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Biochemistry

Screening cinetico dell'attività nucleana utilizzando sonde con acido Nucleic

Published: November 1, 2019 doi: 10.3791/60005
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,3, 1,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Physics, Chemistry and Biology, Linköping University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine (WCMM), 3Nucleic Acids Technologies Laboratory (NAT-lab), Linköping University
* These authors contributed equally

Summary

L'attività di nucleasi alterata è stata associata a diverse condizioni umane, alla base del suo potenziale come biomarcatore. La metodologia di screening modulare e facile da implementare presentata in questo documento consente di selezionare specifiche sonde di acido nucleico per sfruttare l'attività nuclease come biomarcatore della malattia.

Abstract

Le nucleasi sono una classe di enzimi che scompongono gli acidi nucleici catalizzare l'idrolisi dei legami di fosforestro che legano gli zuccheri ribosio. Le nucleasi mostrano una varietà di ruoli fisiologici vitali negli organismi procariotici ed eucarioti, che vanno dal mantenimento della stabilità del genoma alla protezione contro gli agenti patogeni. L'attività di nucleasi alterata è stata associata a diverse condizioni patologiche, tra cui infezioni batteriche e cancro. A tal fine, l'attività di nucleasi ha mostrato un grande potenziale per essere sfruttata come un biomarcatore specifico. Tuttavia, un metodo di screening robusto e riproducibile basato su questa attività rimane altamente auspicabile.

Qui, introduciamo un metodo che consente lo screening per l'attività nuclease utilizzando sonde di acido nucleico come substrati, con l'ambito di differenziare tra condizioni patologiche e sane. Questo metodo offre la possibilità di progettare nuove librerie di probe, con crescente specificità, in modo iterativo. Pertanto, sono necessari più cicli di screening per affinare il design delle sonde con caratteristiche migliorate, sfruttando la disponibilità di acidi nucleici modificati chimicamente. Il notevole potenziale della tecnologia proposta risiede nella sua flessibilità, alta riproducibilità e versatilità per lo screening dell'attività di nucleasi associata alle condizioni della malattia. Si prevede che questa tecnologia consentirà lo sviluppo di promettenti strumenti diagnostici con un grande potenziale nella clinica.

Introduction

Le nucleasi sono una classe di enzimi in grado di fendere i legami di fosforestro che formano la struttura della spina dorsale delle molecole di acido nucleico. La grande diversità di nucleasi rende la loro classificazione piuttosto difficile. Tuttavia, ci sono alcuni criteri comuni utilizzati per descrivere le nucleasi, come la preferenza del substrato (acido deossiribonucleico (DNA) o acido ribonucleico (RNA), sito di scissione (endonucleases o esonucleasi), o dipendenza da ioni onani metallici, tra gli altri1. Le nucleasi sono enzimi catalitici altamente conservati che hanno ruoli fondamentali in entrambi gli organismi procariotici ed eucarioti e sono stati utilizzati, e continuano ad essere utilizzati, come strumenti di editing genico2. Sono anche attori fondamentali nella manutenzione e replicazione del DNA, contribuendo a mantenere la stabilità del genoma e partecipando ai processi di proof-reading3. Nei batteri, ad esempio, le nucleasi sono state identificate come importanti fattori di virulenza, in grado di promuovere la sopravvivenza batterica riducendo l'efficacia del sistema immunitario dell'ospite4,5,6,7 ,8. Nei mammiferi, le nucleasi sono state suggerite per essere implicate nell'apoptosi9, biogenesi mitocondriale e manutenzione10 e mediazione delle risposte immunitarie innate antibatteriche e antivirali11. Non sorprende che le alterazioni dell'attività di nucleamento, sia in miglioramento che in mancanza, siano state implicate in una vasta gamma di malattie umane. Queste malattie vanno da un'ampia varietà di tumori12,13 a ipertrofia cardiaca10 o malattie autoimmuni14. Pertanto, le nucleasi sono diventate candidati interessanti come biomarcatori per un gruppo eterogeneo di condizioni umane. Infatti, le nucleasi hanno già mostrato il loro potenziale come strumenti diagnostici di successo per il rilevamento di infezioni causate da specifici agenti batterici, come Staphylococcus aureus o Escherichia coli15, 16.In molti tipi di cancro, l'espressione della proteina ribonuclease nuclease nuclease stafilocca del dominio di nuclease 1 (SND1) è indicativa di prognosi infausta17. Nei pazienti affetti da cancro al pancreas, sono stati riportati18 livelli elevati di siero ribonuclease I (RNase I) e proposti di essere associati a fenotipi cellulari cancerosi19. In condizioni cardiache ischemiche, come l'infarto miocardico o l'angina pectoris instabile, deoxyribonuclease I (DNase I) i livelli del siero sono stati indicati come un valido marcatore diagnostico20,21.

È stato ipotizzato che il progetto globale dell'attività nuclease potrebbe essere diverso negli stati sani e malati. Infatti, recenti rapporti hanno utilizzato differenze nell'attività nuclease per distinguere tra fenotipi sani e cancerosi22 o per identificare le infezioni batteriche patogene in modo specifico per specie15,23. Questi risultati hanno aperto una nuova strada per l'uso di nucleasi come biomarcatori della malattia. Pertanto, esiste la necessità di sviluppo di un metodo di screening completo in grado di identificare sistematicamente le differenze associate alle malattie nell'attività nucleana, che possono essere di fondamentale importanza nello sviluppo di nuovi strumenti diagnostici.

In questo articolo, introduciamo e descriviamo un nuovo approccio di screening in vitro (Figura 1) per identificare sonde sensibili e specifiche in grado di discriminare l'attività nucleasea in sano e malsano, o un'attività specifica di un tipo di cellula o batteri. Approfittando della modularità degli acidi nucleici, abbiamo progettato una libreria iniziale di sonde oligonucleotidi fluorescenti quesinella costituita da un insieme completo di sequenze e chimiche diverse, entrambe parametri importanti per la progettazione della biblioteca. Queste sonde oligonucleotide sono affiancate da un fluoroforo (fluorescein amidite, FAM) e da un quencher (quencher di marea 2, TQ2) rispettivamente alle estremità 5' e 3'(tabella 1). Utilizzando questo saggio fluorometrico basato sul trasferimento di energia a risonanza fluorescente (FRET) per misurare la cinetica della degradazione enzima, siamo stati in grado di identificare le sonde candidate con il potenziale di discriminare i modelli differenziali di attività nucleana associati a stati sani o malati. Abbiamo progettato un processo iterativo, in cui vengono create nuove librerie sulla base delle migliori sonde candidate, che consente l'identificazione di sonde candidate sempre più specifiche nelle successive fasi di screening. Inoltre, questo approccio sfrutta la natura catalitica delle nucleasi per aumentare la sensibilità. Ciò si ottiene sfruttando la natura attivabile delle sonde reporter e la capacità delle nuclesie di elaborare continuamente le molecole di substrato, entrambi rappresentando vantaggi chiave rispetto agli anticorpi alternativi o ai metodi di screening a base di piccole molecole.

Questo approccio offre uno strumento di screening altamente modulare, flessibile e facile da implementare per l'identificazione di specifiche sonde di acido nucleico in grado di discriminare gli stati sani e le malattie, e un'eccellente piattaforma per lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici che possono essere adattati per future applicazioni cliniche. Come tale, questo approccio è stato utilizzato per identificare l'attività di nuclease derivata da Salmonella Typhimurium (qui chiamata Salmonella) per l'identificazione specifica di questo batterio. Nel seguente protocollo, riportiamo un metodo per lo screening dell'attività nucleale batterica utilizzando l'analisi cinetica.

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Protocol

1. Progettazione e preparazione della libreria Oligonucleotide

  1. Progettazione della libreria
    1. Sulla base dei seguenti criteri, progettare una libreria di sonde oligonucleotide dissedate tra 8 e 12-mer lunghe per evitare la formazione secondaria della struttura, con uguale lunghezza per tutte le sonde.
      1. Includere almeno un DNA e una sequenza casuale di RNA contenente una combinazione di adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T)/uracil (U) (sondedi DNA e RNA nella tabella 1 ).
        NOTA: Le sequenze di DNA e RNA descritte nella Tabella 1 sono state utili come substrati iniziali per classificare un tipo sconosciuto di attività nucleana, DNase o RNase. Queste due sequenze sono raccomandate come punto di partenza per qualsiasi screening, in quanto hanno dimostrato un'ampia capacità di rilevare i profili di attività nuclease nei campioni di batteri e tessuti. Se l'attività nucleata non viene osservata con queste sequenze di DNA e RNA, è necessaria la progettazione di oligonucleotidi aggiuntivi.
      2. Includere sequenze polinucleotidiche costituite da un singolo tipo di nucleotide per determinare la dipendenza della sequenza per una data attività nucleale (DNA-Poly A, DNA-Poly T, DNA-Poly C, DNA-Poly G, RNA-Poly A, RNA-Poly U, RNA-Poly C e RNA-Poly G nella tabella 1).
      3. Utilizzando la stessa sequenza di residui nucleotidi delle sequenze iniziali di DNA e RNA, includere sequenze che contengono analoghi nucleoside che ospitano modifiche chimiche alla posizione 2' dello zucchero ribosio, come 2'-Fluoro e 2'-O-Methyl, come passo rigoroso per aumentare la selettività delle nucleasi.
        1. Includere sequenze completamente modificate costituite interamente da analoghi nucleoside 2'-Fluoro o analoghi nucleoside 2'-O-Methyl (Tutti i 2'-F e Tutti i 2'-OMe, Tabella 1)
        2. Includere sequenze chihimericicostituite da purine naturali non modificate e analoghi 2'-Fluoro pyrimidine nucleoside (RNA Pyr-2'F, Tabella 1).
        3. Includere sequenze chihimerici costituite da purine naturali non modificate e analoghi nucleoside 2'-O-Methyl (RNA Pyr-2'OMe, Tabella 1).
        4. Includere sequenze chihimerici costituite da pirimidine naturali non modificate e analoghi di 2'-Fluoro purine (RNA Pur-2'F, Tabella 1).
        5. Includere sequenze chihimerici costituite da pirimidine naturali non modificate e analoghi di 2'-O-Methyl purina (RNA Pur-2'OMe, Tabella 1).
  2. Preparazione e stoccaggio della sonda Oligonucleotide
    NOTA: Gli oligonucleotidi sono sintetizzati dal metodo fosforamidite. Dopo la sintesi, gli oligonucleotidi vengono purificati utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e la massa viene misurata dalla spettrometria di massa.
    1. Abbassare le sonde oligonucleotidi loofilizzate usando una centrifuga e diluirle nel buffer Tris-EDTA (TE) per prevenire la degradazione della nucleasi. Determinare il volume di diluizione in base alla resa di ogni sonda per eseguire il rendering di una soluzione di stock con una concentrazione di 500 pmol/l.
    2. Conservare oligonucleotidi linfofiloti a 4 gradi centigradi o a temperatura ambiente per un breve periodo. Per lo stoccaggio a lungo termine (da mesi ad anni), conservare gli oligonucleotidi liofilizzati a -20 gradi centigradi. Dopo la sospensione degli oligonucleotidi liofilizzati in TE, conservare le soluzioni azionarie a -20 gradi centigradi o, preferibilmente, a -80 gradi centigradi.

2. Cultura batterica

  1. Prendere una perla di vetro poroso dalla fiala di stoccaggio criogenico in condizioni sterili.
  2. Per isolare singole colonie batteriche (Salmonella ed E. coli), utilizzare il metodo quadrante24 striature / rotolamento del tallone direttamente su un piatto Petri contenente Tryptic Soy Agar (TSA) medium integrato con pecora defibrinated sangue.
  3. Incubare la coltura a 37 gradi centigradi per 24 ore.

3. Preparazione supernatante

  1. Trasferire una singola colonia da supporti solidi a 50 mL Tryptic Soy Broth (TSB) e incubare a 37 s per 24 h a 200 rpm.
  2. Diluire la coltura (1:500) in TSB (sottocoltura) e incubare a 37 gradi centigradi per 24 h a 200 giri in un'incubatrice tremante.
    NOTA: Dopo 24 h di incubazione le colture batteriche sono in fase stazionaria raggiungendo valori superiori a 109 CFU/mL.
  3. Dopo il periodo di incubazione, trasferire le colture a tubi sterili con tappo e centrifugare a 4.500 x g per 30 min.
  4. Raccogliere il supernatante e usarlo immediatamente. In alternativa, conservare i supernatanti a 4 o -20 gradi centigradi.

4. Saggio sull'attività di Nuclease

  1. Preparazione di soluzioni di lavoro
    1. Preparare una soluzione di lavoro di 20 l l per ogni sonda in tubi di microcentrifuga liberi da 1,5 ml di diluindo (1:10 rapporto) la soluzione di stock (500 pmol/L) per una concentrazione di lavoro finale di 50 pmol / l. A tale scopo, mescolare 18 L di Phosphate Buffer Saline (PBS) contenente MgCl2 e CaCl2 con 2 L di soluzione di sonda.
      NOTA: Essere consapevoli del fatto che nella soluzione di lavoro, gli oligonucleotidi sono più vulnerabili alla degradazione di nucleato, quindi, si consiglia di preparare le soluzioni di lavoro appena prima di impostare la reazione.
    2. Evitare il contatto diretto della luce durante la preparazione e tenere al buio (avvolto in un foglio), quando si tratta di fluorofori.
  2. Impostazione della reazione
    1. Preriscaldare il fluorometro (ad es. Citazione 1) a 37 gradi centigradi.
    2. Preparare un set (un tubo/sonda) di 1,5 mL di tubi di microcentrifuga liberi da nucleato per ogni campione (TSB, E. coli e Salmonella)ed etichettare di conseguenza.
    3. Aggiungere con cura 96 -L di TSB sterile culture media, Salmonella supernatant o E. coli supernatant (dal passo 3.4.). Successivamente, aggiungere di conseguenza 4 soluzione di lavoro sonda/tubo della sonda. Eseguire questo passaggio a temperatura ambiente.
      NOTA: sono state utilizzate 10 sonde per il primo round dello screening e 6 sonde per il secondo round.
    4. Mescolare accuratamente pipetting su e giù per ottenere una soluzione omogenea. Evitare di introdurre bolle d'aria nei campioni durante la miscelazione.
    5. Caricare 95 l di ogni soluzione (sonda - supernatante o supporto di coltura) in un pozzo separato di un fondo nero, non trattato 96 pozzetto. Ridurre al minimo la formazione di bolle nei pozzi al momento del carico erogando con attenzione con la punta vicino alla parete del pozzo.
    6. Coprire la piastra con il coperchio. Ispezionare visivamente il coperchio e verificare la presenza di segni della penna o dell'accumulo di particelle di polvere che possono introdurre artefatti di misurazione. Sostituire il coperchio per uno nuovo, se questo è il caso.
  3. Configurazione della misurazione
    1. Aprire il software di acquisizione (Gen5 3.05) facendo clic sull'icona del collegamento software (Figura S1A).
    2. Selezionare Leggi ora nella finestra di gestione delle attività e scegliere Nuovo... per creare il protocollo di misurazione cinetica (Figura S1B).
    3. Fare clic su Imposta temperatura nella finestra di dialogo intitolata Procedura e selezionare 37 . Confermare e salvare le impostazioni premendo OK (Figura S1C).
    4. Fare clic su Avvia Kinetics nella finestra di dialogo intitolata Procedura. Quindi, nella finestra di dialogo popup, intitolata Passo Kinetico, selezionare 2 h nella casella di input Tempo di esecuzione e 2 min nella casella di input Intervallo. Confermare e salvare le impostazioni premendo OK (Figura S1D).
    5. Fare clic su Lettura nella finestra di dialogo intitolata Procedura. Quindi nella finestra di dialogo pop-up, intitolata Metododi lettura , selezionare Intensità di fluorescenza come metodo di rilevamento, Endpoint/Kinetic come tipo di lettura e Filtri come tipo di ottica. Confermare e salvare le impostazioni premendo OK (Figura S1E).
    6. Nella finestra di dialogo a comparsa intitolata Read Step (Kinetic), selezionare Verde dal gruppo difiltri . Confermare e salvare le impostazioni premendo OK (Figura S2A).
    7. Nella finestra di dialogo intitolata Procedura, selezionare Usa coperchio e fare clic su Convalida per assicurarsi che il protocollo creato sia valido. Ciò è confermato da una finestra di dialogo popup (Figura S2B).
    8. Selezionare protocollo nella barra dei menu e scegliere la procedura (Figura S2C).
    9. Nella finestra di dialogo denominata Procedura, definire i pozzi da misurare (Figura S2D).
    10. Immettere il nome dell'esperimento nella casella di input del nome file (Figura S2E).
    11. Caricare la piastra con il coperchio nel lettore di piastre. Assicurarsi che la piastra sia nel giusto orientamento.
    12. Avviare l'acquisizione facendo clic sul pulsante Leggi nuovo nella barra degli strumenti (Figura S2F).
  4. Analisi dei dati
    1. Fare clic su uno dei pozze misurati nella finestra di dialogo denominata Plate 1 (Figura S3A).
    2. Fare clic su Seleziona pozzi e includere tutti i pozzi misurati nella finestra di dialogo di selezione dei pozzi. Confermare e salvare le impostazioni premendo OK. (Figura S3B).
    3. Selezionare i dati nella finestra di dialogo denominata Plate 1 per visualizzare i risultati visualizzati (Figura S3C).
    4. Esportare i dati in un foglio di pagine affiancate selezionando Esportazione rapida dal menu di scelta rapida (Figura S3C).
    5. Nel foglio di diffusione, etichettare le colonne di dati di conseguenza per ogni campione e sonda.
    6. Generare grafici cinetici, utilizzando la linea con lo stile dei marcatori, tracciando le unità di fluorescenza relative (RFU) rispetto al tempo (asse x: sequenza temporale della reazione e dell'asse y: RRU).
      NOTA: la descrizione della generazione di un grafico è applicabile quando si utilizzano programmi per fogli di calcolo (ad esempio Excel). Tuttavia, qualsiasi altro programma può essere utilizzato per generare grafici dai dati grezzi ottenuti, tracciando RFU rispetto al tempo.
    7. Calcolare la velocità della reazione ezimatica per ogni intervallo Equation 1 misurato in base alla seguente formula25: rate , dove If è RFU al punto di tempo intervallo massimo e Ii è RFU al punto di tempo intervallo minimo, e Tf e Ti sono rispettivamente i punti di tempo a intervalli massimi e minimi.
    8. Selezionare la velocità con il valore più alto (Rmax) per ogni curva. Se è presente più di unR max per campione, selezionare quello che si verifica al primo punto del tempo di misurazione.
    9. Calcolare il rapporto tra Rmax e il valore medio dell'intervallo di tempo in cui si verifica Rmax: coefficiente di tassoEquation 2
    10. Calcolare la differenza di piegatura (FD) tra il coefficiente di tasso di Salmonella e E. coli per ogni sonda.
    11. Considerare significativo un valore di differenza di piegatura superiore a 3.
    12. Considerare le sonde significative con i valori di differenza di piegatura più alti (FD) come sonde candidate e come base per la progettazione della libreria nel successivo ciclo di screening.

5. Screening dei criteri di selezione dei round(Figura 1)

  1. Primo ciclo di screening
    1. Eseguire il saggio di attività nuclease (come descritto nella sezione 4) utilizzando sonde DNA, RNA e polinucleotide.
    2. Valutare la preferenza per la chimica del DNA o della chimica dell'RNA confrontando il numero e le prestazioni (valore FD) delle sonde candidate al DNA e all'RNA.
    3. Selezionare il tipo di chimica dell'acido nucleico che rende il maggior numero di sonde candidate, come illustrato nella Figura 1.
  2. Secondo ciclo di screening
    1. Eseguire il saggio di attività nuclease (come descritto nella sezione 4) utilizzando sonde completamente modificate e sonde chimeriche progettate in base al substrato acido nucleico selezionato nel primo ciclo di screening.
    2. Valutare la preferenza verso sequenze contenenti 2'-Fluoro e 2'-O-Methyl nucleoside analogici confrontando i risultati ottenuti per le sonde candidate modificate 2'-Fluoro e 2'-O-Methyl.
    3. Selezionare il tipo di modifica analogica nucleoside per il rendering del maggior numero di sonde candidate, come illustrato nella Figura 1.

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Representative Results

La figura 1 mostra il flusso di lavoro di questa metodologia, suddivisa in due cicli di screening. Nel primo ciclo di screening, abbiamo utilizzato 5 sonde di DNA (DNA, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C e DNA Poly G) e anche 5 sonde di RNA (RNA, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C e RNA Poly G). I dati grezzi di questo ciclo di screening sono riportati nella tabella supplementari 1. Nel secondo round, le sonde modificate chimicamente sono state sintetizzate sostituendo la sequenza di RNA con nucleosides chimicamente modificati (All 2'-Fluoro e All 2'-OMethyl) o dalla combinazione di RNA e purine o pirimidine modificate chimicamente (RNA Pyr-2'F, RNA Pyr-2'OMe, RNA Pur-2'F e RNA Pur-2'OMe). I dati grezzi di questo ciclo di screening sono riportati nella tabella supplementari 2. Una descrizione dettagliata delle sequenze è disponibile nella Tabella 1. I risultati ottenuti dal primo ciclo di screening sono mostrati nella Figura 2, dove i supernatanti di coltura della Salmonella riportano una chiara preferenza per le sonde di RNA rispetto alle sonde del DNA. Al contrario, E. coli e i controlli dei media di coltura mostrano una capacità molto limitata di degradare le sonde di RNA. Inoltre, abbiamo calcolato la differenza di piegatura (FD) tra i coefficienti di tasso di Salmonella ed E.coli (tabella supplementare 3 e tabella supplementare 4) al fine di identificare le sonde più performanti. I calcoli sono stati eseguiti come descritto nella sezione del protocollo.

Questi risultati suggeriscono la presenza di un tipo di attività RNase derivata dalla Salmonella. Sulla base dell'identificazione dell'RNA come tipo di acido nucleico preferito per le nucleasi di Salmonella, abbiamo progettato una nuova libreria utilizzando nucleotidi modificati chimicamente da utilizzare nella seconda fase di screening volta ad aumentare la specificità del Sonde. La figura 3 mostra i profili cinetici delle sonde contenenti nucleotidi modificati chimicamente. È interessante notare che RNA Pyr-2'OMe e RNA Pur-2'OMe mostrano il comportamento cinetico più performante rispetto a RNA Pyr-2'F e RNA Pur-2'F, rispettivamente.

Questi risultati suggeriscono che la Salmonella ha un'importante attività di RNase che può essere utilizzata per la selezione di sonde in grado di riconoscere specificamente questo batterio. Inoltre, abbiamo osservato che i nucleoside modificati chimicamente 2'OMe sono più adatti al tipo di RNA secreti dalla Salmonella. In quest'ottica, il protocollo descritto in questo contributo offre la possibilità di esplorare l'uso dell'attività di nucleasi come biomarcatore.

Figure 1
Figura 1:colture batteriche e flusso di lavoro del processo di screening. Preparazione di colture batteriche e supernatanti (a sinistra). Descrizione del flusso di lavoro per i due cicli di screening. Primo screening: la preferenza per il DNA o l'RNA viene valutata utilizzando 10 sonde. Secondo screening: In base alla preferenza dell'acido nucleico, vengono valutate sonde aggiuntive contenenti nucleotidi modificati chimicamente per identificare i substrati con le prestazioni migliori per una determinata attività di nucleasi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Primo giro discreening cinetico. Profili cinetici della Salmonella, E. coli e mezzi di coltura (TSB) utilizzando sonde di DNA e RNA. L'attività di nucleaè è rappresentata da unità di fluorescenza relative (RFU). I grafici sono rappresentativi per almeno 3 esperimenti eseguiti individualmente. I diversi campioni sono etichettati come indicato nella legenda del grafico. I valori della differenza di piegatura (FD) sono stati calcolati utilizzando i coefficienti di tasso di Salmonella ed E. coli per ogni sonda. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Secondo giro discreening cinetico. Profili cinetici della Salmonella, E. coli e dei mezzi di coltura (TSB) utilizzando sonde modificate chimicamente. L'attività di nucleaè è rappresentata da unità di fluorescenza relative (RFU). I grafici sono rappresentativi per almeno 3 esperimenti eseguiti individualmente. I diversi campioni sono etichettati come indicato nella legenda del grafico. I valori della differenza di piegatura (FD) sono stati calcolati utilizzando i coefficienti di tasso di Salmonella ed E.coli per ogni sonda. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Table 1
Tabella 1: Sequenze di sonde acodici nucleiche. Elenco di tutte le sonde di acido nucleico utilizzate in questo studio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Figure 1
Figura supplementare Figura 1: Misurazione impostata. Clic sui pulsanti e finestre di dialogo che descrivono il processo stepwise eseguito nel software di acquisizione per impostare i diversi parametri di misurazione. (A) Icona del desktop. (B) Finestra di dialogo Gestione attività. (C) Finestra di dialogo Per la procedura e l'impostazione della temperatura. (D) Finestre di dialogo Procedura e Passo cinetico. (E) Finestre di dialogo Procedura e Metodo di lettura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Figure 2
Figura supplementare Figura 2: Misurazione impostata. Clic sui pulsanti e finestre di dialogo che descrivono il processo stepwise eseguito nel software di acquisizione per impostare i diversi parametri di misurazione. (A) Finestra di dialogo Procedura e Passaggio lettura (Kinetic). (B) Finestra di dialogo Procedura (C) "Protocollo" barra dei menu. (D) Finestra di dialogo di selezione del pozzo. (E) Casella di immissione nome file. (F) Icona Esegui Nuova utilizzata per avviare l'acquisizione all'interno del software. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Figure 3
Figura supplementare 3: Analisi dei dati. Clic sui pulsanti e finestre di dialogo che descrivono il processo stepwise eseguito nel software di acquisizione per esportare i dati acquisiti in un foglio di pagine affiancate per un'ulteriore analisi. (A) Finestra di dialogo Matrice di lastre. (B) Finestre di dialogo Piastra e Selezione pozzi. (C) Finestra di dialogo Piastra e menu contestuale di Esportazione rapida. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Figure 4
Figura supplementare Figura 4: Terzo ciclo di screening (Ottimizzazione delle preferenze di sequenza). Descrizione delle diverse fasi coinvolte in un ulteriore ciclo di screening volto a valutare le variazioni di sequenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Figure 5
Figura supplementare 5: Quarto ciclo di screening (round di valutazione della specificità). Descrizione delle diverse fasi coinvolte in un ulteriore ciclo di screening volto ad aumentare la specificità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Figure 6
Figura supplementare 6: Quinto ciclo di screening (ottimizzazione dei parametri di reazione). Descrizione delle diverse fasi coinvolte in un ulteriore ciclo di screening volto a ridurre la reattività incrociata non bersaglio modulando l'attività nucleana. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Table 1
Tabella supplementare 1: dati grezzi del primo ciclo di screening. Per ogni sonda (etichettata in rosso, in alto), il tempo di acquisizione e i valori di fluorescenza grezzi sono stati riportati per TSB, E. coli e Salmonella, insieme al valore del tasso calcolato per ogni intervallo. I calcoli sono stati effettuati come descritto nella sezione dei metodi. Fare clic qui per scaricare questo file.

Supplementary Table 2
Tabella supplementare 2: Dati grezzi del secondo ciclo di screening. Per ogni sonda (etichettata in rosso, in alto), il tempo di acquisizione e i valori di fluorescenza grezzi sono stati riportati per TSB, E. coli e Salmonella, insieme al valore del tasso calcolato per ogni intervallo. I calcoli sono stati effettuati come descritto nella sezione dei metodi. Fare clic qui per scaricare questo file.

Supplementary Table 3
Tabella supplementare 3: Analisi dei dati per il primo ciclo di screening. Per ogni sonda (etichettata in rosso, in alto), sono stati ottenuti i seguenti valori per TSB, E. coli e Salmonella:valori massimi di tasso, punti temporali minimi e massimi, coefficiente di tasso, valori di differenza di piegatura tra Salmonella e E. coli su TSB e i valori di differenza di piegatura tra Salmonella ed E. coli (evidenziati in giallo). I calcoli sono stati effettuati come descritto nella sezione dei metodi e le formule di calcolo e i calcoli passo dopo passo sono mostrati nel foglio di calcolo. Fare clic qui per scaricare questo file.

Supplementary Table 4
Tabella supplementare 4: Analisi dei dati per il secondo ciclo di screening. Per ogni sonda (etichettata in rosso, in alto), sono stati ottenuti i seguenti valori per TSB, E. coli e Salmonella:valori massimi di tasso, punti temporali minimi e massimi, coefficiente di tasso, valori di differenza di piegatura tra Salmonella e E. coli su TSB e i valori di differenza di piegatura tra Salmonella ed E. coli (evidenziati in giallo). I calcoli sono stati effettuati come descritto nella sezione dei metodi e le formule di calcolo e i calcoli passo dopo passo sono mostrati nel foglio di calcolo. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Le alterazioni dell'attività di nuclease sono state associate a un'ampia varietà di fenotipi della malattia, tra cui diversi tipi di cancro e infezioni batteriche. Queste alterazioni sono proposte come l'agente causale di una condizione14, mentre in altri casi sono la conseguenza di un evento fisiologico dannoso20 o agente patogeno16,26. Non sorprende che i tentativi di utilizzare nucleasi e attività di nucleasi come biomarcatore diagnostico siano stati descritti15,22,23,26, con notevoli promesse. Di conseguenza, l'istituzione di un approccio di screening robusto e riproducibile per la valutazione sistematica dell'attività di nucleasi nella malattia e per l'identificazione di reporter specifico e sensibile sembra pertinente. Per affrontare questa necessità, abbiamo sviluppato una piattaforma di screening robusta, modulare e facile da implementare basata su un analisi della fluorescenza, che consente la scoperta di nuovi biomarcatori della malattia e l'identificazione di sonde di acido nucleico sensibili e specifiche parallela, utilizzando l'azione catalitica delle nucleasi.

Potenti strumenti di screening come lo screening ad alta produttività delle piccole molecole (HTS)27, l'evoluzione sistematica dei ligandi per arricchimento esponenziale (SELEX)28 o il display di fago29 sono stati precedentemente segnalati, che l'identificazione di molecole ad alto riconoscimento di affinità (ad esempio, piccole molecole, aratri o peptidi leganti). In confronto, l'approccio di screening qui presentato consente la selezione di sonde in grado di identificare l'attività nuclease nota e sconosciuta. Inoltre, questo approccio è compatibile con i modelli di screening in vitro, ex vivo e in vivo. Inoltre, la natura reattiva delle nucleasi conferisce un evidente vantaggio rispetto ai suddetti approcci, in quanto l'interazione sonda-nucleasi non è un processo statico, ma dinamico. Ciò significa che l'attività delle nucleasi diventa un modulo di amplificazione del segnale intrinseco per le sonde reporter poiché diverse sonde reporter possono interagire con una singola nucleasi.

Come in qualsiasi altro metodo di screening, la generazione e la gestione della libreria iniziale è essenziale. La natura delle sonde acidi nucleici offre una grande flessibilità nella progettazione e creazione di una libreria e consente l'introduzione di vari gradi di complessità a seconda dell'applicazione di screening. La complessità della biblioteca può essere introdotta a diversi livelli, tra cui motivi di sequenza, chimica dei nucleotidi, chimica della spina dorsale fosfato e lunghezza dell'oligonucleotide. La modifica della complessità della libreria permette di identificare le sonde, non solo per la loro capacità di identificare con successo l'attività di nucleasi associata alla malattia, ma anche per proprietà compatibili con le successive applicazioni in vivo. Inoltre, una libreria di base di acido nucleico offre diversi vantaggi rispetto ai suoi controparti anticorpi o peptidi. Da un lato, la produzione di anticorpi è ben nota per essere ingombrante, richiedendo animali o complessi sistemi di coltura eucariotica, che aumentano i costi e introducono la variabilità dei lotti30,31. Inoltre, l'alto peso molecolare e l'immunogenicità limitano la loro applicazione28,32. D'altra parte, la generazione di librerie biologiche di peptidi di solito richiede sistemi di espressione virale o batterica29,30, aumentando la complessità del processo di screening. Le biblioteche chimiche di peptidi evitano questo problema, a scapito dell'uso di sistemi contorizzati basati su perline o più cicli di costosa sintesi di peptidi33. Tutti questi problemi vengono aggirati utilizzando una biblioteca di acido nucleico. Una volta stabilita la libreria iniziale, i metodi di screening sono rapidi e diretti. Il metodo qui descritto serve come piattaforma per ulteriori turni di screening, come l'ottimizzazione della sequenza (Figura supplementare 4), la valutazione della specificità (Figura supplementare 5) o l'ottimizzazione degli elementi modulatori di attività di nucleato, come cofattori metallici (in genere cazioni divalenti) e chelatori, che sono molto utili per aumentare la specificità delle sonde selezionate (Supplementary Figure 6).

Il saggio fluorometrico cinetico utilizzato in questo studio può essere ottimizzato per entrambe le colture batteriche e cellulari, con lo screening eseguito in piastre di microtiteri user-friendly. Nel caso dei saggi cellulari, questo protocollo è compatibile sia con le colture di sospensione che di monostrato, che, dopo l'ottimizzazione, possono essere utilizzate in base alle necessità del modello in vitro in fase di studio. Abbiamo identificato diversi passaggi critici che richiedono l'ottimizzazione prima dello screening. Questi includono il numero di cellule o la densità batterica da testare, la concentrazione della sonda, le impostazioni di guadagno del rilevatore di fluorometri o l'implementazione di metodi di correzione dello sfondo incorporati. Una limitazione di questa tecnologia è la necessità di un'attività nucleana alterata associata alla condizione patologica di interesse. Senza questa caratteristica, l'approccio di screening per la selezione delle sonde candidate non è fattibile. Un'altra limitazione è la capacità di auto-sicessi dei guanini quando sono in prossimità del fluoroforo. Questa caratteristica deve essere considerata durante la progettazione della libreria.

La natura ezimatica della reazione misurata rende necessario considerare i tempi di caricamento delle lame. La riduzione dei tempi di caricamento riduce al minimo le differenze di background tra le diverse condizioni sperimentali. Esistono diverse opzioni per superare questo problema, come rallentare la reazione enzimatica durante il caricamento utilizzando reagenti a freddo ghiaccio o utilizzando sistemi di caricamento automatizzati, anche se quest'ultimo aumenta notevolmente i costi, ma anche la produttività. Inoltre, le misurazioni cinetiche sono un grande miglioramento rispetto alle misurazioni statiche, fornendo un quadro completo e più realistico delle dinamiche dell'attività catalitica delle nucleasi.

In sintesi, il nostro protocollo offre un metodo di screening versatile, robusto e riproducibile per l'identificazione di sonde di acido nucleico sensibili e specifiche per l'individuazione dell'attività di nucleatura associata alla malattia, che supera i principali ostacoli di metodi di screening alternativi. Prevediamo che questa tecnologia di screening permetterà lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici in una moltitudine di condizioni, con facile traducibilità alla clinica.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano riconoscere Luiza I. Hernandez (Università di Linkaping) per la sua attenta revisione del manoscritto e preziosi consigli. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Knut and Alice Wallenberg e dalla Swedish Government Strategic Research Area in Materials Science on Advanced Functional Materials presso l'Università di Link-ping (Faculty Grant SFO-Mat-LiU n. 2009-00971).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black bottom, non-treated 96 well plate Fisher Scientific 10000631
Cytation1 BioTek CYT1FAV
Eppendorf tubes Thermofisher 11926955
Escherichia coli ATCC 25922
Microbank cryogenic storage vial containing beads Pro-Lab Diagnostics 22-286-155
Nucleic acid probes Biomers.net #
Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 Gibco™ 14040117
Salmonella enterica subs. Enterica ATCC 14028
Tris-EDTA Fisher Scientific 10647633
Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood Thermo Fisher Scientific 10362223
Tryptic Soy Broth Sigma Aldrich 22092

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Biochimica Numero 153 Metodo di screening nucleasi biomarcatori acidi nucleici sonde attività di nucleale strumento diagnostico substrato
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Balian, A., Garcia Gonzalez, J., Bastida, N., Akhtar, K. T. K., Borsa, B. A., Hernandez, F. J. Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes. J. Vis. Exp. (153), e60005, doi:10.3791/60005 (2019).

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