Summary
Förändrad nukleasaktivitet har förknippats med olika mänskliga tillstånd, underliggande dess potential som en biomarkör. Den modulära och lätt att genomföra screening metodik som presenteras i detta dokument kan valet av specifika nukleinsyra sonder för att utnyttja nukleasaktivitet som en biomarkör för sjukdom.
Abstract
Nukleaser är en klass av enzymer som bryter ner nukleinsyror genom att katalysera hydrolys av fosfodiester obligationer som länkar ribose socker. Nukleaser uppvisar en mängd vitala fysiologiska roller i prokaryota och eukaryotiska organismer, allt från att upprätthålla genomstabilitet till att ge skydd mot patogener. Förändrad nukleasaktivitet har förknippats med flera sjukdomstillstånd inklusive bakteriella infektioner och cancer. För detta ändamål har nukleasaktiviteten visat stor potential att utnyttjas som en specifik biomarkör. En robust och reproducerbar screeningmetod baserad på denna verksamhet är dock fortfarande mycket önskvärd.
Häri introducerar vi en metod som möjliggör screening för nukleasaktivitet med hjälp av nukleinsyrliga sonder som substrat, med omfattningen av differentiering mellan patologiska och hälsosamma tillstånd. Denna metod ger möjlighet att utforma nya sond bibliotek, med ökande specificitet, på ett iterativt sätt. Således, flera omgångar av screening är nödvändiga för att förfina sonderna design med förbättrade funktioner, att dra nytta av tillgängligheten av kemiskt modifierade nukleinsyror. Den föreslagna teknikens avsevärda potential ligger i dess flexibilitet, höga reproducerbarhet och mångsidighet för screening av nukleasaktivitet i samband med sjukdomstillstånd. Det förväntas att denna teknik kommer att möjliggöra utveckling av lovande diagnostiska verktyg med en stor potential i kliniken.
Introduction
Nukleaser är en klass av enzymer som kan klyva de fosfodiester obligationer som utgör ryggraden struktur av nukleinsyra molekyler. Den stora mångfalden av nukleaser gör deras klassificering ganska svårt. Emellertid, det finns några gemensamma kriterier som används för att beskriva nukleaser, såsom substrat preferens (deoxyribonukleinsyra (DNA) eller ribonukleinsyra (RNA)), klyvning webbplats (endonukleaser eller exonukleases), eller metall Jon beroende, bland annat1. Nukleaser är mycket bevarade katalytiska enzymer som har grundläggande roller i både, prokaryota och eukaryota organismer och har använts, och fortsätter att användas, som gen redigeringsverktyg2. De är också grundläggande aktörer i DNA-underhåll och replikering, hjälper till att hålla genom stabilitet och deltar i korrekturläsning processer3. I bakterier, till exempel, har nukleaser identifierats som viktiga virulensfaktorer, kunna främja bakteriell överlevnad genom att minska effekten av värdens immunsystem4,5,6,7 ,8. Hos däggdjur har nukleaser föreslagits vara inblandade i apoptos9, mitokondriell biogenes och underhåll10 och medling av antibakteriella och antivirala medfödda immunsvar11. Inte överraskande, Nuclease aktivitet förändringar, vare förbättring eller brist på, har varit inblandade i ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar. Dessa sjukdomar varierar från en mängd olika cancer12,13 till hjärthypertrofi10 eller autoimmuna sjukdomar14. Därför har nukleaser blivit intressanta kandidater som biomarkörer för en heterogen grupp av mänskliga förhållanden. I själva verket, nukleaser har redan visat sin potential som framgångsrika diagnostiska verktyg för detektion av infektioner orsakade av specifika bakteriella agenter, såsom Staphylococcus aureus eller Escherichia coli15, 16. i många cancertyper, uttryck av staphylococcal Nuclease domän innehållande protein 1 (SND1) ribonukleas är indikativt för dålig prognos17. I pankreascancer patienter, förhöjda ribonukleas i (RNase i) serumnivåer har rapporterats18 och föreslog att associeras med cancerogena cell fenotyper19. I ischemiska hjärttillstånd, såsom hjärtinfarkt eller instabil angina pectoris, deoxyribonuclease i (DNase i) serumnivåer har visat sig vara en giltig diagnostisk markör20,21.
Det har varit en hypotes om att den globala blåkopia av nukleasaktivitet kan vara olika i friska och sjukdomstillstånd. I själva verket har de senaste rapporterna använt skillnader i nukleasaktivitet för att skilja mellan friska och cancerogena fenotyper22 eller för att identifiera patogena bakteriella infektioner på ett artspecifikt sätt15,23. Dessa fynd har öppnat en ny aveny för användning av nukleaser som biomarkörer för sjukdom. Därför finns det en nödvändighet för att utveckla en heltäckande screeningmetod som systematiskt kan identifiera sjukdomsrelaterade skillnader i nukleasaktivitet, vilket kanske är av avgörande betydelse för utvecklingen av nya diagnostiska verktyg.
Häri introducerar och beskriver vi en ny in vitro-screeningmetod (figur 1) för att identifiera känsliga och specifika sonder som kan diskriminera mellan nukleasaktivitet i friska och ohälsosamma, eller aktivitet som är specifik för en typ av cell eller bakterier. Med utnyttjande av modularitet av nukleinsyror, designade vi ett första bibliotek av kylda fluorescerande oligonukleotid sonder bestående av en omfattande uppsättning av olika sekvenser och kemiska sammansättningar, båda är viktiga parametrar för biblioteks design. Dessa oligonukleotidsonder flankeras av en fluorophore (fluorescein amidite, FAM) och en törstsläckare (Tide törstsläckare TQ2) vid 5 ' och 3 ' ändarna respektive (tabell 1). Genom att använda denna fluorescerande resonans energiöverföring (FRET) baserade fluorometriska analysen för att mäta kinetiken av enzymatisk nedbrytning, kunde vi identifiera kandidat sonder med potential att diskriminera differential mönster av nukleasaktivitet associerade med friska eller sjukdomstillstånd. Vi utformade en iterativ process, där nya bibliotek skapas baserat på de bästa kandidaten sonderna, som gör det möjligt att identifiera allt mer specifika kandidat prober i efterföljande screening steg. Dessutom, detta tillvägagångssätt utnyttjar den katalytiska karaktären av nukleaser för att öka känsligheten. Detta uppnås genom att utnyttja den activatable karaktären av reportern sonder och förmågan hos nukleaser att kontinuerligt bearbeta substrat molekyler, båda representerar viktiga fördelar jämfört med alternativa antikroppar eller små molekyl-baserade screeningmetoder.
Detta tillvägagångssätt erbjuder ett mycket modulärt, flexibelt och lätt att genomföra screening verktyg för identifiering av specifika nukleinsyrliga sonder som kan diskriminera mellan friska och sjukdomstillstånd, och en utmärkt plattform för utveckling av nya diagnostiska verktyg som kan anpassas för framtida kliniska tillämpningar. Som sådan, detta tillvägagångssätt användes för att identifiera Nuclease verksamhet som härrör från salmonella typhimurium (häri kallad salmonella) för den specifika identifieringen av denna bakterie. I följande protokoll rapporterar vi om en metod för att avskärma för bakteriell nukleasaktivitet med hjälp av kinetisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utformning och förberedelse av oligonukleotidbibliotek
- Biblioteks design
- Baserat på följande kriterier utforma ett bibliotek av kylda fluorescerande oligonukleotid sonder mellan 8 och 12-mer lång tid för att undvika sekundär struktur bildning, med samma längd för alla sonder.
- Inkludera minst ett DNA och en RNA-slumpmässig sekvens som innehåller en kombination av adenin (a), Guanin (G), Cytosin (C) och Tymin (T)/uracil (U) (DNA och RNA-sonder i tabell 1).
Anmärkning: DNA-och RNA-sekvenser som beskrivs i tabell 1 har varit användbara som de initiala substrat för att klassificera en okänd typ av nukleasaktivitet, antingen DNase eller RNase. Dessa två sekvenser rekommenderas som utgångspunkt för varje screening, eftersom de har visat en bred förmåga att upptäcka Nuclease Aktivitetsprofiler i bakterier och vävnadsprover. Om nukleasaktivitet inte observeras med dessa DNA-och RNA-sekvenser, krävs ytterligare oligonukleotider. - Inkludera polynukleotidsekvenser bestående av en enda typ av nukleotid för att bestämma sekvensberoende för en given nukleasaktivitet (DNA-Poly A, DNA-Poly T, DNA-Poly C, DNA-Poly G, RNA-Poly A, RNA-Poly U, RNA-Poly C och RNA-Poly G i tabell 1).
- Använda samma sekvens av nukleotidrester som den initiala DNA-och RNA-sekvenser, inkludera sekvenser som innehåller nukleosidanaloger hyser kemiska modifieringar på 2 '-position ribose socker, såsom 2 '-fluoro och 2 '-O-metyl, som ett strikt steg för att öka selektivitet av nukleaser.
- Inkludera helt modifierade sekvenser bestående helt av 2 '-fluoro nukleosidanaloger eller 2 '-O-metyl nukleosidanaloger (alla 2 '-F och alla 2 '-OMe, tabell 1)
- Inkludera chimära sekvenser bestående av oförändrade naturliga puriner och 2 '-fluoro pyrimidin nukleosidanaloger (RNA Pyr-2 ' F, tabell 1).
- Inkludera chimära sekvenser bestående av oförändrade naturliga puriner och 2 '-O-metyl pyrimidin nukleosidanaloger (RNA Pyr-2 ' OMe, tabell 1).
- Inkludera chimära sekvenser bestående av oförändrade naturliga pyrimidiner och 2 '-fluor purin nukleosidanaloger (RNA PUR-2 ' F, tabell 1).
- Inkludera chimära sekvenser bestående av oförändrade naturliga pyrimidiner och 2 '-O-metyl purin nukleosidanaloger (RNA PUR-2 ' OMe, tabell 1).
- Inkludera minst ett DNA och en RNA-slumpmässig sekvens som innehåller en kombination av adenin (a), Guanin (G), Cytosin (C) och Tymin (T)/uracil (U) (DNA och RNA-sonder i tabell 1).
- Baserat på följande kriterier utforma ett bibliotek av kylda fluorescerande oligonukleotid sonder mellan 8 och 12-mer lång tid för att undvika sekundär struktur bildning, med samma längd för alla sonder.
- Beredning och förvaring av oligonukleotidsond
Notera: Oligonukleotides syntetiseras av phosphoramiditemetoden. Efter syntesen renas oligonukleotiderna med hjälp av högeffektiv vätskekromatografi (HPLC) och massan mäts med masspektrometri.- Snurra de frystorkade oligonukleotidsonderna med en centrifug och späd dem i Tris-EDTA (TE) buffert för att förhindra nukleasnedbrytning. Bestäm utspädningsvolymen enligt avkastningen för varje sond för att återge en stamlösning med en koncentration av 500 pmol/μL.
- Förvara frystorkade oligonukleotider vid 4 ° c eller rumstemperatur på kort sikt. För långtidslagring (månader till år), lagra frystorkade oligonukleotides vid-20 ° c. Vid resuspension av frystorkade oligonukleotider i TE, förvara Stamlösningarna vid-20 ° c eller, helst, vid-80 ° c.
2. bakterieodling
- Ta en porös glaspärla från den kryogena förvaringsflaskan under sterila förhållanden.
- För att isolera enskilda bakteriella kolonier (salmonella och E. coli), Använd kvadrant metod24 genom att Streaking/rullande pärla direkt på en petriskål som innehåller TRYPTIC soja agar (TSA) medium kompletteras med defibrinerade får Blod.
- Inkubera kulturen vid 37 ° c i 24 timmar.
3. supernatant förberedelse
- Överför en enda koloni från fasta medier till 50 mL Tryptic soy buljong (TSB) och inkubera vid 37 ° c för 24 h vid 200 rpm.
- Späd kulturen (1:500) i TSB (sub-kultur) och inkubera vid 37 ° c för 24 h vid 200 rpm i en skakande inkubator.
Anmärkning: det förväntas att efter 24 h inkubation bakteriekulturer är i stationär fas nå värden högre än 109 CFU/ml. - Efter inkubationstiden, överföra kulturerna till utjämnade sterila rör och centrifugera vid 4 500 x g för 30 min.
- Samla supernatanten och använda den omedelbart. Alternativt förvara supernatanterna vid 4 ° c eller-20 ° c.
4. nukleasaktivitet analys
- Beredning av arbetslösningar
- Bered en 20 μL arbetslösning för varje sond i 1,5 mL nukleasfria mikrocentrifugrör genom spädning (1:10 ratio) stamlösningen (500 pmol/μL) för en slutlig arbets koncentration på 50 pmol/μL. För detta ändamål, blanda 18 μL Fosfatbuffertsaltlösning (PBS) som innehåller MgCl2 och CaCl2 med 2 μl sond stamlösning.
Notera: var medveten om att i arbetslösningen är oligonukleoderna mer sårbara för nukleasnedbrytning, därför rekommenderas det att man förbereder arbets lösningarna precis innan man ställer in reaktionen. - Undvik direkt ljus kontakt under beredningen och hålla i mörkret (insvept i folie), när det handlar om fluoroforer.
- Bered en 20 μL arbetslösning för varje sond i 1,5 mL nukleasfria mikrocentrifugrör genom spädning (1:10 ratio) stamlösningen (500 pmol/μL) för en slutlig arbets koncentration på 50 pmol/μL. För detta ändamål, blanda 18 μL Fosfatbuffertsaltlösning (PBS) som innehåller MgCl2 och CaCl2 med 2 μl sond stamlösning.
- Reaktions uppsättning upp
- Förvärm fluorometern (t. ex. Cytation 1) till 37 ° c.
- Förbered en uppsättning (ett rör/sond) på 1,5 mL nukleasfria mikrocentrifugrör för varje prov (TSB, E. coli och salmonella) och etiketten därefter.
- Tillsätt försiktigt 96 μL av TSB sterila odlingsmedier, salmonella supernatanten eller E. coli supernatanten (från steg 3,4.). Tillsätt därefter 4 μL/tub med sond arbetslösning i enlighet med detta. Utför detta steg vid rumstemperatur.
Anmärkning: 10 sonder användes för den första omgången av screening och 6 sonder för den andra omgången. - Blanda noga genom att Pipettera upp och ner för att få en homogen lösning. Undvik att introducera luftbubblor i proverna under mixningen.
- Fyll 95 μL av varje lösning (sond + supernatanten eller odlingsmedium) i en separat brunn på en svart botten, icke-behandlad 96 väl plattan. Minimera bildandet av bubblor i brunnar vid lastning genom att dispensera försiktigt med spetsen nära väggen i brunnen.
- Täck plattan med locket. Inspektera locket visuellt och kontrollera om det finns pennmarkeringar eller ansamling av dammpartiklar som kan introducera Mät artefakter. Byt ut locket mot ett nytt om så är fallet.
- Mått uppsättning upp
- Öppna anskaffningsprogram varan (Gen5 3,05) genom att klicka på genvägen till programvaran (figur S1A).
- Välj Läs nu i fönstret Aktivitetshanteraren och välj ny... för att skapa det kinetiska MÄTNINGS protokollet (figur S1B).
- Klicka på Ange temperatur i dialogfönstret med titeln förfarande och välj 37 ° c. Bekräfta och spara inställningarna genom att trycka på OK (bild S1C).
- Klick på börja Kinetics i dialogen fönster benämnprocedur. Sedan i popup-dialogrutan med titeln Kinetic steg, Välj 2 h i körtid inmatningsrutan och 2 min i intervall inmatningsrutan. Bekräfta och spara inställningarna genom att trycka på OK (bild S1D).
- Klicka på Läs i dialogfönstret med rubriken procedur. Sedan i popup-dialogrutan med titeln Läs metod, Välj fluorescens intensitet som en detektionsmetod, slutpunkt/Kinetic som en lästyp och filter som optik typ. Bekräfta och spara inställningarna genom att trycka på OK (bild S1E).
- I popup-dialogrutan med rubriken Läs steg (Kinetic)väljer du grön från filter uppsättningen. Bekräfta och spara inställningarna genom att trycka på OK (bild s2a).
- I dialogen fönster benämnd procedur, välja använda locken och klick på giltighet till tillförsäkra så pass den skapade protokoll är giltig. Detta bekräftas av ett popup-dialogruta (figur S2B).
- Välj protokoll i menyraden och välj procedur (bild S2C).
- Definiera de brunnar som ska mätas (figur S2D) i dialogfönstret med rubriken procedur.
- Ange namnet på experimentet i inmatningsrutan filnamn (bild s2e).
- Fyll på plattan med locket i plattläsaren. Se till att plattan är i rätt riktning.
- Starta förvärvet genom att klicka på knappen Läs ny i verktygsfältet (bild S2F).
- Data analys
- Klicka på en av de uppmätta brunnarna i dialogfönstret med titeln skylt 1 (figur S3A).
- Klicka på Välj brunnar och inkludera alla uppmätta brunnar i välvals dialog fönstret. Bekräfta och spara inställningarna genom att trycka på OK. (Figur S3B).
- Välj data i dialogfönstret med titeln skylt 1 för att visualisera de tabellerade resultaten (figur S3C).
- Exportera data till ett kalkylblad genom att välja snabb export från snabbmenyn (bild S3C).
- I kalkylbladet etikettera datakolumnerna i enlighet med detta för varje prov och sond.
- Generera kinetiska grafer, med hjälp av linje med markörer stil, genom plottning relativa fluorescensenheter (RFU) kontra tid (x-axeln: tidslinje för reaktionen och y-axeln: rfus).
Beskrivningen av hur du genererar ett diagram gäller när du använder kalkylprogram (t. ex. Excel). Men alla andra program kan användas för att generera grafer från rådata erhålls genom plottning RFU kontra tid. - Beräkna hastigheten för den enzymatiska reaktionen för varje uppmätt intervall enligt följande formel25: rate =
, där om är RFU vid maximal intervalltid och II är RFU vid minimal intervalltid, och TF och ti är de maximala och minimala intervall tids punkterna. - Välj den hastighet som har det högsta värdet (RMax) för varje kurva. Om det finns fler än en RMax per sampling väljer du den som inträffar vid den tidigaste mättidpunkten.
- Beräkna förhållandet mellan RMax och medelvärdet av det tidsintervall vid vilket rMax inträffar: rate-koefficienten =
- Beräkna viknings skillnaden (FD) mellan koefficienten för salmonella och E. coli för varje sond.
- Överväg ett faldigt differensvärde som är högre än 3 som signifikant.
- Överväg de signifikanta sonderna med de högsta viknings differensvärdena (FD) som kandidat prober och som grund för biblioteks designen i nästa screening runda.
, där om är RFU vid maximal intervalltid och II är RFU vid minimal intervalltid, och TF och ti är de maximala och minimala intervall tids punkterna.
5. urvals kriterier för screening rundor (figur 1)
- Första omgången av screening
- Utför nukleasaktivitetstest (enligt beskrivningen i avsnitt 4) med hjälp av DNA, RNA och polynukleotidprober.
- Utvärdera preferensen för DNA-kemi eller RNA-kemi genom att jämföra antal och prestanda (FD-värde) av DNA-och RNA-kandidatsonder.
- Välj den typ av nukleinsyra kemi som gör det största antalet sökande sonder, som illustreras i figur 1.
- Andra omgången av screening
- Utför Nuclease Activity assay (som beskrivs i avsnitt 4) med hjälp av helt modifierade sonder och chimär sonder utformade baserat på nukleinsyra substrat som valts i den första screening rundan.
- Utvärdera preferensen mot sekvenser som innehåller 2 '-fluoro och 2 '-O-metyl nukleosidanaloger genom att jämföra de erhållna resultaten för 2 '-fluoro och 2 '-O-metyl-modifierade kandidat prober.
- Välj den typ av nukleosid analog modifiering som återger det största antalet sökande sonder, vilket illustreras i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar arbetsflödet för denna metodik, som är uppdelad i två screening rundor. I den första omgången av screening, vi använde 5 DNA sonder (DNA, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C och DNA Poly G) och även 5 RNA sonder (RNA, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C och RNA Poly G). Rådata från denna screening runda återfinns i tilläggstabell 1. I den andra omgången syntetiserades kemiskt modifierade sonder genom att ersätta RNA-sekvensen med kemiskt modifierade nukleosider (alla 2 '-fluoro och alla 2 '-OMethyl) eller genom kombinationen av RNA och puriner eller pyrimidiner kemiskt modifierade (RNA Pyr-2 ' F, RNA Pyr-2 ' Ome, RNA PUR-2 ' F och RNA PUR-2 ' ome). Rådata från denna screening runda återfinns i tilläggstabell 2. En detaljerad beskrivning av sekvenserna finns i tabell 1. Resultaten från den första screening rundan visas i figur 2, där salmonella Culture samman supernatanterna rapporterar en tydlig preferens för RNA-sonder över DNA-sonder. I kontrast, E. coli och kultur mediakontroller visar mycket begränsad förmåga att försämra RNA sonder. Dessutom har vi beräknat skillnaden (FD) mellan koefficienterna salmonella och E. coli (kompletterande tabell 3 och tilläggstabell 4) för att identifiera de bäst presterande sonderna. Beräkningarna utfördes enligt beskrivningen i avsnittet protokoll.
Dessa resultat tyder på närvaron av en RNase typ av verksamhet som härrör från salmonella. Baserat på identifieringen av RNA som den föredragna nukleinsyrasyp för salmonella -nukleaser har vi utformat ett nytt bibliotek med kemiskt modifierade nukleotider som ska användas i den andra omgången av screening som syftar till att öka specificiteten hos Sonder. Figur 3 visar de kinetiska profilerna för sonderna som innehåller kemiskt modifierade nukleotider. Intressant, RNA Pyr-2 ' ome och RNA PUR-2 ' ome Visa bäst presterande Kinetic beteende jämfört med RNA Pyr-2 ' f och RNA PUR-2 ' f, respektive.
Dessa resultat tyder på att salmonella har en viktig RNase aktivitet som kan användas för att välja sonder kan specifikt erkänna denna bakterier. Dessutom observerade vi att 2 '-OMe kemiskt modifierade nukleosider är mer lämpade för den typ av RNAses utsöndras av salmonella. Med detta i åtanke, det protokoll som beskrivs i detta bidrag ger möjlighet att utforska användningen av nukleasaktivitet som en biomarkör.
Figur 1: bakteriekulturer och arbetsflöde för screeningprocessen. Beredning av bakteriekulturer och samman supernatanterna (vänster). Beskrivning av arbetsflödet för de två screening rundorna. Första screening: preferensen för DNA eller RNA utvärderas med 10 sonder. Andra screening: baserat på nukleinsyra preferens, ytterligare sonder som innehåller kemiskt modifierade nukleotider utvärderas för att identifiera de bäst presterande substrat för en given nukleasaktivitet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: första kinetisk screening runda. Kinetic profiler av salmonella, E. coli och kultur media (TSB) med hjälp av DNA och RNA sonder. Nukleasaktiviteten representeras av relativa fluorescensenheter (RFU). Diagrammen är representativa för minst 3 individuellt utförda experiment. De olika exemplen är märkta som anges i diagrammets förklaring. Viknings skillnaden (FD) värden beräknades med hjälp av koefficienterna salmonella och E. coli för varje sond. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: den andra kinetiska screening rundan. Kinetic profiler av salmonella, E. coli och kultur massmedia (TSB) med hjälp av kemiskt modifierade sonder. Nukleasaktiviteten representeras av relativa fluorescensenheter (RFU). Diagrammen är representativa för minst 3 individuellt utförda experiment. De olika exemplen är märkta som anges i diagrammets förklaring. Viknings skillnaden (FD) värden beräknades med hjälp av koefficienterna salmonella och E. coli för varje sond. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: sekvenser av nukleinsyrningssond. Förteckning över alla nukleinsyrafavsonder som används i denna studie. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Mät uppsättning. Knapp klick och dialogfönster som beskriver den stegvisa processen som utförs i anskaffnings programmet för att ställa in de olika mätnings parametrarna. (A) skrivbordsikon. (B) dialogfönster för Aktivitetshanteraren. (C) förfarande och temperatur ställa in dialogfönster. (D) förfarande och Kinetic steg dialogfönster. (E) procedur och Läs metod dialogfönster. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2: mått uppsättning upp. Knapp klick och dialogfönster som beskriver den stegvisa processen som utförs i anskaffnings programmet för att ställa in de olika mätnings parametrarna. (A) dialog fönster för procedur och Läs steg (Kinetic). (B) förfarande dialogfönster (C) "Protocol" menyraden. (D) väl val dialogfönster. (E) inmatningsruta förfilnamn. (F) Kör ny ikon som används för att starta förvärvet inom programvaran. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande diagram 3: data analys. Knapp klick och dialogfönster som beskriver den stegvisa processen som utförs i förvärvs programvaran för att exportera förvärvade data till ett kalkylblad för vidare analys. (A) dialogfönster för plattmatris. (B) plåt och väl val dialogfönster. (C) skylt dialogfönster och snabb export kontextmeny. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 4: tredje screening rundan (sekvens preferens optimering). Beskrivning av de olika steg som ingår i en ytterligare screening runda som syftar till att bedöma sekvensvariationer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 5: fjärde screening rundan (specificitet utvärderings runda). Beskrivning av de olika steg som ingår i en ytterligare screening runda som syftar till att öka specificitet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 6: femte screening rundan (reaktions parameter optimering). Beskrivning av de olika steg som ingår i en ytterligare screening runda syftar till att minska icke-målkorreaktivitet genom att modulera nukleasaktivitet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggstabell 1: rådata från den första screening rundan. För varje sond (märkt i rött, överst) rapporterades anskaffnings tiden och råfluorescensvärdena för TSB, E. coli och salmonella, tillsammans med det beräknade värdet för varje intervall. Beräkningarna utfördes enligt beskrivningen i avsnittet metoder. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Tilläggstabell 2: rådata från den andra screening rundan. För varje sond (märkt i rött, överst) rapporterades anskaffnings tiden och råfluorescensvärdena för TSB, E. coli och salmonella, tillsammans med det beräknade värdet för varje intervall. Beräkningarna utfördes enligt beskrivningen i avsnittet metoder. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Tilläggstabell 3: data analys för den första screening rundan. För varje sond (märkt med rött, ovanpå) erhölls följande värden för TSB, E. coli och salmonella: maximivärden, minimala och maximala intervall tidpunkter, räntekoefficienten, vik skillnads värden mellan salmonella och e. coli över TSB och vik skillnad värden mellan salmonella och e. coli (markerade i gult). Beräkningarna utfördes enligt beskrivningen i avsnittet metoder och beräkningsformlerna och beräkningarna för steg för steg visas i kalkylarket. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Tilläggstabell 4: data analys för den andra screening rundan. För varje sond (märkt med rött, ovanpå) erhölls följande värden för TSB, E. coli och salmonella: maximivärden, minimala och maximala intervall tidpunkter, räntekoefficienten, vik skillnads värden mellan salmonella och e. coli över TSB och vik skillnad värden mellan salmonella och e. coli (markerade i gult). Beräkningarna utfördes enligt beskrivningen i avsnittet metoder och beräkningsformlerna och beräkningarna för steg för steg visas i kalkylarket. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förändringar av nukleasaktivitet har förknippats med en mängd olika sjukdoms fenotyper, inklusive olika typer av cancer och bakteriella infektioner. Dessa förändringar föreslås vara smittämnen av ett tillstånd14, medan de i andra fall är följden av en skadlig fysiologisk händelse20 eller patogena medel16,26. Inte överraskande, försök att använda nukleaser och nukleasaktivitet som en diagnostisk biomarkör har beskrivits15,22,23,26, med betydande löfte. Därför förefaller inrättandet av en robust och reproducerbar screeningmetod för systematisk utvärdering av nukleasaktivitet vid sjukdom och för identifiering av specifika och känsliga reporter relevant. För att ta itu med denna nödvändighet har vi utvecklat en robust, modulär och enkel att implementera screening plattform baserad på en fluorescensanalys, som möjliggör upptäckten av nya sjukdoms biomarkörer och identifiering av känsliga och specifika nukleinsyresonder i parallell, genom att använda katalytisk verkan av nukleaser.
Kraftfulla screening verktyg som små molekyl hög genomströmning screening (HTS)27, systematisk evolution av ligander med exponentiell berikning (Selex)28 eller fagdisplay29 har tidigare rapporterats, vilket gör att identifiering av hög affinitet erkännande molekyler (t. ex. små molekyler, aptamers eller bindning-peptider). I jämförelse, screeningmetod som presenteras här kan valet av sonder som kan identifiera kända och okända nukleasaktivitet. Detta tillvägagångssätt är dessutom förenligt med screening modellerna in vitro, ex vivo och in vivo. Dessutom ger den reaktiva karaktären av nukleaser en uppenbar fördel jämfört med ovan nämnda metoder, eftersom sonden-nukleasinteraktion inte är en statisk, utan en dynamisk process. Detta innebär att de nukleaser aktivitet blir en inneboende signal amplifiering modul för reporter sonder eftersom flera reporter sonder kan interagera med en enda Nuclease.
Liksom i alla andra screeningmetoder är generering och hantering av det ursprungliga biblioteket viktigt. Den typ av nukleinsyra sonder ger stor flexibilitet i utformningen och skapandet av ett bibliotek och möjliggör införandet av varierande grad av komplexitet beroende på screening ansökan. Bibliotekets komplexitet kan införas på olika nivåer, inklusive sekvensmotiv, nukleotidkemi, fosfat stamkemi och oligonukleotidlängd. Modulerande komplexiteten i biblioteket gör det möjligt att identifiera sonder, inte bara för deras förmåga att framgångsrikt identifiera nukleasaktivitet i samband med sjukdom utan även för egenskaper som är förenliga med efterföljande in vivo applikationer. Dessutom, en nukleinsyra bas bibliotek erbjuder flera fördelar jämfört med dess antikropp eller peptid motsvarigheter. Å ena sidan är produktionen av antikroppar väl känd för att vara besvärlig, vilket kräver djur eller komplexa eukaryota kultur system, vilket ökar kostnaden och introducerar batchvariationen30,31. Dessutom begränsar den höga molekylvikten och immunogeniciteten deras tillämpning28,32. Å andra sidan, generering av biologiska peptid bibliotek kräver vanligtvis antingen virus eller bakteriella uttrycks system29,30, öka komplexiteten i screeningprocessen. Kemisk peptid bibliotek undvika detta problem, på bekostnad av att använda invecklade pärla-baserade system eller flera omgångar av dyra peptid syntes33. Alla dessa problem kringgås genom att använda ett nukleinsyrafotek. När det ursprungliga biblioteket har upprättats är screeningmetoderna snabba och okomplicerade. Den metod som beskrivs häri fungerar som en plattform för ytterligare screening rundor, såsom, sekvens optimering (kompletterande figur 4), specificitet utvärdering (kompletterande figur 5) eller optimering av immunmodulerande vid delar av nukleasaktivitet, såsom metallkofaktorer (typiskt divalenta katjoner) och kelatorer, som är mycket användbara för att öka specificiteten hos de utvalda sonderna (kompletterande figur 6).
Den kinetiska fluorometriska analysen som används i denna studie kan optimeras för både, bakterie-och cellkulturer, med screening som utförs i användarvänliga mikrotiterplattor. När det gäller cellulära analyser, detta protokoll är förenligt med både, fjädring och enskiktslager kulturer, som, efter optimering, kan användas enligt nödvändigheter i in vitro-modellen studeras. Vi har identifierat flera kritiska steg som kräver optimering före screening. Dessa inkluderar cell nummer eller bakteriell densitet som skall analyseras, sond koncentration, fluorometer detektor få inställningar eller genomförandet av inbyggd bakgrundskorrigering metoder. En begränsning av denna teknik är behovet av en förändrad nukleasaktivitet i samband med den patologiska tillstånd av intresse. Utan denna funktion är screeningmetod för val av kandidat prober inte genomförbart. En annan begränsning är själv släckande förmåga guanines när de är i närheten av fluorophore. Denna egenskap måste beaktas vid utformningen av biblioteket.
Den enzymatiska karaktären hos den reaktion som mäts gör det nödvändigt att ta hänsyn till plåtens laddningstider. Minimering av laddningstider minskar bakgrunds skillnaderna mellan olika Försöksförhållanden. Det finns flera alternativ för att övervinna detta problem, såsom att bromsa den enzymatiska reaktionen vid lastning med hjälp av iskall reagenser, eller använda automatiserade lastningssystem, även om den senare ökar kostnaderna avsevärt, men också genomströmningen. Dessutom är kinetiska mätningar en stor förbättring jämfört med statiska mätningar, vilket ger en komplett och mer realistisk bild av dynamiken i nukleases katalytisk aktivitet.
Sammanfattnings, vårt protokoll erbjuder en mångsidig, robust och reproducerbar screeningmetod för identifiering av känsliga och specifika nukleinsyra sonder för detektion av nukleasaktivitet i samband med sjukdomen, som övervinner stora hinder av alternativa screeningmetoder. Vi räknar med att denna screening teknik kommer att möjliggöra utveckling av nya diagnostiska verktyg i en mängd olika förhållanden, med lätt översättbar till kliniken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Luiza I. Hernandez (Linköpings universitet) för hennes noggranna revidering av manuskriptet och värdefulla råd. Detta arbete stöddes av Knut och Alice Wallenbergs stiftelse och statens strategiska forskningsområde i materialvetenskap om avancerade funktionella material vid Linköpings universitet (fakultets bidraget SFO-mat-LiU nr 2009-00971).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black bottom, non-treated 96 well plate | Fisher Scientific | 10000631 | |
| Cytation1 | BioTek | CYT1FAV | |
| Eppendorf tubes | Thermofisher | 11926955 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Microbank cryogenic storage vial containing beads | Pro-Lab Diagnostics | 22-286-155 | |
| Nucleic acid probes | Biomers.net | # | |
| Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 | Gibco™ | 14040117 | |
| Salmonella enterica subs. Enterica | ATCC | 14028 | |
| Tris-EDTA | Fisher Scientific | 10647633 | |
| Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood | Thermo Fisher Scientific | 10362223 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma Aldrich | 22092 |
References
- Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).
- Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).
- Berends, E. T., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).
- Kiedrowski, M. R., et al. Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease. PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).
- Morita, C., et al. Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity. PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).
- Hasegawa, T., et al. Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes. Microbiology. 156, Pt 1 184-190 (2010).
- Moon, A. F., et al. Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae. Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).
- Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).
- McDermott-Roe, C., et al. Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function. Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).
- Wang, Y. T., et al. A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA. Cell Death & Disease. 7 (11), 2458 (2016).
- Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay. RNA. 24 (5), 739-748 (2018).
- Wan, L., et al. MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors. Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).
- Keyel, P. A.
- Hernandez, F. J., et al. Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe. Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).
- Flenker, K. S., et al. Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity. Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).
- Kannan, N., Eaves, C. J. Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis. Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).
- Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease. International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).
- Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines. European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).
- Fujibayashi, K., et al. Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction. Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).
- Kawai, Y., et al. Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction. Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).
- Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer. Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).
- Machado, I., et al. Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes. Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).
- Worthington Biochemical Corporation. Manual of Clinical Enzyme Measurements. , Worthington Diagnostics. (1972).
- Burghardt, E. L., et al. Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia. PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).
- Bibette, J.
- Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. Aptamers overview: selection, features and applications. Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).
- Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. Phage display: concept, innovations, applications and future. Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).
- Skerra, A. Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities. FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).
- Ku, T. H., et al. Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing. Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).
- Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).
- Gray, B. P., Brown, K. C. Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides. Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).
