signal forstærknings modul til reporter-sonder, da flere reporter-sonder kan interagere med en enkelt nuklease.

Som i enhver anden screeningmetode er generering og forvaltning af det oprindelige bibliotek afgørende. Karakteren af nukleinsyre sonder giver stor fleksibilitet i udformningen og skabelsen af et bibliotek og giver mulighed for indførelse af varierende grader af kompleksitet afhængigt af screening ansøgning. Bibliotekets kompleksitet kan introduceres på forskellige niveauer, herunder sekvens motiver, nucleotid kemi, fosfat backbone kemi, og oligonucleotid længde. Moduler kompleksiteten af biblioteket gør det muligt at identificere sonder, ikke kun for deres evne til med held at identificere nukleaseaktivitet forbundet med sygdom, men også for egenskaber, der er kompatible med efterfølgende in vivo applikationer. Desuden, et nukleinsyre base bibliotek giver flere fordele i forhold til sine antistof eller peptid modparter. På den ene side er antistof produktion velkendt at være besværlig, kræver dyr eller komplekse eukaryote kultur systemer, som øger omkostningerne og indføre batch variabilitet30,31. Desuden begrænser den høje molekylvægt og immunogeniciteten deres anvendelse28,32. På den anden side kræver genereringen af biologiske peptidbiblioteker normalt enten virale eller bakterielle udtryks systemer29,30, hvilket øger kompleksiteten af screeningsprocessen. Kemiske peptidbiblioteker undgå dette problem, på bekostning af at bruge indviklede perle-baserede systemer eller flere runder af dyre peptid syntese33. Alle disse problemer omgås ved hjælp af et nukleinsyre bibliotek. Når det første bibliotek er etableret, er screeningsmetoderne hurtige og ligetil. Den beskrevne metode fungerer som en platform for yderligere Screenings runder, såsom sekvens optimering (supplerende figur 4), specificitets evaluering (supplerende figur 5) eller optimering af modulatoriske elementer af nukleaseaktivitet, såsom metal cofaktorer (typisk divalent kationer) og chelatorer, som er meget nyttige for at øge specificiteten af de udvalgte sonder (supplerende figur 6).

Den kinetiske fluorometriske analyse, der anvendes i dette studie, kan optimeres til både bakterielle og cellulære kulturer, hvor screeningen udføres i brugervenlige mikrotiterplader. I tilfælde af cellulære assays, denne protokol er kompatibel med både, suspension og enkeltlags kulturer, som, post-optimering, kan bruges i henhold til fornødenheder i in vitro-modellen bliver undersøgt. Vi har identificeret flere kritiske trin, der kræver optimering forud for screening. Disse omfatter celle nummer eller bakterie tæthed, der skal vurderes, Probe koncentration, fluorometer detektor Gain indstillinger eller gennemførelsen af indbygget baggrund korrektion metoder. En begrænsning af denne teknologi er behovet for en ændret nukleaseaktivitet i forbindelse med den patologiske tilstand af interesse. Uden denne funktion er screeningmetoden for udvælgelse af kandidat sonder ikke mulig. En anden begrænsning er den selv slugende evne til guaniner, når de er i umiddelbar nærhed af fluorophore. Denne egenskab skal tages i betragtning ved udformningen af biblioteket.

Den enzymatiske karakter af den målte reaktion gør det nødvendigt at overveje plade indlæsningstider. Minimering af indlæsningstider vil reducere baggrunds forskellene mellem forskellige eksperimentelle forhold. Flere muligheder findes for at overvinde dette problem, såsom at bremse den enzymatiske reaktion under lastning ved hjælp af iskold reagenser, eller ved hjælp af automatiserede lastning systemer, selv om sidstnævnte øger omkostningerne betydeligt, men også den gennemstrømning. Desuden er kinetiske målinger en stor forbedring i forhold til statiske målinger, hvilket giver et komplet og mere realistisk billede af dynamikken i nukleases katalytiske aktivitet.

Sammenfattende tilbyder vores protokol en alsidig, robust og reproducerbar screeningmetode til identifikation af følsomme og specifikke nukleinsyre sonder til påvisning af nukleaseaktivitet i forbindelse med sygdommen, som overvinder store forhindringer for alternative screeningsmetoder. Vi forventer, at denne screening teknologi vil give mulighed for udvikling af nye diagnostiske værktøjer i en lang række betingelser, med nem translatability til klinikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende Luiza I. Hernandez (Linköping Universitet) for hendes omhyggelige revision af manuskriptet og værdifuld rådgivning. Dette arbejde blev støttet af Knut og Alice Wallenberg Foundation og den svenske regering strategisk forskning område i materialevidenskab om avancerede funktionelle materialer på Linköping University (fakultet Grant SFO-mat-LiU No. 2009-00971).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black bottom, non-treated 96 well plate Fisher Scientific 10000631
Cytation1 BioTek CYT1FAV
Eppendorf tubes Thermofisher 11926955
Escherichia coli ATCC 25922
Microbank cryogenic storage vial containing beads Pro-Lab Diagnostics 22-286-155
Nucleic acid probes Biomers.net #
Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 Gibco™ 14040117
Salmonella enterica subs. Enterica ATCC 14028
Tris-EDTA Fisher Scientific 10647633
Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood Thermo Fisher Scientific 10362223
Tryptic Soy Broth Sigma Aldrich 22092

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).
  2. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).
  3. Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).
  4. Berends, E. T., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).
  5. Kiedrowski, M. R., et al. Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease. PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).
  6. Morita, C., et al. Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity. PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).
  7. Hasegawa, T., et al. Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes. Microbiology. 156, Pt 1 184-190 (2010).
  8. Moon, A. F., et al. Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae. Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).
  9. Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).
  10. McDermott-Roe, C., et al. Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function. Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).
  11. Wang, Y. T., et al. A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA. Cell Death & Disease. 7 (11), 2458 (2016).
  12. Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay. RNA. 24 (5), 739-748 (2018).
  13. Wan, L., et al. MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors. Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).
  14. Keyel, P. A. Dnases in health and disease. Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).
  15. Hernandez, F. J., et al. Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe. Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).
  16. Flenker, K. S., et al. Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity. Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).
  17. Kannan, N., Eaves, C. J. Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis. Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).
  18. Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease. International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).
  19. Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines. European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).
  20. Fujibayashi, K., et al. Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction. Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).
  21. Kawai, Y., et al. Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction. Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).
  22. Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer. Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).
  23. Machado, I., et al. Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes. Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).
  24. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).
  25. Worthington Biochemical Corporation. Manual of Clinical Enzyme Measurements. , Worthington Diagnostics. (1972).
  26. Burghardt, E. L., et al. Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia. PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).
  27. Bibette, J. Gaining confidence in high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).
  28. Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. Aptamers overview: selection, features and applications. Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).
  29. Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. Phage display: concept, innovations, applications and future. Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).
  30. Skerra, A. Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities. FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).
  31. Ku, T. H., et al. Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing. Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).
  32. Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).
  33. Gray, B. P., Brown, K. C. Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides. Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).

Tags

Biokemi screening metode nukleaser biomarkører nukleinsyrer sonder nukleaseaktivitet diagnostisk værktøj substrat
Kinetisk screening af Nukleaseaktivitet ved hjælp af nukleinsyre sonder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Balian, A., Garcia Gonzalez, J.,… More

Balian, A., Garcia Gonzalez, J., Bastida, N., Akhtar, K. T. K., Borsa, B. A., Hernandez, F. J. Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes. J. Vis. Exp. (153), e60005, doi:10.3791/60005 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter