Summary
פעילות נוקלאז שונה היתה קשורה לתנאים אנושיים שונים, המשמש כבסיס הפוטנציאל שלה כמו סמנים. מודולרי וקל ליישם את מתודולוגיית ההקרנה הציג בנייר זה מאפשר את הבחירה של חומצות גרעין ספציפיים בדיקה לרתימת פעילות נוקלאז כמו סמנים של מחלה.
Abstract
הנוקלאוסים הם מעמד של אנזימים הנשברים חומצות גרעין על ידי מזרז את ההידרוליזה של איגרות הזרחן המקשרות בין סוכרים מריבוז. הנוקלאוטיות מציגות מגוון תפקידים פיזיולוגיים חיוניים באורגניזמים prokaryotic ו איקריוטית, החל לשמור על יציבות הגנום כדי לספק הגנה מפני פתוגנים. השתנה פעילות נוקלאז כבר שויך עם מספר תנאים פתולוגיים כולל זיהומים חיידקיים וסרטן. למטרה זו, פעילות נוקלאז הראתה פוטנציאל גדול להיות מנוצלת כמו סמנים ספציפיים. עם זאת, שיטת סינון איתנה המבוססת על פעילות זו נותרה רצויה מאוד.
בזאת, אנו מציגים שיטה המאפשרת הקרנה לפעילות נוקלאז באמצעות חומצות גרעין בדיקה כמו מצעים, עם היקף ההבחנה בין תנאים פתולוגיים ובריאים. שיטה זו מציעה את האפשרות לעצב ספריות בדיקה חדשות, עם הגדלת הספציפיות, באופן איטרטיבי. כך, סיבובים מרובים של הקרנה נחוצים כדי לחדד את עיצוב הבדיקות עם תכונות משופרות, ניצול הזמינות של חומצות גרעין כימית שונה. הפוטנציאל הניכר של הטכנולוגיה המוצעת טמון בגמישות שלה, ביכולת הגבוהה ביותר, ורב-תכליתיות עבור הקרנת פעילות נוקלאז הקשורה לתנאי מחלה. צפוי כי טכנולוגיה זו תאפשר פיתוח של כלי אבחון מבטיח עם פוטנציאל גדול במרפאה.
Introduction
הנוקלאוסים הם מחלקה של אנזימים המסוגלים לעזוב את איגרות הזרחן היוצרות את המבנה העמוד השדרה של מולקולות חומצות גרעין. הגיוון העצום של הנוקלאוסים הופך את הסיווג שלהם לקשה למדי. עם זאת, ישנם מספר קריטריונים נפוצים המשמשים לתיאור נוקלאוסים, כגון העדפה מצע (חומצה deoxyribonucleic (DNA) או חומצה ריבונוקלאית (RNA)), אתר המחשוף (לאנונוקלאוסים או אקסקליסים), או תלות יון מתכת, בין השאר1. הנוקלאוסים הם בעלי שימור מאוד אנזימים קטליטי שיש להם תפקידים בסיסיים הן, prokaryotic ואורגניזמים איקריוטית ושימשו, ולהמשיך לשמש, כמו כלים לעריכת גנים2. הם גם שחקנים בסיסיים בתחזוקת DNA ושכפול, עוזר לשמור על יציבות הגנום והשתתפות בתהליכי קריאה-הוכחה3. בחיידקים, למשל, הנוקלאוסים זוהו כגורמים חשובים התקפה אלימה, מסוגל לקדם הישרדות חיידקית על ידי הפחתת היעילות של המערכת החיסונית של המחשב המארח4,5,6,7 ,8. ב יונקים, הנוקלאוסים הציעו להיות מעורב ב אפופטוזיס9, ביוגנזה מיטוכונדריאלי ותחזוקה10 וגישור של התגובות החיסונית אנטיבקטריאלי ו אנטי ויראליות מולדים11. לא באופן מפתיע, שינויים בפעילות נוקלאז, אם שיפור או חוסר, היו מעורבים במגוון רחב של מחלות אנושיות. מחלות אלה נעות בין מגוון רחב של סרטן12,13 כדי היפרפרס לב10 או מחלות אוטואימוניות14. לכן, הנוקלאוסים הפכו למועמדים מעניינים כסמנים לקבוצה הטרוגנית של התנאים האנושיים. למעשה, הנוקלאוסים כבר הראו את הפוטנציאל שלהם ככלי אבחון מוצלח לאיתור זיהומים הנגרמים על ידי סוכני בקטריאלי ספציפיים, כגון האורהולוקוקוס אוes, האנציצ'יה קולי15, 16. בסוגים רבים של סרטן, הביטוי של הדומיין נוקלאז המכילים חלבון 1 (SND1) ריבונוקלאז מעיד על פרוגנוזה גרועה17. בחולי סרטן הלבלב, ריבונוקלאז מוגבה (rnase i) רמות סרום דווחו18 הציע להיות משויך עם פנוטיפים תאים סרטניים19. בתנאי לב האיסכמי, כגון אוטם שריר הלב או בלתי יציבה ומלא יציבות, deoxyribonuclease אני (dnase i) רמות סרום הוכחו להיות סמן אבחון חוקי20,21.
זה כבר שיערו כי השרטוט הגלובלי של פעילות נוקלאז עשוי להיות שונה במצבי בריא ומחלות. למעשה, דיווחים אחרונים השתמשו הבדלים בפעילות נוקלאז להבדיל בין פנוטיפים בריאים סרטניים22 או לזהות זיהומים חיידקיים פתוגניים באופן ספציפי מינים15,23. ממצאים אלה נפתחו שדרה חדשה לשימוש נוקלאוסים כמו סמנים של המחלה. לכן, קיים צורך בפיתוח שיטת הקרנה מקיפה מסוגל לזהות בשיטתיות הבדלים הקשורים המחלה בפעילות נוקלאז, אשר עשויה להיות חשיבות מרכזית בפיתוח של כלי אבחון חדשים.
להלן, אנו מציגים ומתארים חדש בגישה לסינון חוץ גופית (איור 1) כדי לזהות בדיקה רגישה וספציפית מסוגל להפלות בין פעילות נוקלאז בריא ולא בריא, או פעילות ספציפית לסוג של תא או חיידקים. ניצול של המודולריות של חומצות גרעין, עיצבנו ספרייה הראשונית של פלורסנט מנוחלת בדיקה המורכב של מערכת מקיפה של רצפים וchemistries שונים, שניהם להיות פרמטרים חשובים עבור עיצוב הספרייה. הבדיקות הללו הינן מקיפים את משני הגלים האלה באמצעות פלואורוופפור (פלואורואסעין אמדיום, משפחתי) ומוצא (הגאות מקומד 2, TQ2) ב -5 ' ו -3 ' מסתיים בהתאמה (שולחן 1). באמצעות העברת האנרגיה הזאת תהודה פלורסנט (למדוד) המבוססת על בסיס פלואורומטרי כדי לאמוד את הקינטיקה של השפלה אנזימטית, היינו מסוגלים לזהות בדיקה המועמדים עם פוטנציאל להפלות דפוסי הדיפרנציאליות של פעילות נוקלאז קשורה למצבי בריאות או מחלות. עיצבנו תהליך איטראטיבי, שבו הספריות החדשות נוצרות על בסיס הבדיקות הטובות ביותר, המאפשר זיהוי של בדיקת מועמדים ספציפית יותר בשלבי ההקרנה הבאים. יתר על כן, גישה זו מנצלת את האופי הקטליטי של הנוקלאוסים כדי להגביר את הרגישות. הדבר מושג על ידי ניצול האופי הפעילות של בדיקת הכתב ואת היכולת של נוקלאוסים לעבד באופן רציף מולקולות מצע, הן המייצג יתרונות מרכזיים על נוגדנים חלופיים או מולקולה קטנה מבוססת שיטות הקרנה.
גישה זו מציעה מודולרי מאוד, גמיש וקל ליישם כלי הקרנה לזיהוי של חומצות גרעין ספציפיות מסוגל להפלות בין מדינות בריאות ומחלות, פלטפורמה מצוינת לפיתוח של חדש כלי אבחון שניתן להתאים ליישומים קליניים עתידיים. ככזה, גישה זו שימש כדי לזהות את הפעילות נוקלאז נגזר סלמונלה typhimurium (להלן המכונה סלמונלה) עבור זיהוי ספציפי של חיידקים זה. בפרוטוקול הבא, אנו מדווחים על שיטה למסך עבור פעילות נוקלאז חיידקי באמצעות ניתוח קינטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. העיצוב וההכנה של הספרייה לאוסיונומן
- עיצוב ספריה
- בהתבסס על הקריטריונים הבאים לעצב ספרייה של פלורסנט המאובתים בדיקה בדיקה בין 8 ו 12-מר ארוך כדי למנוע היווצרות מבנה משני, עם אורך שווה עבור כל הבדיקות.
- כלול לפחות דנ א אחד ורצף RNA אחד אקראי המכיל שילוב של אדנין (א), גואנין (G), ציטוסין (C) ו תימין (T)/uracil (U) (ה-DNA ו-RNA בדיקות בטבלה 1).
הערה: ה-DNA ו רצפי RNA המתוארים בטבלה 1 היו שימושיים כמו מצעים הראשונית לסיווג סוג לא ידוע של פעילות נוקלאז, או dnase או rnase. שני רצפים אלה מומלצים כנקודת המוצא עבור כל הקרנה, כפי שהם הראו יכולת רחבה כדי לזהות הפרופילים של פעילות נוקלאז בחיידקים ודגימות רקמות. אם הפעילות נוקלאז לא נצפתה עם אלה רצפי DNA ו-RNA, את העיצוב של עוד oligמונוקלאודים נדרש. - כלול רצפי polynucleotide המורכב סוג אחד של נוקלאוטיד כדי לקבוע את התלות רצף עבור פעילות נוקלאז נתון (dna-פולי, dna-פולי, dna-פולי C, dna-פולי g, rna-פולי, rna-פולי U, rna-פולי C ו-rna-פולי G בטבלה 1).
- באמצעות אותו רצף של שאריות נוקלאוטיד כמו ה-DNA הראשוני רצפי RNA, כוללים רצפים המכילים המקבילה נוקלאוסייד מחסה שינויים כימיים ב 2 '-מיקום של סוכר ריבוז, כגון 2 '-fluoro ו 2 '-O-מתיל, כצעד מחמיר להגברת הסלקטיביות של הנוקלאוסים.
- כלול רצפים ששונו באופן מלא המורכב כולו של 2 '-Fluoro נוקלאוטיו מקבילים או 2 '-O-מתיל נוקלאוסייד (All 2 '-F וכל 2 '-OMe, טבלה 1)
- כלול רצפים של צ'יאריק המורכב מפורנים טבעיים לא שונו ו 2 '-fluoro פירימידין נוקלאוסייד (RNA pyr-2f, שולחן 1).
- כלול רצפים של צ'יאריק המורכב מפורנים טבעיים שאינם שונו ו-2 '-O-מתיל-מתיונין נוקלאוסייד (RNA Pyr-2Ome, שולחן 1).
- כלול רצפים של צ'יאריק המורכב פירורימיסועד טבעי 2 '-fluoro פורין נוקלאוטיב (RNA Pur-2 ' F, שולחן 1).
- כלול רצפים של צ'יאריק המורכב פירורימיסועד טבעי 2 '-O-מתיל משני הצדדים האנלוגיים (RNA Pur-2Ome, שולחן 1).
- כלול לפחות דנ א אחד ורצף RNA אחד אקראי המכיל שילוב של אדנין (א), גואנין (G), ציטוסין (C) ו תימין (T)/uracil (U) (ה-DNA ו-RNA בדיקות בטבלה 1).
- בהתבסס על הקריטריונים הבאים לעצב ספרייה של פלורסנט המאובתים בדיקה בדיקה בין 8 ו 12-מר ארוך כדי למנוע היווצרות מבנה משני, עם אורך שווה עבור כל הבדיקות.
- מחלת השמש וההכנה לאחסון
הערה: השיטות הזרחניות מעוצבות ע י השיטה. לאחר הסינתזה, האוקליונודים מטוהרים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים והמסה נמדדת על ידי ספקטרומטר מסה.- שימוש בצנטריפוגה ומדלל אותם במאגר טריס-edta (TE) כדי למנוע השפלה של נוקלאז. לקבוע את עוצמת הדילול בהתאם לתשואה של כל בדיקה כדי לעבד פתרון מניות עם ריכוז של 500 pmol/μL.
- בשנת 4 ° c או טמפרטורת החדר לטווח קצר. לאחסון לטווח ארוך (חודשים עד שנים), החנות לליגונוב 20 ° c. עם השעיית מחדש של ליאופונומטר בתוך TE, לאחסן את פתרונות המניה ב-20 ° c או, רצוי, ב--80 ° c.
2. התרבות החיידקית
- לקחת אחד בחרוזים זכוכית נקבובי מן הבקבוקון אחסון קריוגני תחת תנאים סטריליים.
- כדי לבודד מושבות בקטריאלי בודדים (סלמונלה ו -E. coli), השתמש בשיטת הרביע24 על ידי בריפסים/גלגול החרוז ישירות על צלחת פטרי המכילה טריטיק סויה אגר (ת א) בינונית בתוספת כבשים בהתרסה דם.
- מודאת התרבות ב 37 ° c עבור 24 שעות.
3. הכנה לסופרנטאנט
- העברת מושבה אחת ממדיה מוצקה ל-50 מ"ל סויה טריטיק (TSB) ו-דגירה ב 37 ° צ' עבור 24 h ב 200 rpm.
- לדלל את התרבות (1:500) ב TSB (תת תרבות) ו דגירה ב 37 ° צ' עבור 24 h ב 200 rpm בחממה רועד.
הערה: צפוי כי לאחר 24 שעות של דגירה התרבויות החיידקי הם בשלב נייח להגיע ערכים גבוה יותר מ 109 cfu/mL. - לאחר תקופת הדגירה, להעביר את התרבויות הכתיר צינורות סטרילי וצנטריפוגה ב 4,500 x g עבור 30 דקות.
- אספו את הסופרנטאנט. והשתמשו בו מיד לחלופין, תוכלו לאחסן את הסופרנטנים ב -4 ° צ' או 20 ° c.
4. שיטת הפעולה של nuclease
- הכנת פתרונות עבודה
- להכין 20 μl עבודה פתרון עבור כל לווין ב 1.5 mL נוקלאז ללא תשלום מיקרוצנטריפוגה צינורות ידי דילול (1:10 יחס) פתרון המניה (500 pmol/μl) עבור ריכוז עבודה סופי של 50 pmol/μl. למטרה זו, מערבבים 18 μL של פוספט מאגר מלוחים (PBS) המכיל MgCl2 ו-cacl2 עם 2 μl של פתרון מניות בדיקה.
הערה: הקפד לשים לב כי בפתרון העבודה, מערכות העיבוד החלשות הינן פגיעות יותר לירידה בביצועי נוקלאז, ולכן מומלץ להכין את פתרונות העבודה לפני הגדרת התגובה. - הימנע מגע ישיר בזמן ההכנה ולשמור בחושך (עטוף בנייר כסף), כאשר התמודדות עם fluorophores.
- להכין 20 μl עבודה פתרון עבור כל לווין ב 1.5 mL נוקלאז ללא תשלום מיקרוצנטריפוגה צינורות ידי דילול (1:10 יחס) פתרון המניה (500 pmol/μl) עבור ריכוז עבודה סופי של 50 pmol/μl. למטרה זו, מערבבים 18 μL של פוספט מאגר מלוחים (PBS) המכיל MgCl2 ו-cacl2 עם 2 μl של פתרון מניות בדיקה.
- התגובה הוגדרה
- מחמם את הפלואורומטר (כגון כפייה 1) עד 37 ° c.
- הכן סט (צינור אחד/בדיקה) של 1.5 mL נוקלאז חינם מיקרוצנטריפוגה צינורות עבור כל מדגם (TSB, E. coli ו סלמונלה) ותווית בהתאם.
- בזהירות להוסיף 96 μL של מדיה תרבותית סטרילית TSB, סלמונלה supernatant או E. coli supernatant (משלב 3.4.). לאחר מכן, להוסיף 4 μL/שפופרת של פתרון עבודה בדיקה בהתאם. בצע שלב זה בטמפרטורת החדר.
הערה: 10 הבדיקות שימשו לסיבוב הראשון של ההקרנה ו 6 הבדיקות עבור הסיבוב השני. - מערבבים ביסודיות על ידי ליטוף למעלה ולמטה כדי לקבל פתרון הומוגנית. הימנע להציג בועות אוויר לתוך דגימות תוך ערבוב.
- טעינת 95 μL של כל פתרון (בדיקה + supernatant או מדיה תרבות) לתוך באר נפרדת של התחתון שחור, לא מטופלים 96 צלחת הבאר. מזער את היווצרות בועות בבארות עם העמסה על ידי לחילוק בזהירות עם הקצה קרוב לקיר של הבאר.
- . תכסה את הצלחת עם המכסה שלו בחן חזותית את המכסה ולבדוק סימנים העט או הצטברות חלקיקים אבק שעשויים להחדיר חפצי מדידה. החלף את המכסה עבור אחד חדש אם זהו המקרה.
- הגדרת מדידה
- פתח את תוכנת הרכישה (Gen5 3.05) על-ידי לחיצה על סמל קיצור הדרך של התוכנה (איור S1A).
- בחר באפשרות ' קרא כעת ' מחלון מנהל המשימות ובחר באפשרות ' חדש ' כדי ליצור את פרוטוקול המדידה הקינטית (איור S1B).
- לחץ על קבע טמפרטורה בחלון הדו שיח שכותרתו הליך ובחר 37 ° c. אשר ושמור את ההגדרות על-ידי לחיצה על אישור (איור S1C).
- לחץ על התחל הקינטיקה בחלון הדו שכותרתו פרוצדורה. לאחר מכן, בחלון הדו המוקפץ, שכותרתו צעד קינטי, בחר 2 h בתיבה קלט זמן ריצה ו-2 דקות בתיבה קלט מרווח . אשר ושמור את ההגדרות על-ידי לחיצה על אישור (איור S1D).
- לחץ על לקרוא בחלון הדו שכותרתו הפרוצדורה. לאחר מכן, בחלון הדו המוקפץ, הנקרא שיטת קריאה, בחר בעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית כשיטת זיהוי, נקודת קצה/קינטית כסוג קריאה ומסננים כסוג אופטיקה. אשר ושמור את ההגדרות על-ידי לחיצה על אישור (איור S1E).
- בחלון הדו המוקפץ שכותרתו ' שלב קריאה ' (קינטי), בחר בירוק מתוך ערכת המסננים. אשר ושמור את ההגדרות על-ידי לחיצה על אישור (איור S2A).
- בחלון הדו שכותרתו פרוצדורה, בחר במכסה ולחץ על הלחצן אימות כדי להבטיח שהפרוטוקול שנוצר יהיה חוקי. הדבר מאושר על-ידי חלון דו-שיח מוקפץ (איור S2B).
- בחרו ' פרוטוקול ' בשורת התפריטים ובחרו ' פרוצדורה ' (איור S2C).
- בחלון הדו שיח שכותרתו נוהל, להגדיר את הבארות להיות נמדד (איור S2D).
- הזן את שם הניסוי בתיבת הקלט של שם הקובץ (איור S2E).
- העמיסו את הצלחת עם המכסה שלה לתוך קורא לוחית. ודא כי הצלחת היא בכיוון הנכון.
- הפעל את הרכישה על-ידי לחיצה על ' קרא לחצן חדש ' בסרגל הכלים (איור S2F).
- ניתוח מידע
- לחץ על אחת הבארות שנמדדו בחלון הדו שכותרתו צלחת 1 (איור S3A).
- לחץ על בחר בארות וכלול את כל הבארות הנמדדות בחלון הדו של הבחירה היטב . אשר ושמור את ההגדרות על-ידי לחיצה על אישור. (איור S3B).
- בחירת נתונים בחלון הדו שכותרתו לוחית 1 כדי להמחיש את תוצאות הטאבים (איור S3C).
- יצא את הנתונים לגיליון כפולה על-ידי בחירה בייצוא מהיר מהתפריט תלוי ההקשר (איור S3C).
- בגיליון הכפולה, סמן את עמודות הנתונים בהתאם לדוגמה ולבדיקה.
- צור גרפים קינטית, שימוש בקו עם סמנים סגנון, על ידי התוויית יחידות פלואורסצנטית יחסית (rfu) לעומת הזמן (ציר x: הציר של התגובה ואת ציר y: rfu).
הערה: התיאור של יצירת גרף חל בעת שימוש בתוכניות גיליון אלקטרוני (לדוגמה, Excel). עם זאת, כל התוכניות האחרות ניתן להשתמש כדי ליצור גרפים מהנתונים הגולמיים שהתקבלו, על ידי התוויית RFU לעומת הזמן. - חשב את קצב התגובה האנזימטית עבור כל מרווח נמדד בהתאם לנוסחה הבאה25:
rate =, כאשר אם הוא rfu בנקודת זמן המרווח המקסימלי ו- Ii הוא rfu בנקודת זמן הרווח המינימלי, ו- Tf ו- Ti הם נקודות הזמן של המרווח המקסימלי והמזערי, בהתאמה. - בחר את הקצב עם הערך הגבוה ביותר (Rmax) עבור כל עיקול. אם יש יותר מ-Rמקסימום אחד לדוגמה, בחר את האחד שמופיע בנקודת זמן המדידה המוקדמת ביותר.
- חשב את היחס בין Rmax לבין הערך הממוצע של מרווח הזמן שבו מופיע rmax : מקדם קצב =
- חישוב הפרש הקיפול (FD) בין מקדם הקצב של סלמונלה ו -E. coli עבור כל לווין.
- שקול ערך הפרש מתקפל גבוה מ-3 כמשמעותי.
- שקול את הבדיקות המשמעותיות עם ערכי ההפרש הגבוהים ביותר בקיפול (FD) כבדיקות מועמדות וכבסיס לעיצוב הספרייה בסיבוב ההקרנה הבא.
rate =, כאשר אם הוא rfu בנקודת זמן המרווח המקסימלי ו- Ii הוא rfu בנקודת זמן הרווח המינימלי, ו- Tf ו- Ti הם נקודות הזמן של המרווח המקסימלי והמזערי, בהתאמה.
5. מעגל ההקרנה קריטריונים בחירה (איור 1)
- סיבוב ראשון של הקרנה
- בצע את התאמת פעילות נוקלאז (כמתואר בסעיף 4) באמצעות DNA, RNA ו-polynucleotide בדיקות.
- להעריך את ההעדפה של כימיה DNA או כימיה RNA על ידי השוואת מספר וביצועים (הערך FD) של DNA ו-RNA בדיקות מועמד.
- בחר את סוג של חומצות גרעין הכימיה עיבוד המספר הגדול ביותר של בדיקה המועמדים, כפי שמודגם באיור 1.
- הסבב השני של ההקרנה
- בצע את השינוי הפעילות נוקלאז (כפי שמתואר בסעיף 4) באמצעות בדיקה שונה באופן מלא ומרגשים שעוצבו על בסיס המצע חומצת גרעין נבחר בסיבוב ההקרנה הראשון.
- להעריך את ההעדפה לקראת רצפים המכילים 2 '-Fluoro ו 2 '-O-מתיל נוקלאוטידים מקבילים על ידי השוואת התוצאות שהתקבלו עבור 2 '-Fluoro ו 2 '-O-מתיל בדיקה מועמד שונה.
- בחר את סוג השינוי האנלוגי של נוקלאוטידים, המספר הגדול ביותר של הבדיקות המועמדות, כפי שמודגם באיור 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג את זרימת העבודה של מתודולוגיה זו, אשר מחולקת לשני סיבובים הקרנה. בסיבוב הראשון של ההקרנה, השתמשנו 5 בדיקות DNA (DNA, ה-dna פולי, DNA פולי, dna פולי ו-DNA פולי G) וכן גם 5 בדיקות RNA (RNA, RNA פולי A, RNA פולי rna ו-rna פולי). את הנתונים הגולמיים של סיבוב ההקרנה ניתן למצוא בטבלה השלמה 1. בסיבוב השני, בדיקה כימית שונה היו מסונתז על ידי החלפת רצף ה-RNA עם נוקלאוטידים ששונו כימית (כל 2 '-Fluoro וכל 2 '-OMethyl) או על ידי שילוב של RNA ו purines או pyrimidines כימית שונה (RNA Pyr-2F, RNA Pyr-2Ome, RNA פור-2F ו-RNA פור-2Ome). הנתונים הגולמיים של סיבוב ההקרנה ניתן למצוא בטבלה השלמה 2. תיאור מפורט של הרצפים ניתן למצוא בטבלה 1. התוצאות שהתקבלו מסיבוב ההקרנה הראשון מוצגים באיור 2, שם התרבות סלמונלה supernatants לדווח על העדפה ברורה של RNA בדיקות על הבדיקות DNA. לעומת זאת, E. coli התקשורת שולטת התרבות להראות יכולת מוגבלת מאוד לבזות בבדיקות RNA. בנוסף, אנו מחשבים את הפרש הקיפול (FD) בין מקדמי התעריף של סלמונלה ו -E. Coli (שולחן משלים 3 ושולחן משלים 4) כדי לזהות את הבדיקות הטובות ביותר ביצועים. החישובים בוצעו כמתואר בסעיף הפרוטוקול.
תוצאות אלה מרמזות על נוכחות של סוג RNase של פעילות הנגזרת מסלמונלה. מבוסס על זיהוי RNA כמו הסוג המועדף חומצת גרעין עבור הנוקלאוסים סלמונלה , עיצבנו ספרייה חדשה באמצעות נוקלאוטידים שונה כימית לשמש בסיבוב השני של ההקרנה מכוון להגדיל את הספציפיות של ה זונדים. איור 3 מראה את הפרופילים הקינטית של הגששים המכילים נוקלאוטידים ששונו כימית. מעניין, ה-RNA Pyr-2Ome ו-RNA Pur-2Ome מראים את התנהגות הביצועים הקינטית הטובה ביותר בהשוואה ל-RNA Pyr-2F ו-RNA Pur-2F, בהתאמה.
תוצאות אלה מצביעים על כך סלמונלה יש פעילות RNase חשוב שניתן להשתמש בהם עבור בחירת רגשים המסוגלים במיוחד לזהות את החיידק הזה. יתר על כן, הבחנו כי 2 '-OMe כימית שונה נוקלאוטידים מתאימים יותר לסוג של RNAses מופרש על ידי סלמונלה. במחשבה זו, הפרוטוקול המתואר בתרומה זו מציע את האפשרות לחקור את השימוש בפעילות נוקלאז כמו סמנים ביואריקר.
איור 1: בקטריה בתרביות ובזרימת עבודה של תהליך ההקרנה. הכנת תרביות חיידקים וסופרנטנמלים (משמאל). תיאור זרימת העבודה עבור שני סיבובים ההקרנה. הקרנה ראשונה: ההעדפה של DNA או RNA מוערך באמצעות 10 בדיקות. הקרנה שנייה: מבוסס על העדפה חומצות גרעין, בדיקה נוספת המכילה נוקלאוטידים שונה כימית מוערכים כדי לזהות את מצעים ביצוע הטוב ביותר עבור פעילות נוקלאז נתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ההקרנה הראשונה קינטי עגול. פרופילים קינטית של סלמונלה, E. coli ומדיה תרבותית (TSB) באמצעות בדיקות DNA ו-RNA. פעילות nuclease מיוצגת על-ידי יחידות זריחה יחסית (RFU). הגרפים מייצגים לפחות 3 ניסויים שבוצעו בנפרד. הדגימות השונות מסומנות כמצוין במקרא של הגרף. ערכי הפרש מתקפל (FD) חושבו באמצעות מקדמי הקצב של סלמונלה ו -E. coli עבור כל לווין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הקרנה השני קינטי עגול. פרופילים קינטית של סלמונלה, E. coli ומדיה תרבותית (TSB) באמצעות בדיקות ששונו כימית. פעילות nuclease מיוצגת על-ידי יחידות זריחה יחסית (RFU). הגרפים מייצגים לפחות 3 ניסויים שבוצעו בנפרד. הדגימות השונות מסומנות כמצוין במקרא של הגרף. ערכי הפרש מתקפל (FD) חושבו באמצעות מקדמי הקצב של סלמונלה ו -E. coli עבור כל לווין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: חומצה גרעין רצפים בדיקה. רשימה של כל הבדיקות חומצות גרעין המשמשים במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: המדידה הוגדרה. לחיצות כפתורים וחלונות דו-שיח המתארים את התהליך החורג שבוצע בתוכנת הרכישה כדי להגדיר את פרמטרי המדידה השונים. (A) הסמל של שולחןהעבודה. (B) חלון הדו של מנהל המשימות. (ג) הליכי הגדרת המערכת והטמפרטורה. (ד) הליכים וחלונות דו-ממדיים של שלב קינטי. (E) הליכי הדו של הפרוצדורה וקריאת השירות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 2: מדידה הוגדרה. לחיצות כפתורים וחלונות דו-שיח המתארים את התהליך החורג שבוצע בתוכנת הרכישה כדי להגדיר את פרמטרי המדידה השונים. (א) הליכים וחלונות דו-שלביםמשלב קריאה (קינטי). (ב) שורת תפריטים של חלון הליכים (C) "פרוטוקול". (ד) מבחר טוב של חלון הדו. (E), תיבת קלט שם קובץ. (ו) הפעלת סמל חדש משמש להתחלת הרכישה בתוך התוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 3: ניתוח נתונים. לחיצות כפתורים וחלונות דו-שיח המתארים את התהליך החורג שבוצע בתוכנת הרכישה כדי לייצא נתונים שנרכשו לתוך גיליון כפולה לצורך ניתוח נוסף. חלון דו-שיחשל מטריצתלוח (A). (ב) לוחית וחלונות דו שיח מבחר טוב. (C) החלונית הדו לוחית ולייצא מהירה תפריט ההקשר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 4: סיבוב ההקרנה השלישי (מיטוב העדפת רצף). תיאור השלבים השונים המעורבים בסיבוב הקרנה נוסף המכוון להערכת וריאציות רצף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 5: סיבוב הקרנה רביעי (סיבוב הערכה ספציפיות). תיאור השלבים השונים המעורבים בסיבוב הקרנה נוסף המכוון להגדלת הפרטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: סבב ההקרנה החמישית (מיטוב פרמטרים של התגובה). תיאור השלבים השונים המעורבים בסבב הקרנה נוסף המכוון להפחתת פעילות מעבר שאינה יעד על-ידי פעילות נוקלאז מודולים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה משלימה 1: נתונים גולמיים מסבב ההקרנה הראשון. עבור כל לווין (המסומן באדום, למעלה), זמן הרכישה וערכי הזריחה הגולמיים דווחו עבור TSB, E. coli ו סלמונלה, יחד עם ערך התעריף המחושב עבור כל מרווח. החישובים נערכו כמתואר בסעיף שיטות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 2: נתונים גולמיים מסיבוב ההקרנה השני. עבור כל לווין (המסומן באדום, למעלה), זמן הרכישה וערכי הזריחה הגולמיים דווחו עבור TSB, E. coli ו סלמונלה, יחד עם ערך התעריף המחושב עבור כל מרווח. החישובים נערכו כמתואר בסעיף שיטות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
שולחן משלים 3: ניתוח נתונים לסיבוב ההקרנה הראשון. עבור כל לווין (המסומן באדום, למעלה), הערכים הבאים התקבלו עבור TSB, E. coli ו סלמונלה: ערכי הקצב המקסימלי, מינימום ומקסימום נקודות זמן, מקדם קצב, ערכי ההפרש מקפלים בין סלמונלה ו -e. coli מעל TSB ומקפלים ערכי ההבדל בין סלמונלה ו -e. coli (מודגש בצהוב). החישובים בוצעו כמתואר בסעיף השיטות ונוסחאות החישוב וחישובי צעד אחר צעד מוצגים בגיליון האלקטרוני. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 4: ניתוח נתונים לסיבוב ההקרנה השני. עבור כל לווין (המסומן באדום, למעלה), הערכים הבאים התקבלו עבור TSB, E. coli ו סלמונלה: ערכי הקצב המקסימלי, מינימום ומקסימום נקודות זמן, מקדם קצב, ערכי ההפרש מקפלים בין סלמונלה ו -e. coli מעל TSB ומקפלים ערכי ההבדל בין סלמונלה ו -e. coli (מודגש בצהוב). החישובים בוצעו כמתואר בסעיף השיטות ונוסחאות החישוב וחישובי צעד אחר צעד מוצגים בגיליון האלקטרוני. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שינויים של פעילות נוקלאז היו קשורים עם מגוון רחב של פנוטיפים למחלות, כולל סוגים שונים של סרטן וזיהומים חיידקיים. שינויים אלה מוצעים להיות סוכן סיבתי של מצב14, ואילו במקרים אחרים הם תוצאה של האירוע הפיזיולוגי המזיק20 או סוכן פתוגניים16,26. לא באופן מפתיע, ניסיונות להשתמש בנוקלאוסים ובפעילות נוקלאז כפי שתוארה ביואריקר אבחון15,22,23,26, עם הבטחה ניכרת. בהתאם לכך, הקמת גישת סינון איתנה ומגובשת להערכת שיטתית של פעילות הנוחכירות במחלות ולזיהוי כתב מסוים ורגיש נראה לגבי הדבר. כדי לטפל בצורך זה, פיתחנו חזק, מודולרי וקל ליישם פלטפורמת ההקרנה מבוסס על שיטת זריחה, המאפשר גילוי ביואריטים המחלה הרומן וזיהוי של בדיקה של חומצות גרעין רגיש ספציפי ב במקביל, באמצעות הפעולה הקטליטית של הנוקלאוסים.
כלי הקרנה רבי-עוצמה כגון מולקולה קטנה הקרנת תפוקה גבוהה (HTS)27, אבולוציה סיסטמטית של ליגטים על ידי העשרה מעריכית (selex)28 או phage התצוגה29 דווחו בעבר, אשר מאפשרים את זיהוי של מולקולות זיהוי אהדה גבוהה (למשל, מולקולות קטנות, aptamers או קשירה-פפטידים). לעומת זאת, גישת ההקרנה המוצגת כאן מאפשרת את הבחירה של הבדיקות שיכולות לזהות פעילות נוקלאז ידוע ולא ידוע. יתר על כן, גישה זו תואמת בתוך מבחנה, לשעבר vivo ו ב vivo מודלים ההקרנה. יתר על כן, האופי התגובתי של הנוקלאוסים מספק יתרון ברור על פני הגישות הנ ל, כי האינטראקציה החללית nuclease אינה סטטית, אלא תהליך דינמי. משמעות הדבר היא שהפעילות של הנוקלאוסים הופכת למודול הגברה פנימי של הכתב עבור הבדיקות של העיתונאי מאז כמה בדיקה עיתונאית יכולה לקיים אינטראקציה עם nuclease יחיד.
כמו בכל שיטת סינון אחרת, היצירה והניהול של הספרייה הראשונית חיונית. טבעו של בדיקת חומצות גרעין מספק גמישות רבה בעיצוב ויצירה של ספרייה ומאפשר הקדמה של דרגות שונות של מורכבות בהתאם ליישום ההקרנה. מורכבות הספרייה ניתן להציג ברמות שונות, כולל מוטיבים רצף, כימיה נוקלאוטיד, הכימיה השדרה פוספט, ו האורך האוליונולי. מודגדירוג המורכבות של הספרייה מאפשר לזהות בדיקה, לא רק עבור היכולת שלהם לזהות בהצלחה את הפעילות נוקלאז הקשורים למחלה אלא גם עבור מאפיינים התואמים בהמשך יישומים vivo. יתר על כן, בסיס חומצת גרעין הספרייה מציעה מספר יתרונות על פני הנוגדן או מקבילים פפטיד. מצד אחד, ייצור הנוגדן ידוע היטב להיות מסורבל, המחייב בעלי חיים או מורכבות מערכות איקריוטית התרבות, אשר להגדיל את העלות ולהציג השתנות אצווה30,31. יתר על כן, המשקל המולקולרי הגבוה והאימונוגלוגניות מגבילים את האפליקציה שלהם28,32. לעומת זאת, הדור של ספריות פפטיד ביולוגיות דורש בדרך כלל מערכות ביטוי נגיפי או חיידקי29,30, הגדלת המורכבות של תהליך ההקרנה. ספריות פפטיד כימיות להימנע בעיה זו, על חשבון השימוש מפותל חרוז מערכות מבוססות או מספר סיבובים של סינתזה פפטיד יקר33. כל הבעיות האלה הם להקיף באמצעות ספריית חומצות גרעין. לאחר הקמת הספרייה הראשונית, שיטות ההקרנה מהירות וברורות. השיטה המתוארת כאן משמשת כפלטפורמה לסבבי סינון נוספים, כגון: אופטימיזציה לרצף (איור משלים 4), הערכה מרבית (איור משלים 5) או אופטימיזציה של אלמנטים מאפקקים של פעילות נוקלאז, כגון קופנים מתכת (בדרך כלל בקטניות) וכליונים, שהם שימושיים מאוד להגברת הספציפיות של הבדיקות הנבחרות (איור משלים 6).
השיטת פלואורומטרי קינטית המשמשת במחקר זה יכול להיות ממוטבת עבור שתי התרבויות, חיידקי והסלולר, עם ההקרנה להתבצע בצלחות מיקרוטיטר ידידותי למשתמש. במקרה של assays סלולר, פרוטוקול זה תואם הן, ההשעיה ותרבויות דופלקס, אשר, לאחר אופטימיזציה, ניתן להשתמש על פי הצרכים של מודל מתורבת ללמוד. זיהינו כמה שלבים קריטיים הדורשים אופטימיזציה לפני ההקרנה. אלה כוללים את מספר התא או צפיפות בקטריאלי להיות מאסף, בדיקה ריכוז, פלואורומטר גלאי להשיג הגדרות או יישום של שיטות תיקון רקע בנוי. מגבלה אחת של טכנולוגיה זו היא הצורך בפעילות נוקלאז משתנה הקשורה למצב הפתולוגי של עניין. ללא תכונה זו, גישה ההקרנה עבור הבחירה של בדיקה המועמדים אינה אפשרית. מגבלה נוספת היא היכולת העצמית של הגואן-אינס כאשר הם נמצאים בסמיכות לפלואורופור. מאפיין זה צריך להיחשב בעת עיצוב הספרייה.
האופי האנזימטי של התגובה הנמדד הופך את הצורך לשקול את זמני טעינת הצלחות. מזעור זמני הטעינה תפחית את הבדלי הרקע בין תנאים ניסיוניים שונים. קיימות מספר אפשרויות להתגבר על בעיה זו, כגון האטת התגובה האנזימטית במהלך הטעינה באמצעות ריאגנטים קר-קרח, או שימוש במערכות טעינה אוטומטיות, למרות שהאחרונים מגדילים את העלויות במידה ניכרת, אלא גם את התפוקה. יתר על כן, מדידות קינטית הם שיפור גדול על מדידות סטטיות, מתן תמונה מלאה ומציאותית יותר של הדינמיקה של הפעילות הקטליטית של הנוקלאוסים.
לסיכום, הפרוטוקול שלנו מציע שיטת הקרנה רב-תכליתית, איתנה ולאחר לזיהוי של בדיקות חומצות גרעין רגישות וספציפיות לאיתור הפעילות נוקלאז הקשורים המחלה, אשר מתגבר על מכשולים עיקריים של שיטות הקרנה חלופיות. אנו צופים כי טכנולוגיית ההקרנה תאפשר פיתוח של כלי אבחון הרומן בהמון תנאים, עם יכולת העברה קלה למרפאה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר בלוסה הרננדז (אוניברסיטת ליניפינג) על התיקון הקפדני של כתב היד והעצות החשובות. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן קנוט ואליס ולנברג ובאזור המחקר האסטרטגי של הממשלה השבדית במדעי החומרים על חומרים פונקציונליים מתקדמים באוניברסיטת Linköping (גרנט הפקולטה SFO-Mat-ליו No. 2009-00971).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black bottom, non-treated 96 well plate | Fisher Scientific | 10000631 | |
| Cytation1 | BioTek | CYT1FAV | |
| Eppendorf tubes | Thermofisher | 11926955 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Microbank cryogenic storage vial containing beads | Pro-Lab Diagnostics | 22-286-155 | |
| Nucleic acid probes | Biomers.net | # | |
| Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 | Gibco™ | 14040117 | |
| Salmonella enterica subs. Enterica | ATCC | 14028 | |
| Tris-EDTA | Fisher Scientific | 10647633 | |
| Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood | Thermo Fisher Scientific | 10362223 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma Aldrich | 22092 |
References
- Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).
- Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).
- Berends, E. T., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).
- Kiedrowski, M. R., et al. Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease. PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).
- Morita, C., et al. Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity. PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).
- Hasegawa, T., et al. Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes. Microbiology. 156, Pt 1 184-190 (2010).
- Moon, A. F., et al. Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae. Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).
- Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).
- McDermott-Roe, C., et al. Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function. Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).
- Wang, Y. T., et al. A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA. Cell Death & Disease. 7 (11), 2458 (2016).
- Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay. RNA. 24 (5), 739-748 (2018).
- Wan, L., et al. MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors. Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).
- Keyel, P. A.
- Hernandez, F. J., et al. Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe. Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).
- Flenker, K. S., et al. Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity. Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).
- Kannan, N., Eaves, C. J. Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis. Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).
- Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease. International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).
- Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines. European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).
- Fujibayashi, K., et al. Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction. Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).
- Kawai, Y., et al. Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction. Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).
- Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer. Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).
- Machado, I., et al. Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes. Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).
- Worthington Biochemical Corporation. Manual of Clinical Enzyme Measurements. , Worthington Diagnostics. (1972).
- Burghardt, E. L., et al. Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia. PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).
- Bibette, J.
- Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. Aptamers overview: selection, features and applications. Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).
- Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. Phage display: concept, innovations, applications and future. Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).
- Skerra, A. Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities. FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).
- Ku, T. H., et al. Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing. Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).
- Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).
- Gray, B. P., Brown, K. C. Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides. Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).
