Summary
我们描述了我们通过自噬和小鼠肝脏蛋白体体来测量蛋白质代谢的生物节律的规程。
Abstract
细胞采用多种方法来回收不需要的蛋白质和其他材料，包括脂质体和非脂质体通路。主要的脂质体依赖途径称为自噬，而蛋白质代谢的主要非脂质酶体方法是泛基蛋白-蛋白酶体系统。最近对模型生物体的研究表明，自噬和泛性蛋白酶体的活性在一天中不是恒定的，而是根据每日（循环）节律而变化的。测量蛋白质周转中生物节律的能力对于了解细胞质量控制是如何实现的以及了解特定感兴趣的蛋白质的动态非常重要。在这里，我们提出了一个标准化的协议，用于量化体内的自噬和蛋白酶体通量，捕获蛋白质周转的昼夜分量。我们的协议包括小鼠处理、组织处理、分馏和以小鼠肝脏为起始材料的自噬性通量定量的详细信息。
Introduction
昼夜节律是指生物功能中每天可预测的变化，这种变化在自然界中是明显的。它们存在于各种生物尺度上，从睡眠-觉醒周期等宏观行为，到生物分子的有节奏丰度等分子现象。近年来，对昼夜节律的研究已经因"时钟基因"的发现而改变，这些"时钟基因"对昼夜节律生成至关重要。对时钟基因敲除小鼠的研究表明，昼夜节律在时间组织核心细胞过程（如代谢1）中起着核心作用。昼夜节律使这一点发生的方式之一是赋予蛋白质代谢一个时间结构。
包括我们的几个组已经表明，细胞蛋白代谢、自噬和泛性蛋白-蛋白酶系统的两个主要途径，受日节律2，3，4，5。自噬代表蛋白质代谢的感其中体依赖性手臂，其中感兴趣的蛋白质通过构建新型囊泡（大自噬）或通过直接易位通过通道（卡佩罗内介自噬）6.泛性蛋白-蛋白酶体系统是主要的非脂生通路，其中蛋白质是多聚体，然后送入蛋白酶体，这是在整个细胞质和细胞核7、8中发现的大分子降解机。自噬和蛋白酶活动的节奏很重要，因为它们可能在细胞内务管理中发挥作用。因此，有一个标准化的程序，可以检测与临床前疾病模型兼容的蛋白质代谢的每日振荡是有价值的。
在这里，我们提供我们的协议，以量化小鼠肝脏中自噬性通量的日变化，这已成为我们实验室3、9工作的基础。我们的方法被归类为"周转测定"10，这是许多组用来测量蛋白解酶活性（或通量）的方法。在这种方法中，对小鼠施用特定于其体或蛋白酶体的蛋白酶抑制剂，然后在固定的时间间隔后获得组织样本。同时，组织样本从接受假注射的小鼠身上获得。组织样本均质化，然后进行生化分离，以获得体素富集和细胞质分。然后，使用特定于大自噬标记物（LC3b 和 p62）或蛋白酶基质（多聚体蛋白）的抗体，通过西方印迹对这些馏分进行并行分析。随着时间的推移，注射蛋白酶抑制剂的动物会积累通常被回收的蛋白质。因此，通过比较蛋白酶抑制剂处理样品中的标记蛋白的丰度与假处理的样品，可以推断出周转率。通过在一天的固定时间间隔重复此方法，可以重建蛋白解中的昼夜变化（图1A）。
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Protocol
这里描述的协议得到了华盛顿大学圣路易斯动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 鼠标外壳和实验设计
- 为了检测蛋白质周转量的日常节律，家鼠（雄性或雌性C57BL/6J，4~8周大，20~25克）在标准12小时明/暗周期下，提供食物。为了避免给动物造成压力，在使用前在设施中让小鼠适应至少一周，并避免使用单体。为了证明蛋白质代谢的节律是真正的昼夜（即由动物的内部生物钟驱动），在恒定的黑暗条件下，让小鼠在不断的黑暗条件下，注意避免让小鼠暴露在外源光下。
注：有关昼夜节律实验的小鼠外壳的详细信息，请参阅以下参考11。 - 对于每个时间点，为所使用的每种蛋白酶抑制剂分配三只小鼠作为假对照和至少三只小鼠（用于自噬性通量的白细胞素和用于蛋白酶益益体测量的bortezomib）。在日/夜周期中，以 4 小时间隔计划六个时间点，以获得组织样本。
注：24小时，6个时间点实验磷酸盐缓冲盐水（PBS），白细胞素，和博尔特佐米布将需要总共54小鼠（3个治疗x3个治疗x6个时间点）。
2. 为小鼠肝脏采集制备同质化溶液、抑制剂库存溶液和瓶
- 准备新鲜的均质缓冲液 （HB） 并保持在冰上： 10 mM Tris-HCl pH H H 7.5， 250 mM 蔗糖， 5 mM EDTA pH 8.0， 和 1 蛋白酶抑制剂片剂每 100 mL.
注：每只小鼠大约需要 10 mL 的 HB。 - 对于生物样品的下游处理，每个样品需要一个15 mL锥形管来容纳粗质质，一个15 mL管来容纳核后上清液，两个1.5 mL微离心管容纳3000 x g和20，000 x g颗粒材料，分别和一个1.5 mL的微离心管来容纳细胞质分数。在每个管中加入7 mL的冷HB，用于粗质化并保持在冰上。
- 在无菌PBS中制备2mg/mL的白蛋白硫酸盐液。还制备二甲基硫酸盐（DMSO）中的50mg/mL硼酸二甲苯溶液。将溶液储存在-80°C。
3. 蛋白酶抑制剂管理
- 解冻白蛋白（2毫克/mL）和bortezomib（50mg/mL）库存溶液，在每个时间点前15分钟至室温。柳肽库存已做好注射准备。在无菌PBS中稀释bortezomib，产生50μg/mL工作溶液。
注：Bortezomib 是光敏的，因此在使用前保护工作库存免受光线照射。 - 称量小鼠，并进行"沙姆"PBS（0.5 mL）、白蛋白（40毫克/千克）或bortezomib（1.6微克/千克）的腹内注射。将小鼠返回到按注射类型分组的适当标记的笼子。在标准化表中记录小鼠的处理或操作时间（请参阅补充文件"样本数据"）。
注：剂量计算器作为辅助工具包含在补充文件"样本数据"中。从时间点到时间点，快速、按相同顺序进行注射非常重要，以尽量减少可变性。
4. 组织采集和储存
- 注射后两小时，根据机构批准的IACUC协议，一次对小鼠实施安乐死。例如，麻醉小鼠，然后通过宫颈脱位安乐死。在安乐死后立即进入解剖步骤。
注：确保完成麻醉之前宫颈脱位，捏前爪没有可观察到的反射。 - 在小鼠腹腔上用Metzenbaum剪刀切开1.5至2.0厘米的切口，取出肝脏左叶。外化肝脏的左叶，用手术剪刀切除它。将肝脏样本浸入7 mL的冰冷HB中，在适当标记的15 mL锥形管中。在整个加工过程中将样品保存在冰上。
注：样品可在冰上保存，或在4°C处过夜，然后再继续。如果大自噬和蛋白酶体活性的标准标记是唯一的用途读出物，肝脏样本可以闪入液氮中，并储存在-80°C供日后处理。要检查其他降解目标（例如，通过蛋白质组学），无需冻结即可处理样品。 - 继续安乐死并解剖下一只小鼠，直到采集所有样本。以相同的组顺序处理小鼠，并记录此步骤的持续时间（参见补充文件"样本数据"）。每只小鼠应在5分钟内处理，以限制注射抑制剂的暴露时间差异。
5. 肝样生物化学分馏
注：图 1B显示了分馏方案。
- 将每个肝脏样本和 7 mL HB 转移到 15 mL 容量的量点均质器中。用 10 个松散活塞的冲程和 15 个紧活塞的冲程使样品均匀化。将产生的粗质均匀物返回到其来源的 15 mL 锥形管。重复，直到所有肝脏样本均质化。
- 在 700 x g下将原油均质样品在 4°C 下旋转 10 分钟，以颗粒核和碎屑。将核后上清液（S1）顶部4 mL转移到一个新的15 mL锥形管中。
- 根据制造商的说明，使用布拉德福德或双辛辛酸 （BCA） 测定分数S1的蛋白质浓度。接下来，根据需要将新鲜HB添加到S1中，将所有样品的浓度均衡至2.1mg/mL或所需浓度。归一化的样本是"总蛋白" （Tot） 分数.出于下游分析目的和质量改进，对托分数的等分 500 μL 并储存在 -80°C。
- 将剩余的1.5 mL的托分转入微离心管，在3，000 x g下旋转15分钟，在4°C下。将1 mL的上清液（S2） 转移到新鲜的微离心管，并设置在冰上。
- 吸出剩余的上清液，用1.5 mL的冷HB洗涤3，000 x g颗粒（3KP）。如果预期下游蛋白质组学，3KP颗粒可在-80°C干燥存储。如果只预期是西方印迹，则重新悬浮200 μL硫酸盐多丙烯酰胺聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）样品缓冲液（SDS-PAGE）样品缓冲液（SDS-PAGE）中的3KP颗粒，并在95°C下煮5分钟。
- 在 4°C 下以 20，000 x g旋转S2分数 20 分钟。将产生的上清液 （S3） 转移到新鲜的微离心管中.S3是细胞质 （细胞） 分数.对于 SDS-PAGE，将 150 μL 的细胞分数与 50 μL 的 4x SDS-PAGE 样品缓冲液结合，在 95°C 下煮 5 分钟。
- 从20，000 x g颗粒（20KP）中吸出剩余的上清液，用1.5 mL的冷HB洗涤两次。如果预期下游蛋白质组学，20KP颗粒可在-80°C干燥储存。如果只预计只有西方印迹，在 SDS-PAGE 样品缓冲液的 100 μL 中重新悬浮20KP颗粒，并在 95°C 下煮 5 分钟。
6. 西印读出
- 为了通过西方印迹量化大噬菌体和蛋白酶体通量，在1xSDS-PAGE样品缓冲液中组成纯化GST-LC3b（2微克/升）、p62-His6（2微克/mL）和Lys48链接多聚二醇素（K48-Ub，50微克/mL）的库存溶液。在95°C沸腾5分钟后，等分并储存在-80°C，以供将来使用。
- 在 SDS-PAGE 时，通过在 1x SDS-PAGE 样品缓冲液中连续稀释 1：3，生成标准蛋白混合物的 6 点标准曲线。将每个标准曲线样品的10μL加载到26口4~12%的SDS-PAGE中凝胶上，然后是预染色蛋白标准（材料表），一个商业分子量标准。
- 为了测量自噬通量，将12μL的3KP样品装入每个井中。
注：假设假，波特佐米布，和白蛋白治疗完成，并假设3小鼠每次治疗，每个时间点应该包括9个样本。因此，每个中凝胶可以容纳2个时间点加上标准曲线，典型的时间序列实验需要3个中凝胶来读出。 - 用于测量蛋白酶体通量，将 12 μL 的细胞分数加载到每个井中。
- 通过SDS-PAGE分离蛋白质样品，并使用标准协议转移到聚氯乙烯（PVDF）膜中。如果LC3b的西方印迹预计，转移凝胶使用20%含甲醇转移缓冲液。否则，使用10%含甲醇的转移缓冲液，这将使高分子量蛋白物种更有效地转移。
- 使用标准协议执行西方印迹。用于分析宏自噬性通量，含有3KP样品的血膜含有抗p62或抗LC3b抗体（1：1，000），在4°C过夜。用于分析蛋白酶体通量，含有具有抗Lys 48特异性多聚素素（1：1，000）的细胞样本的体膜在4°C过夜。
- 使用标准二级抗体和成像设备成像西部污点。将构成给定时间序列实验的所有膜一起成像。
7. 数据分析
注：请参阅补充文件"示例数据"。
- 要对西显影样品进行密度测定，请使用标准图形软件，图像工作室，或者图像J。
- 对标准曲线和实验样本的感兴趣波段执行密度测量。在 Image Studio 中，以 p62 为例，绘制一个长矩形，底部包含蛋白质单体并延伸到膜的顶部。复制、粘贴矩形并将其移动到其余示例。保持用于定量的矩形在样本之间保持一致非常重要。
- 按分析窗口右下角的"报表"和"启动电子表格"，将量化保存到电子表格中。
- 使用连续稀释的标准样本使用电子表格生成密度测量标准曲线，并使用线性或多项式回归获得最佳拟合标准曲线方程。使用此方程，推断实验样本中 p62、LC3b-II 或 Lys48-Poly Ub 的数量。
- 要获得通量测量，请从同一时间点的PBS样本的平均值中减去每个抑制剂处理样品的外推蛋白数量（参见补充文件"样本数据"）。
- 使用单向方差分析评估蛋白质周转量时态变化的统计显著性。这可以使用标准电子表格软件完成。
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Representative Results
具有代表性的数据如图2A，B所示，这些数据的量化在图2C，D中提供（另见补充文件"样本数据"）。 为简单起见，我们未在图 2中描述加载控件，但应并行获取这些控件。通常，针对β-actin的西方印迹用于此目的，但总蛋白染色（如庞梭S）就足够了。在任何特定时间点，自噬通量的主要读出是莱血素浓缩3KP分数除以2的脂蛋白处理与假样本之间的大自噬特异性标记量（p62或LC3b-II）的差异。蛋白酶抑制剂注射和组织收获之间的小时）。类似的数据可以从20KP样本中得到，这些样本也富含水相，但我们在小鼠肝脏的经验是，大多数信号在3KP分数中分离。通常，结果被归一化为平均值，从而简化了独立实验之间的比较（图2C，D）。蛋白酶体周转的主要读出是细胞体（"细胞"）部分中经bortezomib处理的bortezomib与假样本之间的Lys48-多聚酰亚基蛋白的量差异除以2。因为p62可以是大自噬和蛋白酶体3的目标，蛋白酶体通量的替代标记是p62含量+/-bortezomib在3KP分数的变化（见样本数据）。然而，我们发现该标记与Lys48-多聚酰化蛋白相比不太健壮，最好用作支持性数据。
图1：实验步骤和样品处理。（A） 测量小鼠肝脏中自噬和前体活动（通量）中每日节律的典型时间序列实验的原理图。（B） 获得乳液体富集和细胞肝蛋白馏分的分馏方案，用于西方斑点分析。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：通量的实验结果样本。西方的血泡从一个代表性的时间序列实验，以测量每日节律在自噬通量（A） 和鼠肝的蛋白酶体通量 （B）.请注意，在Leupeptin处理条件下，p62以大约50 kDa的单体形式到约250 kDa的SDS稳定复合物作为阶梯运行。一天中的时间是以时间单位 （ZT） 表示的，其中 ZT0 表示灯亮起，ZT12 表示熄灭。关灯期间掉落的观察时间为黑色。（C，D）这些数据的量化。每个数据点表示平均值 = SE （n = 3）。通过单向方差分析显示统计显著性。有关这些数据的表格表示形式，请参阅补充文件"示例数据"。请点击此处查看此图的较大版本。
补充文件：示例数据。密度测量数据的实验室分析和随后的统计分析。请点击此处下载此文件。
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Discussion
我们的协议描述了一种技术上简单的方法，使用常用的分子生物学设备测量小鼠蛋白质周转中的生物节律。由于时间序列实验的长度和所涉及的生物样本数量，因此在整个实验中，在小鼠的注射方式、组织采集的时间和生化处理方面保持一致非常重要。样品。注射、安乐死和宫颈脱位步骤可能需要操作员在开始全面实验之前进行练习。由于不同的个体以不同的速度解剖，因此最好由单个操作员进行所有组织解剖，但如果这不可行，则可能值得将蛋白酶抑制剂注射和组织收获之间的时间从 2 小时增加到 3 或 4 小时（前提是跨时间点一致地完成）。
排除故障的常见原因包括生物复制样品之间的通量变化，以及西方斑点质量差。关于样本变异性，这可能是由于使用具有不同解剖速度或经验水平的多个操作员。这可以通过执行实践实验来缓解，直到每只鼠标的平均解剖时间小于 5 分钟。或者，可以使用单个操作员进行解剖。西印体上的高背景可能由不均匀的转移、不充分的阻塞、低质量的原抗体或洗涤步骤不足引起。通过在含有转移缓冲液的10⁄20%甲醇中，通过隔夜湿透地将SDS-PAGE分离的蛋白质样品转移到PVDF，使用10%的脱脂干牛奶进行阻隔，并在台阶之间广泛清洗（机械摇臂至少3x 10分钟），可实现最佳效果。
此技术有几个限制。首先，所述协议需要大量的动物，因此资源密集。虽然最小时间序列实验跨越 24 小时，但至少 2 个周期的实验是确定蛋白质周转量中观察到的每日变化可重现的理想，以及用于估计节律特征（如周期性和阶段12）.由于蛋白酶抑制剂在小鼠施用和采集样本的时间之间必须经过一段时间（为了允许蛋白解靶量积累），因此获得的周转量测量表示 2 h 间隔内的平均活动而不是点估计。因此，该测定为检测蛋白质代谢的动态变化提供了分辨率的限制。最后，该协议针对小鼠肝脏进行了优化，此处介绍的生化分馏程序可能需要修改，以便从其他组织类型中有效地获得出的流体。
这是第一种直接测量自噬通量中每日节律的方法，也能够对这种现象进行全蛋白酶的观测。该技术的未来应用包括分析各种疾病模型中的蛋白溶酶节律，包括自身免疫性疾病、癌症和急性感染。在主要方法可以适应其他小鼠器官和人工样品，这代表了一个令人兴奋的未来应用与高转化潜力。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由RO1HL135846和儿童发展研究所赠款（PD-II-2016-529）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
References
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