Summary
هنا نقوم بوصف والتحقق من صحة طريقه لتوليد باستمرار قويه الإنسان المستحثة مستحث الخلايا الجذعية المشتقة عضلي وتميز وظيفتها. هذه التقنيات قد تساعد في تطوير البصيرة الميكانيكية في مسارات الإشارات ، وتوفير منصة للكشف عن المخدرات علي نطاق واسع ، ونموذج موثوق امراض القلب.
Abstract
وتوفر العضلي المشتقة من الخلايا الجذعية مستحث البشرية (iPSC-CMs) مصدرا بشريا قيما لدراسة العلوم الاساسيه لمعالجه الكالسيوم (Ca2 +) ومسارات الإشارات ، فضلا عن فحص العقاقير عاليه الانتاجيه واختبارات السمية. هنا ، نقدم وصفا مفصلا للمنهجيات المستخدمة لتوليد عاليه الجودة iPSC-CMs التي يمكن ان تتكاثر باستمرار الخصائص الجزيئية والوظيفية عبر خطوط الخلايا المختلفة. بالاضافه إلى ذلك ، يتم وصف أسلوب لتقييم التوصيف الوظيفي بشكل موثوق به من خلال تقييم خصائص التعامل مع Ca2 + . انخفاض الأكسجين (O2) الشروط ، واختيار اللاكتات ، والوقت لفترات طويلة في الثقافة تنتج عاليه النقاء وعاليه الجودة البطين مثل عضلي. مماثله لعضلي الفئران البالغين المعزولة (ARCMs) ، 3 أشهر من العمر iPSC-CMs يحمل اعلي Ca2 + السعه ، ومعدل أسرع من ca2 + امتصاص (تسوس تاو) ، واستجابه lusitropic ايجابيه لتحفيز β-الكظر مقارنه مع اليوم 30 ipsc-CMs. والاستراتيجية بسيطه من الناحية التقنية وفعاله من حيث التكلفة وقابله للتكرار. ويوفر منصة قويه لنموذج امراض القلب وللكشف عن المخدرات علي نطاق واسع لاستهداف Ca2 + التعامل مع البروتينات.
Introduction
الإنسان المستحث مستحث الخلايا الجذعية المشتقة عضلي (ipsc-CMs) هي منصة الإنسان جذابة لنمذجة مجموعه كبيره ومتنوعة من امراض القلب في المختبر1،2،3،4،5،6،7،8. وعلاوة علي ذلك ، يمكن استخدام ipsc-CMs للتنبؤ بردود المريض علي الادويه الجديدة أو القائمة ، لفحص مركبات الضرب ، وتطوير ادويه شخصيه جديده9،10. ومع ذلك ، وعلي الرغم من التقدم الكبير ، هناك حاجه إلى النظر في العديد من القيود والتحديات عند استخدام iPSC-CMs11. التالي ، طرق لتحسين بروتوكولات التمايز القلبي ، لتعزيز كفاءه ipsc-CMs والنضج ، وتوليد أنواع فرعيه عضله محدده (البطين ، الأذيني ، والعقدي) قد درست بشكل مكثف وأديت بالفعل إلى العديد من استراتيجيات الثقافة للتغلب علي هذه العقبات12،13،14،15.
وعلي الرغم من متانة هذه البروتوكولات ، فان أحد الشواغل الرئيسية لاستخدام الاتفاقية هو استنساخ الإجراءات الطويلة والمعقدة للحصول علي عضلي عاليه الجودة يمكن ان تضمن نفس الأداء والنتائج القابلة للتكرار. استنساخ أمر بالغ الاهميه ليس فقط عند مقارنه خطوط الخلايا مع الخلفيات الوراثية المختلفة ، ولكن أيضا عند تكرار المقارنات الخلوية والجزيئية لنفس خط الخلية. وقد يؤثر تباين الخلايا ، مثل الاختلافات الجيدة في كثافة iPSCs ، علي التمايز القلبي ، وتوليد غله منخفضه وعضلي رديئه النوعية. ويمكن استخدام هذه الخلايا لا يزال لتنفيذ التجارب التي لا تتطلب السكان نقيه من CMs (علي سبيل المثال ، عند تنفيذ Ca2 + القياسات عابر). في الواقع ، عند اجراء تحليل إلكتروفيزيولوجي ، فان غير CMs لن تهزم ، لا تلقائيا ولا تحت التحفيز الكهربائي ، لذلك سيكون من السهل استبعادها من التحليل. ومع ذلك ، بسبب نوعيه رديئه ، iPSC-CMs يمكن ان تظهر الخصائص الكهربية المتغيرة (علي سبيل المثال ، غير النظامية Ca2 + عابر ، منخفضه ca2 + السعه) التي ليست بسبب ماكياج الوراثية. ولذلك ، وخاصه عند استخدام iPSC-CMs لنموذج امراض القلب ، فمن المهم عدم الخلط بين النتائج من سم رديئه الجودة مع النمط الظاهري للمرض. تتطلب عمليات الفحص الدقيق والاستبعاد قبل الانتقال إلى الدراسات الكهربية الفسيولوجية.
وتتضمن هذه الطريقة بروتوكولات محسنه لتوليد عضلي عاليه النقاء وعاليه الجودة ولتقييم وظيفتها عن طريق اجراء قياسات Ca2 + عابره باستخدام نظام اكتساب الكالسيوم والانقباض والتحليل. هذه التقنية هي وسيله بسيطه ، ولكنها قويه ، للتمييز بين الكفاءة العالية والكفاءة المنخفضة iPSC-CM الاستعدادات وتوفير توصيف أكثر اهميه من الناحية الفسيولوجية للإنسان iPSC-CMs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت التجارب باستخدام عضلي الفئران الكبار في هذه الدراسة مع المعتمدة المؤسسات الرعاية الحيوانية والاستخدام البروتوكولات (IACUC) من المدرسة Icahn للطب في جبل سيناء. عزلت ال [جرذ عضلي] بالغه كان من [سبرغ] [ددلي] جرذ قلوب بالأسلوب [لنغندوف] يؤسس بما ان سابقا يوصف16.
1-اعداد وسائل الاعلام
- اعداد وسائل الاعلام hiPSC.
- تتوازن الملحق والمتوسطة القاعدية إلى درجه حرارة الغرفة (RT). تاكد من ان الملحق قد ذاب تماما. مزيج 400 مل من المتوسطة القاعدية و 100 مل من الملحق وتصفيه باستخدام فلتر الفراغ يحركها 0.22 μm. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية وتتوازن إلى RT قبل الاستخدام.
- اعداد RPMI + B27.
- تتوازن الملحق B27 والمتوسطة القاعدية (RPMI 1640) إلى RT. تاكد من ان الملحق قد ذاب تماما. مزيج 490 مل من المتوسطة القاعدية و 10 مل من الملحق 50x وتصفيه باستخدام فلتر فراغ يحركها 0.22 μm. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية وتتوازن إلى RT قبل الاستخدام.
- اعداد الانسولين RPMI + B27 (-).
- تتوازن B27 (-) الملحق الانسولين والمتوسطة القاعدية (RPMI 1640) إلى RT. تاكد من ان الملحق قد ذاب تماما. مزيج 490 مل من المتوسطة القاعدية و 10 مل من الملحق 50x وتصفيه باستخدام فلتر فراغ يحركها 0.22 μm. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية وتتوازن إلى RT قبل الاستخدام.
- اعداد وسائط الاختيار (RPMI (-) الجلوكوز + B27 + لاكتات).
- تتوازن الملحق B27 والمتوسطة القاعدية (RPMI 1640 (-) الجلوكوز) إلى RT. تاكد من ان الملحق قد ذاب تماما. مزيج 490 mL من المتوسطة القاعدية و 10 مل من الملحق 50x ، أضافه 4 اللاكتات الصوديوم التي تشكلت في المياه المعقمة ، وتصفيه باستخدام فلتر فراغ يحركها 0.22 μm. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية وتتوازن إلى RT قبل الاستخدام.
- اعداد RPMI 20.
- تتوازن المتوسطة القاعدية (RPMI 1640) إلى RT. مزيج مصل الأبقار الجنيني (التركيز النهائي 20 ٪) و RPMI. تصفيه باستخدام 0.22 μm فراغ مدفوعة فلتر وتخزين في 4 درجه مئوية. تتوازن إلى RT قبل الاستخدام.
- اعداد وسائل الاعلام المرور عن طريق أضافه رو المرتبطة ، ملفوف لفائف التي تحتوي علي البروتين كيناز (روك) المثبط (2 μM التركيز النهائي) لوسائل الاعلام hiPSC.
- اعداد D0 وسائل الاعلام عن طريق أضافه GSK-3 مثبطات ، CHIR 99021 إلى RPMI + B27 (-) وسائل الاعلام الانسولين (10 μM النهائي).
- اعداد D3 و D4 وسائل الاعلام عن طريق خلط RPMI + B27 (-) وسائل الاعلام الانسولين مع IWR-1 (5 μM النهائي).
ملاحظه: يتم تشكيل الوسائط D1 و D5 من RPMI + B27 (-) الانسولين. وتتكون وسائل الاعلام من الدالة دال-RPMI + B27. - اعداد حظر العازلة (2 ٪ الزلال المصل البقري [جيش صرب الجمهورية] ، 2 ٪ ، 0.05 ٪ NP-40 في الفوسفات-مخزنه المالحة [التلفزيونية العامة]): في أنبوب مخروطي 50 mL ، أضافه 1 غرام من جيش الصرب البوسني ، 1 مل من ، 49 مل من تلفزيوني ، و 250 μL من NP-40. اخلطه حتى يذوب تماما.
2. اعداد الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC)-لوحات مصفوفة المغلفة المؤهلة والشفتين
ملاحظه: تنفيذ كافة الخطوات تحت غطاء المحرك الثقافي تعقيم الانسجه.
- ذوبان الجليد المؤهلين الحل مصفوفة الأسهم بين عشيه وضحيها علي الثلج في 4 ° c. راجع ورقه مواصفات المنتج لتحديد وحدات التخزين المناسبة لان هذا قد يختلف اعتمادا علي المخزون. تخزين هذه قسامات في-20 درجه مئوية في 1.5 mL أنابيب الطرد المركزي الصغير.
- من أجل استخدام مصفوفة لوحات الطلاء أو الزجاج الشفتين ، أولا ذوبان الجليد من المصفوفة المؤهلة hESC في 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
- Aliquot 24 مل من الباردة دولبيكو المتوسطة النسر المعدلة (DMEM): مزيج المغذيات F-12 (DMEM/F: 12) وسائل الاعلام في أنبوب مخروطي 50 mL.
- اخلط الوسائط الباردة DMEM/F: 12 مع ماصه زجاجيه 2 مل من أجل تهدئه سطح الماصة.
- باستخدام نفس الماصة ، تناول ما يقرب من 500 − 700 μL من DMEM/F: 12 الباردة وتخلط مع المصفوفة المؤهلة hESC داخل أنبوب الطرد المركزي نفسه.
- مره واحده بشكل صحيح مختلطة ، نقل الحل إلى أنبوب مخروطي 50 mL التي تحتوي علي DMEM الباردة/F: 12 وتخلط مره أخرى.
- للوحه 6 القياسية جيدا ، أضافه 1 مل من هذا الخليط لكل بئر. التاكد من ان البئر مغطاه بالبالكامل. اترك الصفائح في RT تحت غطاء النسيج الثقافي لمده 30 دقيقه علي الأقل. إذا رغبت في ذلك ، تخزين في 4 درجه مئوية مباشره بعد الطلاء لمده تصل إلى 1 أسبوع و تتوازن إلى RT لمده 30 دقيقه قبل الاستخدام.
- من أجل استخدام لوحات ، ويستنشق المصفوفة واستبدال مع وسائل الاعلام المناسبة. استخدمه فورا.
- خزن الشفتين الزجاجيتين في بيئة معقمه (علي سبيل المثال ، داخل غطاء لزراعه الانسجه المعقمة).
- قبل طلاء ، ومسح كل كوفيرسليب الفردية مع 70 ٪ الايثانول. مره واحده في كوفيرسليب جافه ، وضعه داخل بئر من 6 لوحه جيده معقمه.
- خذ 250 − 300 μL من محلول مصفوفة المؤهل hESC والاستغناء بعناية مباشره علي مركز الزجاج المشبك. ترك الشفتين في RT تحت غطاء النسيج الثقافي لمده 30 دقيقه علي الأقل قبل الاستخدام.
3. اعداد جزيئات صغيره
ملاحظه: أعاده تشكيل جميع الجزيئات الصغيرة والمغيرون Wnt في DMSO ما لم يذكر خلاف ذلك.
- اعداد قسامات 10 ملم من 25 μl كل من iwr-1 و chir 99021 وتخزين في-20 درجه مئوية.
- أعاده تشكيل 10 ملم قسامات من 50 μl كل من thiazovivin (المانع روك) وتخزين في-20 درجه مئوية.
4. صيانة والمرور من iPSCs
ملاحظه: قم بتنفيذ كافة الخطوات التالية تحت غطاء للثقافة الانسجه المعقمة.
- الحفاظ علي iPSCs في القياسية 6 لوحات جيدا وتنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمه. الحفاظ علي الخلايا مع 2 مل من وسائل الاعلام hiPSC لكل بئر. تغيير الوسائط كل يوم. الحفاظ علي الخلايا في 37 درجه مئوية ، 6 ٪ س2، 5 ٪ CO2. مرور الخلايا عندما تكون بين 70 − 80 ٪ متموج.
- تتوازن تلفزيوني دون Ca2 + و Mg2 + إلى RT.
- لبدء عمليه المرور ، أضافه 1 مل من تلفزيوني دون Ca2 + و Mg2 + إلى البئر الذي يحتاج إلى ان يكون العبور. احتضان في RT لمده 7 − 10 دقيقه. تحقق من الخلايا تحت المجهر للتاكد من ان العلاج بالتليفزيون لم ينتج عنه تفكك كامل لطبقه الاحاديه.
- أزاله التلفزيونية واستبدال مع 1 مل من وسائل الاعلام passaging. استخدام رافع الخلية لكشط بلطف ورفع الخلايا من سطح البئر.
- الانفصال الميكانيكي للخلايا باستخدام ماصه زجاجيه معقمه 2 مل. كرر حتى يتم فصل الخلايا بشكل جيد بالتساوي في مستعمرات صغيره عندما لوحظ تحت المجهر.
- مره واحده وقد تم فصل الخلايا بما فيه الكفاية ، أضافه 5 مل من وسائل الاعلام العبور لتقسيم الخلايا 1:6. ضبط مقدار وسائط المرور التي ستتم اضافتها لمطابقه نسبه التقسيم المفضلة.
- يستنشق المصفوفة المؤهلة hESC من لوحه مصفوفة المغلفة المؤهلة hESC واستبدال مع 1 مل من وسائل الاعلام المرور لكل بئر. أضف 1 مل من الخلايا المنفصلة لكل بئر.
5. عضله التمايز
- استخدام خطوط hiPSC التي هي راسخة (أكثر من 20 الممرات) ويحمل المورفولوجية متجانسة قبل البدء في التمايز القلب.
- تاكد من ان iPSCs حوالي 70 − 80% متموج.
- غسل الخلايا 1x في التلفزيونية دون Ca2 + و Mg2 +.
- أضافه 2 مل من وسائل الاعلام D0 (الخطوة 1.7) لكل بئر ونقل الخلايا مره أخرى إلى الحاضنة.
- بعد 24 ساعة ، استبدل مع 3 مل من وسائل الاعلام D1 لكل بئر ل 48 h.
- في اليوم الثالث ، استبدل الوسائط ب 2 مل من الوسائط D3 لكل بئر. كرر مع الوسائط D4 في اليوم 4.
- في اليوم الخامس ، استبدل الوسائط بثلاثه مل من وسائل الاعلام D5 لكل بئر.
- في اليوم 7, استبدال وسائل الاعلام مع 3 مل من وسائل الاعلام السابعةوالثانيةلكل بئر ونقل إلى حاضنه مع 37 درجه مئوية, 5% CO 2, والعادي O2 تركيز. استبدل الوسائط الدالة 7 (RPMI + B27) كل يومين.
6. إجراءات الاختيار والتفكك iPSC-CM
- قبل عشره أيام من اجراء القياسات Ca2 + عابر أو اي تحليل وظيفي ، استبدل الوسائط Rpmi + B27 مع 3 مل من وسائل الاعلام الاختيار في بئر ل 48 h.
- استبدال وسائل الاعلام مع 3 مل من وسائل الاعلام الاختيار لأخر 48 h.
- استبدال وسائل الاعلام مع 2 مل من RPMI + B27 وسائل الاعلام في بئر لمده 24 ساعة.
- معطف معيار 6 لوحات جيدا كما هو موضح في القسم 2.
- أضافه 1 مل من العقيمة 0.25 ٪ التريبسين مع أدتا لكل بئر. احتضان لوحه في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
- باستخدام ماصه 1,000 μL ، الانفصال ميكانيكيا الخلايا بحيث يمكن رؤية خلايا واحده عندما لوحظ تحت المجهر.
- نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل معقمه وأضافه 2 مل من وسائل الاعلام RPMI 20 لكل بئر. الطرد المركزي لمده 5 دقائق في 800 x g.
- يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا في rpmi + B27 وسائل الاعلام. يستنشق المصفوفة المؤهلة hESC من لوحات واستبدال مع 1 مل من RPMI + B27 وسائل الاعلام.
- باستخدام طرف ماصه 1,000 mL ، الانفصال ميكانيكيا بيليه الخلية حتى يظهر الحل متجانسة.
- نقل تقريبا 500,000 خلايا إلى كل بئر. نقل إلى حاضنه لمده 24 ساعة.
- استبدال وسائل الاعلام مع 3 مل من وسائل الاعلام الاختيار لكل بئر ل 48 h.
- استبدال وسائل الاعلام مع 3 مل من RPMI + B27 لكل بئر. الحفاظ علي الخلايا في الوسائط المتعددة الوظائف (RPMI + B2 تغيير الوسائط كل يومين حتى تصبح جاهزه للتحليل الوظيفي.
7. اعداد iPSC-CMs لقياس التدفق الخلوي
- مره واحده في الخلايا هي من العمر المطلوب وخضعت لاختيار الأيض (القسم 6) ، وغسل الخلايا مع تلفزيوني دون Ca2 + و Mg2 +.
- أضافه 1 مل لكل بئر من التربسين 0.25 ٪ واحتضان لمده 5 − 7 دقيقه في 37 درجه مئوية.
- ماصه الخليط 5 − 10x مع تلميح P1000 لجعل الخلايا ، ونقل إلى أنبوب 15 مل يحتوي علي 2 مل من RPMI 20.
- تدور الخلايا في 600 x g لمده 5 دقائق.
- أضافه 100 μL من محلول التثبيت (4 ٪ PFA) إلى بيليه الخلية. أضافه الحل قطره مع المستمر ، والفورتكينغ لطيف ثم تعيين علي الجليد لمده 15 دقيقه.
- أضافه 1.5 mL من تلفزيوني. جمع الخلايا عن طريق طرد ويستنشق supernatant.
- لكل تجربه ، وتشمل واحده السيطرة غير ملون لكل حاله التثبيت/تخلل.
- أعاده التعليق الخلايا في 500 μL من الحل الحظر (2 ٪ الجيش الصربي البوسني/2 ٪ في الاذاعه التلفزيونية مع 0.1 ٪ NP-40) لمده 30 دقيقه في RT.
- دون أزاله الحل حجب ، أضافه الأجسام المضادة الاساسيه MLC2V/MLC2A (5 ملغ/مل) ، واحتضان 45 دقيقه في RT.
- غسل مع حجب العازلة. جمع الخلايا عن طريق الطرد والمحلول الطامح.
- أضافه الأجسام المضادة الثانوية اليكسا فلور 555/488 (1:750) المخفف في المخزن المؤقت لحجب لمده 45 دقيقه في RT أو بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
- أضافه 1.5 mL من تلفزيوني. جمع الخلايا عن طريق الطرد والمحلول الطامح.
- أعاده التعليق الخلايا في 250 − 300 μL من تلفزيوني. استخدم ماصه P1000 لتصنيف الخلايا.
- اعداد أنابيب أسفل الجولة مع 35 μm النايلون شبكه غطاء مصفاه الخلية. قبل الرطب مصفاه الخلية مع 50 μL من تلفزيوني وتعيين أنبوب علي الجليد.
- نقل الحل مع الخلايا المصنفة إلى أنابيب أسفل الجولة مع قبعات مصفاه الخلية. السماح للحل الخلية لاستنزاف بشكل طبيعي أو الاستفادة من الجزء السفلي من الأنبوب ضد سطح مستو ، حسب الضرورة ، لضمان الصرف الكامل وجمع الخلايا في الأنبوب. تاكد من وضع الأنبوب مره أخرى علي الجليد في أقرب وقت ممكن.
- شطف مصفاه الخلية مع 250 μL من تلفزيوني لاستعاده اي الخلايا المتبقية.
- الحفاظ علي الأنابيب علي الجليد وتغطيه مع رقائق ألومنيوم حتى تحليل تدفق الخلوي.
8. طلاء عضلي علي الزجاج الشفتين
ملاحظه: تنفيذ كافة الخطوات في بيئة معقمه.
- اعداد الشفتين الزجاجية كما هو موضح في الخطوات 2.10 و 2.11.
- وبمجرد اختيار iPSC-CMs وهي من العمر المطلوب ، اتبع الخطوات 6.5 − 6.7 للفصل بين iPSC-CMs.
- يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا في كميه كافيه من rpmi 20 وسائل الاعلام لديها ما يقرب من 300,000 الخلايا في 250 μl.
- باستخدام ماصه الزجاج 2 مل ، والانفصال ميكانيكيا بيليه الخلية حتى يظهر الحل متجانسة.
- يستنشق المصفوفة المؤهلة hESC من الشفتين.
- باستخدام ماصه 1000 μL ، مزيج وسحب 250 μL من الحل من أنبوب مخروطي 15 مل.
- ببطء الاستغناء عن 250 μL من الحل علي الشفتين الزجاج ، مع الحرص الزائد لأضافه فقط إلى المنطقة حيث الطبقة المؤهلة hESC الطلاء هو موجود.
- نقل بعناية إلى الحاضنة وترك بين عشيه وضحيها ، مع الحرص علي عدم هز أو انتشار الخلايا علي الشفتين. في صباح اليوم التالي ، أضافه بلطف 2 مل من الوسائط الدالة 7 (RPMI + B27) إلى كل بئر مع coverslip. تغيير وسائل الاعلام بعد 24 ساعة وكل يومين بعد ذلك.
9. تحديد الخلايا
- تاكد من ان كميه كافيه من التلفزيونية مع Ca2 + و Mg2 + معايرتها إلى 4 ° c.
- اعداد محلول بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) المخفف في الاذاعه التلفزيونية مع Ca2 + و Mg2 + و تتوازن إلى 4 ° c.
- مره واحده iPSC-CMs هي من العمر المناسب ، خضعت للاختيار الأيضي (القسم 6) ، وقد تم مطلي علي الشفتين (القسم 8) ، وغسل الخلايا 3x مع 1 مل من البرد التلفزيوني مع Ca2 + و Mg2 + لكل بئر.
- أضافه 1 مل من البرد 4 ٪ PFA وترك الخلايا في RT تحت غطاء محرك الساعة لمده 15 دقيقه.
- غسل الخلايا مع تلفزيونيه الباردة لأزاله PFA الزائدة.
- أضافه 2 مل من تلفزيوني مع Ca2 + و Mg2 + وتخزين في 4 ° c.
10. تلطيخ المناعي
- أزاله تلفزيوني من الخلايا الثابتة وأضافه 1 مل من حظر المخزن المؤقت. احتضان لمده 1 ساعة في RT.
- أزاله المخزن المؤقت حظر وأضافه الأجسام المضادة الاساسيه (5 ملغ/مل) المخفف في حظر العازلة. احتضان بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
- غسل 3x في التلفزيونية مع Ca2 + و Mg2 + لمده 5 دقيقه لكل منهما.
- أضافه الأجسام المضادة الثانوية المخفف في حظر المخزن المؤقت 1:1000.
- تغطيه لوحه مع رقائق ألومنيوم لحمايتها من الضوء واحتضان لمده 45 دقيقه في RT. الحفاظ علي رقائق ألومنيوم للخطوات التالية.
- غسل 3x في التلفزيونية مع Ca2 + و Mg2 +، 5 دقيقه لكل منهما.
- أضافه كميه كافيه من الحل DAPI العمل لتغطيه تماما الخلايا واحتضان في RT لمده 10 دقيقه.
- غسل العينة جيدا مع الاذاعه مع Ca2 + و Mg2 + لأزاله الزائدة dapi.
- اتخاذ الشرائح الزجاجية الجديدة وأضافه قطره من وسائل الاعلام المتصاعدة في الوسط. استخدام القطارة لنشر بالتساوي وسائل الاعلام المتصاعدة. وضع الشفتين مع الخلايا وجها لأسفل علي الشرائح.
ملاحظه: يمكن تخزين الخلايا لمده 30 يوما إذا كانت محمية من الضوء.
11. تقييم الكالسيوم داخل الخلايا2 + العابرون
- مره واحده iPSC-CMs هي علي الأقل 3 أشهر من العمر ، خضعت للاختيار الأيضي (القسم 6) ، وقد تم مطلي علي الشفتين ، وعلاج لهم مع 2 μL من Fura-2 ، AM (التركيز النهائي: 1 μM) واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 10 دقيقه.
ملاحظه: Fura-2 حساسة للضوء. تنفيذ جميع إجراءات التحميل والتجارب في الظلام. - اعداد نظام الحصول علي الكالسيوم والانقباض والتحليل.
- السلطة النظام ضمان ان يتم بدء تشغيل مصباح قوس (الشكل 1ب).
- مكان الغرفة علي النظام وربط الأنابيب من المضخة إلى مدخل المناسبة ومنافذ والأسلاك الكهربائية من المحفز إلى الغرفة كما هو مبين في الشكل 1ج.
- ملء أنبوب ترويه الذي يمتد من خلال سخان المضمنة فلويديك مع 37 درجه مئوية الحل تيرودي الحرارة المسبقة.
- ضبط الكاميرا وتاطير ابعاد الفتحة لتقليل مساحة الخلفية.
- جبل الزجاج كوفيرسليب مع ipsc-CMs في الغرفة وربط.
- أضافه 500 μl من الحل تيرودي مباشره علي راس الزجاج المثبتة بلطف والبدء النبض الغرفة (1.5 mL/min) مع حل تيرودي.
- بيس iPSC-CMs مع 1 هرتز التحفيز الميداني باستخدام محفز الكهربائية (10 فولت ، 4 مللي ثانيه).
- احتضان iPSC-CMs في الغرفة مع التحفيز لمده لا تقل عن 3 − 5 دقيقه للخلايا لغسل الصبغة Fura-2 والتكيف مع البيئة ويغسل صبغه الفلورسنت.
- اضبط نافذه العرض علي المنطقة العلوية اليسرى من الزجاج الزجاجي.
- أبدا التسجيل.
- بعد تجميع دفق متناسق من القمم من 5 − 10 ، انقر فوق إيقاف مؤقت لإيقاف التسجيل باستمرار.
- ضمان عدم تغيير التركيز ولا ابعاد نافذه العرض ، وتحريك مرحله المجهر إلى المنطقة المجاورة ، والتحرك نحو الطرف المعاكس ، واستئناف التسجيل.
- كرر الخطوات 11.9 و 11.10 للمسح الضوئي عبر المشبك ، والانتقال في البداية إلى اليسار ، ثم إلى أسفل في التعرج الأزياء لتغطيه منطقه كامل الشفة. هذا يتكون من 80 − 100 قياسات لكل coverslip.
ملاحظه: تقييد الوقت الإجمالي للقياس إلى 10 دقيقه كعوامل ثانويه تسبب انخفاضا في Ca2 + عابر. - مره واحده يتم الحصول علي Ca2 + العابرين, تحليل البيانات مع البرمجيات تحليل اثار مضان وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البروتوكول الموصوف في الشكل 1(ا ) ولد عضلي نقيه للغاية التي تكتسب النمط الظاهري البطين/البالغين مثل مع الوقت في الثقافة. كما تقييمها تلطيخ المناعي للأذيني والبطين ميوسين التنظيمية سلسله الضوء 2 اشكال الاسويه (MLC2A و MLC2V ، علي التوالي) ، وكانت غالبيه الخلايا المتولدة من هذا البروتوكول MLC2A ايجابيه في اليوم 30 بعد الاستقراء من التمايز القلبي ، فيحين أعرب عن MLC2V في كميات اقل بكثير في نفس الوقت نقطه ومع زيادة الوقت في الثقافة (اليوم 60 و 90) ، لوحظ تحول كامل في MLC2 ايزواشكال (MLC2A إلى MLC2V) (الشكل 2ا، ألواح السفلية). من أجل قياس الخلايا MLC2A و MLC2V الايجابيه ، تم اجراء تحليل التدفق الخلوي. وفقا للنتائج المناعية ، أظهرت بيانات التدفق الخلوي المرحلة المبكرة (اليوم 30) iPSC-CMs التي تعبر في الغالب عن MLC2A (29.8% MLC2A + مقابل. 1.9% MLC2V +) (انظر الشكل 2ب، اللوحة اليسرى) ، بالمقارنة مع المرحلة المتاخره (اليوم 90) ipsc-CMs ، والتي أعرب عنها في الغالب MLC2V (41.3% MLC2V + مقابل 16.7% MLC2A +) (انظر الشكل 2ب، اللوحة اليمني). لأنه من المعروف ان نمط التعبير من MLC2A و MLC2V هو السمة المميزة لتمايز القلب والنضج ، وهذه النتائج تشير إلى ان وقت الثقافة لفترات طويلة يزيد من نضوج iPSC-CMs وان معظم الخلايا يبدو ان تلتزم النمط الظاهري البطيني. ثم قمنا بتقييم الاعتماد علي الوقت من Ca2 + التعامل مع النضج. تم قياس Ca2 + عابر في Ipsc-CMs في أوقات التفريق الثلاثة (اليوم 30 ، 60 ، 90) ، المقارنة مع الفئران البالغة المعزولة عضلي (arcms). تم زيادة السعه Ca2 + بشكل ملحوظ في ipsc-CMs في اليوم 90 وكان مماثلا ل arcms (الشكل 3ا ، ب). وكان معدل Ca2 + امتصاص (تسوس-تاو) في اليوم 90 أسرع بكثير مقارنه مع اليوم 30 Ipsc-CMs ، وأقرب إلى arcms (الشكل 3ج). تم تقييم تاثير التحفيز β-الكظر علي Ca2 + العابرين من خلال علاج الخلايا مع 10 نانومتر من ايزوبروتيرينول (ISO) لمده 10 دقيقه في 37 درجه مئوية. كما لوحظ في ARCMs ، ISO زيادة كبيره Ca2 + عابر وتسارع معدل ca2 + الامتصاص في اليوم 90 ipsc-CMs. لم تلاحظ اي تغييرات في اليوم 30 iPSC-CMs (الشكل 3مد-واو). ومن المثير للاهتمام, اليوم 90 iPSC-CMs تمكنت من متابعه زيادة التحفيز الكهربائي (من 0.5 − 3 هرتز), بطريقه مماثله لتلك التي لوحظت في ARCMs (الشكل 4B). معا, هذه النتائج تظهر ان iPSC-CMs المستمدة من هذه الطريقة لها خصائص مماثله لتلك التي ينظر اليها في CMs الأصلي, علي وجه التحديد البطين مثل الظواهر, ناضجه Ca2 + خصائص المناولة, والردود الايجابيه β-ادريرجيك.
تلوث الخلايا غير القلبية قد تؤثر علي النضج الوظيفي للإنسان iPSC-CMs خلال التمايز17. يظهر الشكل 4a مقارنه بين الخلايا التي يبلغ عمرها 3 أشهر والتي تم الحصول عليها من الفروق عاليه الكفاءة (اللوحات العليا ، الفيديو 1) ، والتعبير بقوة عن علامة البطين المحددة (MLC2V) ، والخلايا التي يبلغ عمرها 3 أشهر والتي تم الحصول عليها من فروق كفاءه منخفضه ( ومن المثير للاهتمام ، أظهرت تحليل وظيفية غيرت Ca2 + العابرين في المختلطة ipsc-cms/غير cms اعداد مقارنه مع ipsc-cms من التمايز كفاءه عاليه. علي وجه الخصوص ، الخلايا التي تم الحصول عليها من الاختلافات الكفاءة المنخفضة أظهرت صغيره جدا Ca2 + السعه والتلقائية (الشكل 4ب، لوحه الأوسط) بالمقارنة مع النقي ipsc-CMs (الشكل 4ب، لوحه الأعلى) و اريتس (الشكل 4ب، لوحه أسفل). الاضافه إلى ذلك ، فان الخلايا المستمدة من فروق الكفاءة المنخفضة تعرض أنماطا الاضطرابه (الشكل 4ج).
من المهم ان نلاحظ ان iPSC-CMs المبينة في اللوحة العليا من الشكل 4ا خضع أيضا اختيار الأيض ، وهو خطوه هامه لزيادة إثراء السكان من ipsc-cms التي تستمد بالفعل من التمايز كفاءه عاليه. وتشير هذه البيانات إلى ان الكفاءة العالية بروتوكولات التمايز القلب التي تولد عاليه الجودة CMs ضرورية لتلخيص بدقه النمط الظاهري القلب في المختبر.
ويبين الشكل 5 الاختلاف في السعه2 + في جميع انحاء المناطق المختلفة لل CMs أحاديه الطبقة ، التي تم رسمها خلال دوره زمنيه من 1,200 s. وكانت السعه2 + السعه المقيسة في بداية تردد التحفيز 1 هرتز (200 s) متغيرة للغاية وأصبحت أكثر اتساقا مع استمرار التحفيز (200-900 ثانيه). ومع ذلك ، بعد فتره زمنيه من 900 s Ca2 + تم تخفيض السعه إلى حد كبير. وتشير هذه البيانات إلى انه عند تسجيل Ca2 + العابرين في ipsc-CMs ، فمن الضروري السماح للخلايا تستقر عند 37 درجه مئوية تحت التحفيز المستمر لما لا يقل عن 200 s. بالاضافه إلى ذلك ، يجب ان تقتصر التسجيلات علي نافذه زمنيه محدده (200-900 ثانيه) لضمان نتائج قابله للتكرار.
الشكل 1: الرسم التخطيطي العام لاعداد الاتفاقية الدولية للسلامة الiPCS-CMs والصكوك العابرة Ca2 + . (ا) تخطيط بروتوكول التمايز القلبي الذي يبين المراحل التنموية للتمييز بين السلاسل المتكاملة. شريط مقياس = 50 μm. (ب) نظام اكتساب وتحليل الكالسيوم والانقباض. ا) مضخة بيرياليتيك ب) المجهر المقلوب ج) مصدر الطاقة للكاميرا الرقمية د) الكهربائية محفز ه) الفلورية واجهه النظام و) فلتر عجله التحكم (ج) غرفه النظام. ا) هيئه غرفه النظام. ب) مدخل السوائل. ج) ماخذ السوائل. د) fluidic الحل المضمنة سخان. و) أقطاب ربط غرفه النظام إلى محفز الكهربائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مقارنه بين MLC2A و MLC2V التعبير في iPSC-CMs في أيام مختلفه من التمايز. (ا) تلطيخ المناعي من ipsc-CMs في اليوم 30 ، 60 ، و 90 بعد التعريفي التمايز ل MLC2A و MLC2V. شريط مقياس = 20 μm. (ب) تحليل التدفق الخلوي لل Ipsc-CMS ل MLC2V و MLC2A في 1 شهر و 3 أشهر التمايز بعد. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنه خصائص iPSC-CMs في أيام مختلفه من التمايز. (ا) ممثل Ca2 + اثار عابره في أيام مختلفه من التمايز. (ب-ج) متوسط Ca2 + السعه و ca2 + تسوس أثارت خلال التحفيز في 1 هرتز (د-و) تاثير ايزوبروتيرينول (ISO ، 10 نانومتر) العلاج في ipsc-CMs في أيام مختلفه من التمايز. تشير ARCMs عضلي الفئران المعزولة الكبار. N = 70 − 100 منطقه ؛ * ف < 0.05 ؛ p < 0.001 ، كما هو محدد من قبل الطالب t-اختبار. يتم تمثيل البيانات كما يعني ± S.E.M. الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: المقارنة بين الكفاءة العالية والفروق المنخفضة الكفاءة في iPSC-CMs. (ا) تلطيخ المناعي لل Ipsc-CMs ل αsma و MLC2V. شريط مقياس = 20 μm. (ب) الآثار التمثيلية التي تظهر Ca2 + العابرين من الكفاءة العالية (أعلاه) والكفاءة المنخفضة (المتوسطة) الاختلافات ، والفئران العضلية المعزولة الكبار (أدناه). وقد حفزت الخلايا العضلية في 0.5 هرتز ، 1 هرتز ، 1.5 هرتز ، 2 هرتز ، و 3 هرتز. (ج) التتبع التمثيلي الذي يظهر نمطا الاضطرابا من التمايز السيئ. تشير الأسهم إلى سرعه النقطة. يشير ARCMs إلى عضلي البالغين الفئران المعزولة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الاعتماد علي الوقت Ca2 + السعه من الشفة الواحدة. وقد تم رسم السعهالزائدة من المناطق المختلفة في المنطقة المختلطة بطريقه تعتمد علي الوقت. ويشار إلى الفترات الزمنيه غير الموصي بها لقياس Ca2 + عابر في المناطق المتقطعة (< 200 s أو > 900 s). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: فيديو تمثيلي يظهر مثالا علي التمايز عالي الكفاءة. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 2: فيديو تمثيلي يظهر مثالا لتمايز الكفاءة المنخفضة. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 3: فيديو تمثيلي يظهر مثالا علي توزيع أحادي الطبقة متجانس من iPSC-CMs علي الزجاج المشارك. يظهر هذا الفيديو كثافة الخلايا الموصي بها لاستخدامها في التحليل الوظيفي. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 4: فيديو تمثيلي يظهر مثالا للخلايا من تمايز الكفاءة المنخفضة المطلي بالزجاج الزجاجي. تم الحصول علي الخلايا في الفيديو من تمايز الكفاءة المنخفضة. وعاده ما لا يتم توزيع الخلايا من مثل هذه الاختلافات متجانسة عبر الشفتين ومن الصعب العثور علي خلايا الضرب باستمرار. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة لاستخدام الإنسان iPSC-CMs كنماذج تجريبية هي: 1) توليد عضلي عاليه الجودة (CMs) التي يمكن ان تضمن الأداء المتسق ونتائج استنساخه ؛ 2) السماح للخلايا لتنضج في الثقافة لمده لا تقل عن 90 يوما لتقييم ما يكفي من النمط الظاهري ؛ 3) أداء الدراسات الكهربية ، علي سبيل المثال الكالسيوم (Ca2 +) قياسات عابره ، لتوفير توصيف وظيفية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للإنسان Ipsc-CMs. قمنا بتطوير طريقه تمايز أحاديه الطبقات التي تنتج جوده عاليه مثل البطين iPSC-CMs. وتعتمد طريقتنا علي عده عوامل حاسمه وهي صيغه بديله للبروتوكولين الحاليين14و18. وخلافا لغيرها من البروتوكولات ، وهذا واحد يستخدم ظروف الأكسجين منخفضه (5 ٪ O2) للصيانة ipscs وكذلك خلال الأسبوع الأول من التمايز في CMs. مستويات منخفضه من الأكسجين تحاكي الحالة البيئية خلال نمو القلب الجنيني والجنيني19. كما ثبت ان ظروف نقص الأكسجين تزيد من انتشار iPSCs وتمايزها اللاحق إلى CMs20. كثافة البذر والسليم iPSCs المرور هي أيضا عوامل حاسمه لتمايز القلب ناجحه. لوحظت كفاءه عاليه التمايز عندما 70 − 80% متموج iPSCs يتم فصلها في المجاميع الخلية الصغيرة باستخدام محلول خال من الانزيمات ، والمصنفة بنسبه انقسام 1:6. يمكن ان تبدا التمايز القلبي عندما تصل الخلايا إلى كونفلوينسي من 70 − 80% ، ومن المتوقع بعد حوالي 4 أيام من الانقسام. CHIR99021 (10 μM) العلاج في بداية التمايز سوف يسبب موت الخلايا كبيره. ومع ذلك ، لوحظ انتشار الخلايا عند أزاله CHIR99021 من الثقافة في اليوم التالي. والتوازن الصحيح بين موت الخلايا وانتشارها ضروري للمحافظة علي ثقافة أحاديه الطبقة طوال التفريق ، وهو عامل هام آخر للتمييز الناجح. إذا كانت كثافة iPSC اما منخفضه جدا أو مرتفعه جدا ، فان التمايز اللاحق سيكون تمايزا في القلب منخفض الكفاءة (الشكل 4ا، الفيديو 2). ويبين الشكل 4الف مثالا لتمايز الكفاءة المنخفضة ، حيث تختلط العضلي المشتقة من متبرع سليم بأنواع خلايا أخرى ، مثل خلايا العضلات الموجبة الملساء α. الأهم من ذلك ، وأظهرت Ca2 + العابرين المسجلة من هذه الاستعدادات الخصائص المتغيرة ، مثل انخفاض ca2 + السعه وأنماط الاضطراب ، والتي يمكن بسهوله ان يساء تفسيرها باعتبارها التنوع البيولوجي. التمايز الناجح والعالي الكفاءة من نفس خط الخلية ، بدلا من ذلك ، ولدت سكان نقيه من عضلي مثل البطين (الشكل 4ا، الفيديو 1) جنبا إلى جنب مع Ca العادية2 + العابرين (الشكل 4ب، لوحه الأعلى). التالي ، فان نوعيه التمايز تلعب دورا هاما في الحجم الكلي ، والشكل ، وانتظام ، وتواتر Ca2 + عابر.
وثمة جانب هام آخر للتفرقة الناجحة والفعالة هو الحصول علي سكان عضلي الإثراء. في حين ان الخلايا الجذعية غير متمايزة وغيرها من أنواع الخلايا المشتقة iPSC استخدام الجلوكوز كمصدر للطاقة, CMs يمكن استخدام اللاكتات كفاءه لإنتاج ATP و الغلوتامات21. لذلك, [أين وردر تو] نلت حتى [بورير] السكان من [سم], مثقفه الخلايا في [لاكتات-كمل] و [جلوكوز-بورمس] ثقافة وسط. الزراعة iPSC-CMs في هذا الاختيار وسائل الاعلام لفتره طويلة ، ومع ذلك ، قد يؤدي إلى أعاقه وظيفية. لذلك ، لتنقيه iPSC-CMs ولا يزال الحفاظ علي وظيفتها ، يتم اجراء الاختيار الأيضي فقط لمده 10 أيام ، من أيام 80 − 90 منذ الاستقراء التمايز. بعد هذه الفترة ، يتم استبدال وسائط التحديد ، ويتم الاحتفاظ بالخلايا في وسائط RPMI/B27. في حين يمكن تنفيذ بروتوكول الاختيار في وقت سابق من ذلك بكثير22 (علي سبيل المثال ، حول اليوم 15) ، فانه من المستحسن ان ننتظر حتى اليوم 80 ، كما ان القيام بذلك يمكن ان يمنع ipscs المتبقية أو أنواع الخلايا الأخرى من التكاثر بحلول الوقت الخلايا جاهزه ل90 لدراسات الوظيفية ولذلك فمن الحيوي ان تؤخذ جميع العوامل المذكورة أعلاه في الاعتبار من أجل التفريق القلبي الناجح والفعال والقوي.
بالاضافه إلى متانة وكفاءه بروتوكولات التمايز القلبي ، والنضج ومواصفات نوع الخلية (علي سبيل المثال ، أنواع الخلايا الاذينيه والبطينية) تشكل أيضا تحديا كبيرا لاستخدام iPSC-CMs لنموذج امراض القلب. علي مدي السنوات القليلة الماضية, وقد تم الإبلاغ عن العديد من استراتيجيات النضج واعده, بما في ذلك التحفيز الكهربائي, تمتد الميكانيكية, وصلابة الركيزة23. ومع ذلك ، يستمر في الثقافة الانبوبيه لفتره طويلة من ipsc-CMs ان يكون نهجا بسيطا وعمليا لتوليد البالغين مثل عضلي24،25.
وتماشيا مع التقارير المنشورة الأخرى12، فان Ipsc-CMs المتولدة عن هذا البروتوكول التفاضلي في المختبر تظهر تعبيرا قويا عن MLC2V الخاصة بالبطين ومستويات اقل بكثير من MLC2A في اليوم 90 (الشكل 2ا ، ب). في حين ان CMs الجنينية تحتوي علي كل من MLC2A و MLC2V isoforms, البالغ CMs البطين تحتوي فقط MLC2V. يحدث هذا التبديل في انتشار ايزوفورم حركه تحرير الكونغو اثناء مرحله حديثي الولادة26.
عضلي التي تم إنشاؤها من خلال هذا البروتوكول علامة محدده البطين الصريح ، مثل MLC2V ، الذي يزيد تدريجيا في وفره حيث يتم الاحتفاظ الخلايا في الثقافة لفتره أطول (الشكل 2ا ، ب). وهذا يدل علي ان الثقافة لفترات طويلة في المختبر يعزز نضوج CMs التي يبدو انها ملتزمه النمط الظاهري البطيني.
الوقت في الثقافة يؤثر أيضا بشكل كبير Ca2 + التعامل مع نضوج24,25. وصفت التقارير السابقة انه بعد 20 يوما من الاستقراء التمايز ، لم تكن هناك تغييرات رئيسيه في احسب Ca2 + العابرين كما نمت الخلايا القديمة25. ومع ذلك ، فان العضلي المتولدة من البروتوكول المفصل هنا تظهر التغيرات التقدمية في Ca2 + السعه و ca2 + تسوس علي مدي النقاط الزمنيه الثلاثة التي تم تقييمها (30 ، 60 ، و 90 يوما بعد استقراء التمايز القلبي) (الشكل 3ا-ج). ومن المثير للاهتمام, هذه البيانات تظهر ان Ca2 + المعلمات عابر, مثل ca2 + السعه و ca2 + تسوس, تقاس في اليوم 90 ipsc-CMs كانت مشابهه لتلك التي تقاس في الفئران البالغة المعزولة عضلي (arcms). وعلاوة علي ذلك ، فان ال90 القديمة iPSC-CMs كانت قادره أيضا علي متابعه المحفزات الكهربائية المختلفة التي تتراوح بين 0.5 هرتز إلى 3 هرتز باستمرار ، علي غرار ARCMs (الشكل 4ب). في العمل في المستقبل ، سيكون من المثير للاهتمام ان نري كيف ان وقتا أطول حتى في الثقافة يؤثر علي الخصائص الوظيفية لهذه iPSC-CMs بالمقارنة مع ARCMs.
بالاضافه إلى ذلك ، منذ الإشارات مستقبلات β-الكظر يظهر نمط فروق نضج لدي مستقله تعتمد علي الوقت بعد الحث القلبي27، وقد تم اختبار تاثير ايزوبروتيرينول علي Ca2 + عابر في ipsc-CMs المتولدة من خلال هذا البروتوكول. التحفيز مع ايزوبروتيرينول أدت إلى استجابه lusitropic ايجابيه في اليوم 90 iPSC-CMs ، علي غرار ما لوحظ في ARCMs (الشكل 3مد-F).
التقييمات الوظيفية لل iPSC-CMs التي أجريت في هذه الدراسة لديها بعض الاختلافات والقيود بالمقارنة مع CMs الكبار المعزولة. الكبار CMs لديها جيدا--متطورة ومرتبه جيدا sarcomeres. وهذا يسمح لقياسات كونتراكتيليتي من خلال الكشف عن حركه ساركوميري. لان أيا من البروتوكولات الحالية توليد نضجت تماما, الكبار مثل iPSC-CMs, قياسات الانقباض من خلال الكشف ساركوميري ليست ممكنة. في حين انه من الممكن للكشف عن حركه حواف الخلية عندما عقود الخلية ، فانه من الصعب بشكل كبير لتتبع تلك الحركات بطريقه دقيقه في iPSC-CMs. وحتى الآن ، هناك حاجه إلى التطورات التكنولوجية للسماح لتقييمات دقيقه لانقباض في هذه الخلايا. من ناحية أخرى ، فمن الممكن لقياس Ca2 + العابرين من Ipsc-CMs باستخدام ca2 + مؤشر مثل fura-2. علي عكس CMs الكبار ، ومع ذلك ، يتم تجميع iPSC-CMs وليس لديها حدود محدده جيدا. ولذلك ، المرجع Ca2 + العابرين عاده لا تمثل خليه واحده ، ولكن بدلا من مجموعه من الخلايا في منطقه معينه. في حين انه من الممكن لضبط حجم المنطقة ، وتسجيل Ca2 + العابرين من خليه واحده هو تحديا لا يصدق. ومن الاهميه بمكان انه عندما يتم طلاء CMs علي الشفتين ، فان الكثافة هي التي تحقق توزيعا متجانسا أحادي الطبقة (فيديو 3) ، والذي يسمح بالعثور باستمرار علي المناطق مع الخلايا. إذا لم يتم توزيع الخلايا كطبقه أحاديه علي المشبك (الفيديو 4) ، ستكون هناك مناطق بدون خلايا ، وإذا تم فحص الشفة المختلطة خصيصا للمناطق التي بها خلايا نابضه لاجراء القياسات ، فان هذا يمكن ان يؤدي إلى "تحيز الاختيار". بدلا من اختيار منطقه محدده من خلايا الضرب ، فمن المستحسن لجمع البيانات من مناطق متعددة في جميع انحاء coverslip ، وهو أمر ممكن فقط عندما يتم توزيع الخلايا كطبقه واحده متجانسة. قياسات من 100 هذه المناطق المختلفة ، والتي تستغرق حوالي 10 دقيقه ، كافيه لتوفير خصائص وظيفية موثوق بها من الخلايا. وأخيرا ، وكما هو مبين في الشكل 5، تحتاج Ipsc-CMs إلى وقت للتكيف مع ظروف القياس. لقياسات موثوقه ، فمن المستحسن ان الخلايا يجب ان تستقر في ظروف القياس لمده لا تقل عن 3 دقائق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا البحث من قبل العلماء AHA منحه التنمية 17SDG33700093 (F.S.); جائزه الباحثين في جبل سيناء KL2 للتطوير الوظيفي للبحوث السريرية والانتقالية KL2TR001435 (F.S.) ؛ المعاهد القومية للصحة R00 HL116645 و AHA 18TPA34170460 (سي كي).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal | Sigma Aldrich | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti rabbit | Invitrogen | A21428 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| B27(-) insulin Supplement | Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DAPI nuclear stain | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook | Celltreat | 229306 | |
| Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well | Corning | 353046 | |
| Fluidic inline heater | Live Cell Instrument | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | Matrigel Matrix |
| hPSC media | Gibco | A33493-01 | StemFlex Basal Medium |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | EC-B25 | |
| MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody | Synaptic Systems | 311011 | |
| Myocyte calcium and contractility system | Ionoptix | ISW-400 | |
| Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane | ThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS with Calcium and Magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| PBS without Calcium and Magensium | Corning | 21-031-CV | |
| Premium Glass Cover Slips | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| StemFlex Supplement | Gibco | A33492-01 | |
| Thiazovivin | Tocris | 3845 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Tyrode's solution | Boston Bioproducts | BSS-355w | Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride |
References
- Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955 (2015).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Davis, R. P., et al. Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease. Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).
- Fatima, A., et al. In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).
- Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. eLife. 6, (2017).
- Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).
- Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery. Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).
- Youssef, A. A., et al. The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).
- Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Gorski, P. A., et al. Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro. Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).
- Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Patterson, A. J., Zhang, L. Hypoxia and fetal heart development. Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).
- Correia, C., et al. Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
- Hwang, H. S., et al. Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).
- Scuderi, G. J., Butcher, J.
- Jung, G., et al. Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).
