Summary
ここでは、堅牢なヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞を一貫して生成し、その機能を特徴付ける方法を記述し、検証する。これらの技術は、シグナル伝達経路に対する機械的洞察を開発するのに役立ち、大規模な薬物スクリーニングのためのプラットフォームを提供し、心臓疾患を確実にモデル化する。
Abstract
ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(iPSC-CM)は、カルシウム(Ca2+)の取り扱いとシグナル伝達経路の基礎科学、ならびに高スループット薬物スクリーニングおよび毒性アッセイを研究するための貴重なヒト源を提供する。ここでは、異なる細胞株間で分子的および機能的特性を一貫して再現できる高品質なiPSC-CMを生成するために使用される方法論について詳しく説明する。さらに、Ca2+処理特性の評価を通じて、その機能特性を確実に評価する方法について説明する。低酸素(O2)条件、乳酸選択、培養時間の延長は、高純度で高品質な心室様心筋細胞を産生する。孤立した成人ラット心筋細胞(ARCM)と同様に、3ヶ月齢のiPSC-CMは、より高いCa2+振幅、Ca2+再取り込み(減衰タウ)の速い速度、および30日目のiPSC-CMと比較してβアドレナリン刺激に対する陽性の潤滑反応を示す。この戦略は、技術的にシンプルで費用対効果が高く、再現可能です。それは心疾患をモデル化し、Ca2+処理タンパク質を標的とする大規模な薬物スクリーニングのための強いプラットホームを提供する。
Introduction
ヒト誘導性多能性幹細胞由来心筋細胞(iPSC-CM)は、インビトロ1、2、3、4、5、6、7、7、8で多種多様な心疾患をモデル化する魅力的なヒトベースのプラットフォームである。さらに、iPSC-CMは、新規または既存の薬剤に対する患者応答の予測、ヒット化合物のスクリーニング、および新しいパーソナライズされた薬剤9、10の開発に使用することができる。ただし、大幅な進歩にもかかわらず、iPSC-CM11を使用する場合は、いくつかの制限と課題を考慮する必要があります。その結果、心臓分化プロトコルを改善し、iPSC-CMの効率および成熟を高め、および特定の心筋細胞サブタイプ(心室、心房、および節点)を生成する方法は、強く研究され、すでにこれらのハードルを克服するための多数の培養戦略につながっている。
これらのプロトコルの堅牢性にもかかわらず、iPSC-CMの使用に関する主な懸念事項は、同じ性能と再現性を確保できる高品質の心筋細胞を得るための長くて複雑な手順の再現性です。再現性は、遺伝的背景の異なる細胞株を比較する場合だけでなく、同じ細胞株の細胞と分子比較を繰り返す場合にも重要です。iPSC密度の十分な違いのような細胞変動は、心臓分化に影響を与え、低収率および低品質の心筋細胞を生成する。これらの細胞は、CMの純粋な集団を必要としない実験を行うためにまだ使用することができ(例えば、Ca2+過渡測定を行う場合)。確かに、電気生理学的解析を行う場合、非CMは自発的にも電気刺激下でも打たないので、分析から除外するのは簡単です。しかし、品質が悪いため、iPSC-CMは、遺伝的構成によるものではない変化した電気生理学的特性(例えば、不規則なCa2+過渡性、低Ca2+振幅)を示すことができます。したがって、特にiPSC-CMを使用して心疾患をモデル化する場合、品質の悪いCMの結果と疾患表現型を混同しないことが重要です。電気生理学的研究に進む前に、慎重なスクリーニングと除外プロセスが必要です。
この方法には、高純度で高品質な心筋細胞を生成し、カルシウムおよび収縮性取得および分析システムを使用してCa2+過渡測定を行うことによってその機能を評価するための最適化されたプロトコルが含まれます。この技術は、高効率と低効率iPSC-CM製剤を区別し、ヒトiPSC-CMのより生理学的に関連する特性を提供する、シンプルでありながら強力な方法です。
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Protocol
本研究では、成人ラット心筋細胞を用いた実験は、シナイ山のイカーン医科大学の認可された動物ケア・利用委員会(IACUC)プロトコルを用いて行われた。成人ラット心筋細胞は、先に説明した16.ランゲンドルフベースの方法によりスプレイグ・ドーリーラット心臓から単離された。
1. メディアの準備
- hiPSC メディアを準備します。
- サプリメントと基礎培地を室温(RT)に平衡化する。サプリメントが完全に解凍されていることを確認します。.0.22μm真空駆動フィルターを使用して、基礎媒体の400mLとサプリメントとフィルターの100 mLを混合します。4°Cで保管し、使用前にRTに平衡化してください。
- RPMI + B27 を準備します。
- B27 サプリメントと基底媒体 (RPMI 1640) を RT に平衡化します。基底媒体の490 mLと50xサプリメントの10 mLを混合し、0.22μm真空駆動フィルターを使用してフィルタを行います。4°Cで保管し、使用前にRTに平衡化してください。
- RPMI + B27 (-) インスリンを準備します。
- B27 (-) インスリンサプリメントと基底培地 (RPMI 1640) を RT に平衡化します。基底媒体の490 mLと50xサプリメントの10 mLを混合し、0.22μm真空駆動フィルターを使用してフィルタを行います。4°Cで保管し、使用前にRTに平衡化してください。
- 選択媒体(RPMI(-)グルコース+B27+乳酸塩を準備する)
- B27 サプリメントと基底媒体 (RPMI 1640 (-) グルコース) を RT に平衡化します。基底培地の490mLと50xサプリメントの10mLを混合し、滅菌水に含まれる4mM乳酸ナトリウムを加え、0.22μm真空駆動フィルターを用いて濾過する。4°Cで保管し、使用前にRTに平衡化してください。
- RPMI 20を準備します。
- 基底培地(RPMI 1640)をRT.混合胎児ウシ血清(FBS)(20%最終濃度)とRPMIに平衡化する。0.22μm真空駆動フィルターを使用してフィルターをかけ、4°Cで保管してください。使用前に RT に平衡化します。
- rho-関連するコイルコイルを含む、プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤(2μM最終濃度)をhiPSCメディアに添加して、パセシング媒体を準備します。
- GSK-3阻害剤、CHIR 99021をRPMI+B27(-)インスリン媒体(10μM最終)に添加してD0媒体を調製する。
- RPMI + B27 (-) インスリン媒体と IWR-1 (5 μM 最終) を混合して、D3 および D4 メディアを準備します。
注:D1およびD5媒体はRPMI + B27(-)インスリンから構成される。D7媒体はRPMI+B27で構成される。 - ブロッキングバッファー(2%ウシ血清アルブミン[BSA]、2%FBS、リン酸緩衝生理食塩水中0.05%NP-40)を準備する:50mL円錐管に、BSA1g、FBSの1mL、PBSの49 mL、およびNP-40の250 μLを加える。完全に溶解するまで混ぜる。
2. ヒト胚性幹細胞(hESC)認定マトリックスコーティングプレートおよびカバースリップの調製
メモ:殺菌された組織培養フードの下ですべての手順を実行します。
- 4 °Cで氷の上で一晩hESC修飾マトリックスストック溶液を解凍します。在庫によって異なる場合があるため、製品仕様書を参照して適切なアリコート量を確認してください。これらのアリコートは、1.5 mLマイクロ遠心管に-20°Cで保管してください。
- コーティングプレートまたはガラスカバースリップのマトリックスを使用するために、まずhESC修飾マトリックスのアリコートを4°Cで30分間解凍します。
- 寒冷ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)のアリコート24 mL:50 mL円錐管に栄養混合F-12(DMEM/F:12)培地。
- 冷たいDMEM/F:12メディアを2mLガラスピペットと混ぜて、ピペットの表面を冷やします。
- 同じピペットを使用して、約500−700°Lの冷たいDMEM/F:12を取り出し、マイクロ遠心管自体のhESC修飾マトリックスアリコートと混合する。
- 適切に混合したら、冷たいDMEM/F:12を含む50 mL円錐形チューブに溶液を移し、再度混合します。
- 標準の6ウェルプレートの場合は、この混合物を各ウェルに1mL加えます。井戸が完全に覆われていることを確認します。プレートは、組織培養フードの下のRTに少なくとも30分間放置します。必要に応じて、めっき直後に4°Cで最大1週間保存し、使用前に30分間RTに平衡化してください。
- プレートを使用するために、マトリックスを吸引し、適切な媒体と交換します。すぐに使用してください。
- ガラスカバーリップを滅菌環境(例えば、滅菌組織培養フード内)に保管してください。
- コーティングの前に、個々のカバースリップを70%エタノールで拭いてください。カバースリップが乾いたら、滅菌6ウェルプレートの井戸の中に入れます。
- hESC認定マトリックス溶液の250-300°Lを取り、慎重にガラスカバースリップの中心に直接分配します。使用前に少なくとも30分間、組織培養フードの下のRTにカバーリップを残します。
3. 低分子の調製
注:特に明記されていない限り、DMSO内のすべての小分子およびWntモジュレーターを再構成します。
- IWR-1およびCHIR 99021のそれぞれ25°Lの10 mMアリコートを調製し、-20°Cで保存します。
- チアゾビビン(ROCK阻害剤)のそれぞれ50μLの10mMアリコートを再構成し、-20°Cで保存する。
4. iPSCのメンテナンスとパソエージング
メモ:滅菌組織培養フードの下で、以下のすべての手順を実行します。
- iPSCを標準の6ウェルプレートに維持し、滅菌条件下ですべてのステップを実行します。ウェルごとに 2 mL の hiPSC メディアを使用してセルを維持します。1 日おきにメディアを変更します。細胞を37°C、6%O2、5%CO2に保ちます。それらが70-80%のコンフルエントの間にあるときに細胞を通過させます。
- CA2+および Mg2+を使用せずに PBS を RT に平衡化します。
- パセパジングプロセスを開始するには、通過する必要があるウェルにCa2+とMg2+を含まないPBSを1mL加えます。RTで7-10分間インキュベートします。
- PBSを取り外し、1 mLの受撮メディアに交換します。セルリフターを使用して、井戸の表面から細胞をゆっくりと削り取り、持ち上げます。
- 滅菌2mLガラスピペットを使用して細胞を機械的に解解禁する。顕微鏡で観察すると、細胞が小さなコロニーに均等に解剖されるまで繰り返します。
- 細胞が十分に解解けたら、5 mLのパソジングメディアを加えた細胞を1:6に分割します。優先分割比に合わせて、追加する通過媒体の量を調整します。
- hESC認定マトリックスコーティングプレートからhESC認定マトリックスを吸引し、ウェルあたり1 mLの通過媒体に交換します。ウェルごとに解解剖細胞を1mL加えます。
5. 心筋細胞分化
- よく確立されたhiPSCライン(20以上の通路)を使用し、心臓分化を開始する前に均質な形態を示します。
- iPSC が約 70~80% のコンフルエントであることを確認します。
- Ca2+および Mg2+を使用せずに PBS で細胞を 1x 洗浄します。
- ウェルごとに2mLのD0メディア(ステップ1.7)を追加し、細胞をインキュベーターに戻します。
- 24 時間後、ウェルあたり 3 mL の D1 メディアを 48 時間交換します。
- 3 日目に、メディアをウェルごとに 2 mL の D3 メディアに交換します。4 日目に D4 メディアを使用して繰り返します。
- 5 日目に、メディアをウェルごとに 3 mL の D5 メディアに交換します。
- 7日目に、メディアをウェルあたり3mLのD7メディアに交換し、37°、5%CO2、および通常のO2濃度でインキュベーターに移します。D7 (RPMI + B27) メディアを 2 日ごとに交換します。
6. 選択手順とiPSC-CM解離
- Ca2+過渡測定または機能解析を実行する 10 日前に、RPMI + B27 メディアをウェルあたり 3 mL の選択メディアに 48 時間交換してください。
- メディアを3 mLの選択メディアに交換し、別の48時間交換してください。
- メディアを 24 時間、ウェルごとに 2 mL の RPMI + B27 メディアに交換します。
- コート標準6ウェルプレートは、セクション2で説明します。
- EDTAで滅菌0.25%トリプシンをそれぞれウェルに1mL加えます。プレートを37°Cで5分間インキュベートします。
- 1,000 μL ピペットを使用して、顕微鏡で観察したときに単一の細胞を見ることができるように、細胞を機械的に解解解します。
- 細胞を滅菌15 mL円錐管に移し、1ウェルあたり2mLのRPMI 20媒体を加えます。800 x gで 5 分間遠心分離機 .
- 上清を吸引し、RPMI+B27媒体中の細胞を再中断する。プレートからhESC修飾マトリックスを吸引し、RPMI + B27メディアの1 mLで交換します。
- 1,000 mL ピペットチップを使用して、溶液が均質に見えるまでセルペレットを機械的に解解解除します。
- 約 500,000 個のセルを各ウェルに転送します。24時間インキュベーターに移す。
- 48 時間、ウェルごとに 3 mL の選択メディアでメディアを交換します。
- メディアを 3 mL の RPMI + B27 ウェルに交換します。D7メディアで細胞を維持する(RPMI + B2は機能分析の準備ができるまで2日ごとにメディアを変化させる。
7. フローサイトメトリー用iPSC-CMの調製
- 細胞が所望の年齢であり、代謝選択を受けたら(セクション6)、Ca2+およびMg2+なしでPBSで細胞を洗浄する。
- トリプシン0.25%のウェルあたり1 mLを追加し、37°Cで5−7分間インキュベートします。
- P1000チップを用いて混合物を5-10xピペットして細胞を単数し、RPMI 20の2mLを含む15 mLチューブに転写する。
- 細胞を600 x gで5分間回転させます。
- 100 μL の固定液 (4% PFA) をセルペレットに追加します。連続的で穏やかな渦で溶液をドロップワイズに追加し、15分間氷の上に設定します。
- 1.5 mL の PBS を追加します。遠心分離によって細胞を収集し、上清を吸引します。
- すべての実験について、固定/透過条件ごとに1つの未染色制御を含めます。
- ブロッキング溶液の500°L(PBSでは2%FBS/2%BSA、0.1%NP-40)で細胞をRTで30分間再サスペンドします。
- ブロッキング溶液を除去することなく、一次抗体MLC2V/MLC2A(5mg/mL)を添加し、RTで45分間インキュベートする。
- ブロッキングバッファで洗浄します。遠心分離と吸引溶液によって細胞を収集します。
- 二次抗体Alexa Fluor 555/488(1:750)をRTで45分間、または4°Cで一晩のブロッキングバッファーで希釈して添加します。
- 1.5 mL の PBS を追加します。遠心分離と吸引溶液によって細胞を収集します。
- 250-300°LのPBSで細胞を再サスペンドします。P1000ピペットを使用して細胞を分解します。
- 35μmのナイロンメッシュセルストレーナーキャップで丸底チューブを準備します。50°LのPBSでセルストレーナーを事前に濡らし、チューブを氷の上にセットします。
- 分解したセルを含む溶液を、セルストレーナーキャップで丸底管に移します。細胞溶液を自然に排出するか、必要に応じて平らな表面に対してチューブの底部をタップして、チューブへの細胞の完全な排水と収集を確保します。チューブはできるだけ早く氷の上に戻してください。
- 250°LのPBSで細胞ストレーナーをすすいで、残留細胞を回収します。
- 氷の上のチューブを維持し、フローサイトメトリー分析までアルミニウム箔で覆います。
8. ガラスカバースリップへの心臓筋細胞のめっき
メモ:滅菌環境ですべての手順を実行します。
- 手順 2.10 および 2.11 の説明に従って、ガラスカバースリップを準備します。
- iPSC-CM を選択し、希望の年齢になったら、手順 6.5-6.7 に従って iPSC-CM の関連付けを解除します。
- 上清を吸引し、十分な量のRPMI 20媒体で細胞を再中断し、250μLあたり約30万個の細胞を有する。
- 2 mLガラスピペットを使用して、溶液が均質に見えるまで細胞ペレットを機械的に解解する。
- カバーリップからhESC修飾行列を吸引する。
- 1000 μL ピペットを使用して、15 mL 円錐管から 250 μL の溶液を混合および引き出します。
- 溶液の250°Lをガラスカバーリップにゆっくりと分配し、hESC認定マトリックスコーティングが存在する領域にのみ追加するように特別な注意を払います。
- インキュベーターに慎重に転送し、カバースリップ上の細胞を振ったり広げたりしないように注意して、一晩放置します。翌朝、カバースリップを使用して、D7(RPMI + B27)メディアをそれぞれウェルに2mL追加します。24 時間後、その後 2 日ごとにメディアを変更します。
9. セルの固定
- Ca2+および Mg2+を含む十分な量の PBS が 4 °C に平衡化されていることを確認します。
- Ca2+およびMg2+でPBSで希釈した4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を調製し、4°Cに平衡化する。
- iPSC-CMが適切な年齢になったら、代謝選択(セクション6)を受け、カバーリップ(セクション8)にめっきされ、Ca2+およびMg2+ウェルあたり1mLの冷たいPBSで細胞3xを洗浄します。
- 1 mL のコールド 4% PFA を追加し、フードの下の RT にセルを 15 分間残します。
- 冷たいPBSで細胞を洗い、余分なPFAを除去します。
- Ca2+と Mg2+で PBS を 2 mL 加え、4 °C で保存します。
10. 免疫蛍光染色
- 固定セルからPBSを取り出し、ブロッキングバッファを1mL追加します。RTで1時間インキュベートします。
- ブロッキングバッファーを取り除き、ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体(5mg/mL)を加えます。4°Cで一晩インキュベートする。
- CA2+と Mg2+を使用して PBS で 3x をそれぞれ 5 分間洗浄します。
- ブロッキングバッファー1:1,000で希釈した二次抗体を添加する。
- プレートをアルミホイルで覆い、光から保護し、RTで45分間インキュベートします。
- Ca2+と Mg2+を使用して PBS で 3x を洗浄し、それぞれ 5 分ずつ洗浄します。
- 十分な量のDAPI作業ソリューションを追加して細胞を完全に覆い、RTで10分間インキュベートします。
- Ca2+および Mg2+を使用して PBS でサンプルを十分に洗浄し、余分な DAPI を除去します。
- 新しいガラススライドを取り、中央に取り付けメディアのドロップを追加します。スポイトを使用して、取り付けメディアを均等に広げます。セルを下向きにしたカバースリップをスライドに置きます。
注:光から保護されている場合、セルは30日間保存することができます。
11. 細胞内Ca2+過渡の評価
- iPSC-CMが少なくとも3ヶ月齢になったら、代謝選択(セクション6)を受け、カバーリップにめっきされ、2μLのフラ-2、AM(最終濃度:1μM)で処理し、37°Cで10分間インキュベートします。
注:Fura-2は光に敏感です。暗闇の中ですべての読み込み手順と実験を実行します。 - カルシウムおよび収縮性の獲得および分析システムを準備する。
- システムに電源を入れるので、アークランプが始発していることを確認します(図1B)。
- 図1Cに示すように、システム上にチャンバーを配置し、ポンプから適切な入口およびコンセントと電線を刺激器からチャンバーに接続します。
- 流体インラインヒーターを通る灌流管を37°前温タイローデ溶液で充填します。
- カメラとフレーミングの絞り寸法を調整して、背景領域を最小限に抑えます。
- iPSC-CMを入れたガラスカバースリップをチャンバーに取り付け、固定します。
- 500 μLのタイローデ溶液を、固定ガラスカバースリップの上に直接加え、タイローデの溶液でチャンバー(1.5 mL/分)を浸透させ始めます。
- 電気刺激装置(10 V、4ミリ秒)を使用して、1 Hz場刺激を使用してiPSC-CMをペースします。
- 細胞がフラ-2色素を洗浄し、環境に適応し、蛍光色素を洗い流すために、少なくとも3〜5分間刺激を受けてチャンバー内のiPSC-CMをインキュベートします。
- ガラスカバースリップの左上の領域に表示ウィンドウを調整します。
- 記録を開始します。
- 5 ~10 の一貫したピークのストリームを収集したら、[一時停止]をクリックして録画を一時的に停止します。
- 視野の焦点も寸法も変更されないようにし、顕微鏡のステージを隣接する領域に移動し、反対側の端に向かって移動し、記録を再開します。
- 手順 11.9 と 11.10 を繰り返してカバースリップをスキャンし、最初は左に移動し、次にジグザグの方法で下方に移動してカバースリップ領域全体をカバーします。これはカバースリップあたり80-100の測定から成っている。
メモ:二次因子がCa2+過渡の減少を引き起こすため、合計測定時間を10分に制限します。 - Ca2+トランジェントを取得したら、製造元の指示に従って蛍光トレース分析ソフトウェアを使用してデータを分析します。
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Representative Results
図1に記載されたプロトコルは、培養中の時間とともに心室/成人様表現型を獲得する非常に純粋な心筋細胞を生成した。心房および心室ミオシン調節光鎖2アイソフォーム(MLC2AおよびMLC2Vそれぞれ)に対する免疫蛍光染色によって評価されたように、このプロトコルによって生成された細胞の大部分は、心臓分化の誘導後30日目にMLC2A陽性であったが、MLC2Vは同時にはるかに低い量で発現した(図2、トップパネル)。培養時間が長くなるにつれて(60日目と90日目)、MLC2アイソフォーム(MLC2A~MLC2V)の完全なスイッチが観察された(図2A、底部パネル)。MLC2AおよびMLC2V陽性細胞を定量するために、フローサイトメトリー分析を行った。免疫蛍光結果に従って、フローサイトメトリーデータは、主にMLC2A(29.8%MLC2A+対)を発現する初期段階(30日目)iPSC-CMを実証した。 1.9% MLC2V +) (図 2B、左パネルを参照) は、主に MLC2V (41.3% MLC2V + 対 16.7% MLC2A +) を表す後期 (90 日目) iPSC-CM と比較して、右パネルを参照)。MLC2AおよびMLC2Vの発現パターンは心臓分化および成熟の特徴であることが知られているため、これらの結果は、培養時間の延長がiPSC-CMの成熟を増加させ、大部分の細胞が心室表現型にコミットしているように見えることを示唆している。次に、Ca2+ハンドリング成熟の時間依存性を評価した。Ca2+一過性は、3つの分化時間(30日目、60日目、90日目)にiPSC-CMで測定し、単離された成人ラット心筋細胞(ARCM)と比較した。Ca2+振幅は、90 日目に iPSC-CM で大幅に増加し、ARCM に似ています (図 3A,B)。90日目のCa2+再取り込み率(減衰タウ)は、30日のiPSC-CMに比べて大幅に高速で、ARCMに近い(図3C)。Ca2+過渡に対するβアドレナリン刺激の効果は、37°Cで10分間10nMのイソプロテレノール(ISO)で細胞を処理することによってさらに評価した。ArcM で観察されているように、ISO は Ca2+過渡を大幅に増加させ、90 日の iPSC-CM で Ca2+再取り込みの速度を加速しました。30 日目の iPSC-CM に変化は認められなかった (図 3D-F)。興味深いことに、90日目のiPSC-CMは、ARCMで観察されるものと同様の方法で、増加する電気刺激(0.5-3 Hzから)に従うことができました(図4B)。これらの結果を見ると、この方法に由来するiPSC-CMは、ネイティブCM、特に心室様表現型、成熟Ca2+処理特性、および陽性βアドレナリン応答に見られる特性と同様の特性を有することが示されています。
非心細胞を汚染することは、分化17の間にヒトiPSC-CMの機能的成熟に影響を与える可能性がある。図4Aは、高効率分化(トップパネル、ビデオ1)から得られた3ヶ月前の細胞と、比心室マーカー(MLC2V)を堅牢に発現させる3ヶ月の細胞と、低効率分化から得られた3ヶ月前の細胞(下部パネル、ビデオ2)との比較を示し、α平滑筋アクチン(αSMA)陽性細胞と混合されたiPSC-CMを示す。興味深いことに、機能解析では、高効率の差別化からiPSC-CMと比較して、混合iPSC-CM/非CM調製におけるCa2+過渡現象の変化が実証されました。特に、低効率分化から得られた細胞は、純粋なiPSC-CMs(図4B、トップパネル)およびARVC(図4B、下部パネル)と比較して非常に小さいCa2+振幅および自動性(図4B、中間パネル)を示した。また、低効率分化からの細胞は不整脈パターンを呈した(図4C)。
図4Aのトップパネルに示すiPSC-CMも代謝選択を受け、すでに高効率な分化に由来するiPSC-CMの集団をさらに豊かにするための重要なステップであることに注意することが重要です。これらのデータは、高品質のCMを生成する高効率の心臓分化プロトコルが、インビトロで心臓表現型を正確に再現するために必要であることを示している。
図5は、1,200秒の経時にプロットされた、CM単層の異なる領域におけるCa2+振幅変動を示しています。1Hz(200秒)の刺激周波数の開始時に測定されたCa2+振幅は非常に可変的で、刺激が続くにつれ(200~900秒)一貫しました。しかし、900sの期間の後、Ca2+振幅はかなり減少した。これらのデータは、iPSC-CMでCa2+トランジェントを記録する場合、少なくとも200秒の一定の刺激の下で37°Cで細胞を安定化させる必要があることを示しています。
図1:iPCS-Cm調製およびCa2+過渡器械の全体的な概略図(A)iPSCを分化する発達段階を示す心臓分化プロトコルの概略図スケール バー = 50 μm。(B)カルシウム及び収縮性取得及び分析システム。a)ペリスタリティックポンプb) 反転顕微鏡c) デジタルカメラ用電源d) 電気刺激器e) 蛍光系界面f)フィルターホイールコントローラ (C) システムチャンバ.a)システムチャンバー本体。b)流体入口。c)流体出口。d)流体インライン溶液ヒーター。f)システムチャンバを電気刺激器に接続する電極。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:異なる分化日におけるiPSC-CMにおけるMLC2AおよびMLC2V発現の比較(A)MLC2AおよびMLC2Vの分化誘導後のiPSC-CMの免疫蛍光染色30、60、および90。スケール バー = 20 μm。(B)MLC2VおよびMLC2AのiPSC-CMのフローサイトメトリー分析を1ヶ月後および3ヶ月後の分化後。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 異なる日の差別化における iPSC-CM プロパティの比較(A)代表 Ca2+異なる分化日における一過性の痕跡。(B-C)平均Ca2+振幅およびCa2+減衰は、1Hzでの刺激中に誘発される(D-F)異分化の異なる日にiPSC-Cmにおけるイソプロテレノール(ISO、10 nM)処理の効果。ARCMは、単離されたラット成人心筋細胞を示す。N = 70−100の区域;*p < 0.05;p < 0.001、スチューデントのt検定によって決定される。データは平均 ± S.E.M. として表され、この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:iPSC-CMの高効率と低効率の差別化の比較(A)αSMAおよびMLC2Vに対するiPSC-CMの免疫蛍光染色スケール バー = 20 μm。(B)高効率(上)および低効率(中央)分化からのCa2+過渡を示す代表的な痕跡、および単離されたラット成人心筋細胞(以下)。筋細胞を0.5Hz、1Hz、1.5Hz、2Hz、および3Hz(C)代表的な微量で刺激し、悪い分化から不整脈パターンを示した。矢印はポイントペーシングを示します。ARCMは、単離されたラット成人心筋細胞を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:単一のカバースリップからの時間依存Ca2+振幅。カバースリップ内の異なる領域からのCa2+振幅は、時間依存的にプロットされた。Ca2+過渡を測定するための推奨されない期間は、破線領域 (<200 s または >900 s) で示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:高効率分化の例を示す代表的なビデオ。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ2:低効率分化の例を示す代表的なビデオ。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ3:ガラスカバースリップ上のiPSC-CMの均質な単層分布の例を示す代表的なビデオ。このビデオでは、機能解析に使用する推奨セル密度を示します。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ4:ガラスカバースリップにめっきされた低効率分化からの細胞の例を示す代表的なビデオ。ビデオ中の細胞は、低効率分化から得られた。このような分化の細胞は、通常、カバースリップ全体に均一に分布しておらず、一貫して拍動細胞を見つけることは困難である。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ヒトiPSC-CMを実験モデルとして使用するための重要なステップは:1)一貫した性能と再現性の高い結果を保証できる高品質の心筋細胞(CM)を生成する。2)細胞が少なくとも90日間培養中に成熟し、その表現型を十分に評価することを可能にする。3)電気生理学的研究を行い、例えばカルシウム(Ca2+)過渡測定を行い、ヒトiPSC-CMの生理学的に関連する機能特性を提供する。高品質な心室状iPSC-CMを生み出す単層ベースの分化法を開発しました。私たちの方法は、いくつかの重要な要因に依存し、既存のプロトコル14、18の変種です。他のプロトコルとは異なり、これはiPSCメンテナンスだけでなく、CMへの彼らの分化の最初の週の間に低酸素条件(5%O2)を使用し、酸素の低レベルは胚および胎児の心臓発達中の環境状態を模倣する19。低酸素状態はまた、iPSCの増殖とその後のCM20への分化を増加することが示されている。播種密度と適切なiPSC通過も、心臓分化を成功させるための重要な要因です。70~80%のコンフルiPSCが酵素フリー溶液を用いて小細胞凝集体に解離し、分割比1:6で播種すると、高い分化効率が認められる。心臓分化は、細胞が70−80%の合流性に達したときに開始することができ、分裂後約4日後に予想される。分化の開始時のCHIR99021(10μM)治療は、有意な細胞死を引き起こす。しかし、次の日に培養からCHIR99021を除去すると細胞増殖が観察される。細胞死と増殖の正しいバランスは、分化を通じて単層培養を維持するために不可欠であり、これは差別化を成功させるためのもう一つの重要な要素である。iPSC 密度が低すぎるか高すぎる場合、その後の差別化は低効率の心臓分化になります (図 4A、ビデオ 2)。図4Aは、健康なドナーに由来する心筋細胞がα平滑筋アクチン陽性細胞などの他の細胞型と混合される低効率分化の例を示す。重要なことに、このような調製物から記録されたCa2+過渡は、低Ca2+振幅および不整脈パターンなどの変化した特性を示し、生物学的変動と誤解釈され得る。同じ細胞株との間で成功し、高効率の分化は、代わりに、通常のCa2+トランジェントと共に心室様心筋細胞(図4A、ビデオ1)の純粋な集団を生成した(図4B、トップパネル)。したがって、分化の品質は、Ca2+過渡の全体的な大きさ、形状、規則性、および周波数において重要な役割を果たします。
成功し、効率的な分化のもう一つの重要な側面は、心筋細胞の豊富な集団を得ることです。未分化幹細胞および他のiPSC由来細胞型はエネルギー源としてグルコースを使用するが、CMはATPおよびグルタミン酸産生21のために乳酸を効率的に使用することができる。したがって、CMのより純粋な集団を得るために、細胞は乳酸補充およびグルコース枯渇培養培地で培養される。しかし、この選択メディアでiPSC-CMを長期間培養すると、機能障害を引き起こすことがある。したがって、iPSC-CMを精製し、その機能を維持するために、代謝選択は分化誘導以来80〜90日から10日間のみ行われる。この期間が経過すると、選択メディアが置き換えられ、セルは RPMI/B27 メディアに維持されます。選択プロトコルは、はるかに早い22(例えば、15日目)に実装することができますが、そうすることで、細胞が機能研究の準備が整うまでに残留iPSCまたは他の細胞タイプが増殖するのを防ぐことができますので、80日目まで待つことをお勧めします(90日目)。したがって、成功し、効率的で、堅牢な心臓分化のために、上記のすべての要因が考慮されることが重要です。
心臓分化プロトコルの堅牢性と効率性に加えて、成熟および細胞型の仕様(例えば、心房および心室細胞型)は、iPSC-CMを使用して心疾患をモデル化するための大きな課題でもあります。ここ数年、電気刺激、機械的ストレッチ、基板剛性23など、多くの有望な成熟戦略が報告されている。しかしながら、iPSC-CMの長期にわたるインビトロ培養は、成人様心筋細胞24、25を生成するためのシンプルで実用的なアプローチであり続ける。
このインビトロ分化プロトコルによって生成された他のパブリッシュされたレポート12と一致して、このインビトロ分化プロトコルによって生成された iPSC-CM は、心室特異的 MLC2V の堅牢な発現と、90 日目の MLC2A のはるかに低いレベルを示します (図 2A,B)。胎児CMにはMLC2AとMLC2Vアイソフォームの両方が含まれていますが、成人心室CMにはMLC2Vのみが含まれています。MLCアイソフォームの有病率におけるこのスイッチは、新生児ステージ26の間に起こる。
このプロトコルを介して生成される心筋細胞は、MLC2Vのような心室特異的マーカーを発現し、細胞が培養期間を長く保たれるにつれて徐々に豊富に増加する(図2A,B)。これは、長時間のインビトロ培養が、心室表現型にコミットされているように見えるCMの成熟を高めることを示している。
培養時間もCa2+ハンドリング成熟24、25に大きな影響を与えます。以前の報告では、分化誘導の20日後に、細胞が25歳になるにつれて、カルクCa2+トランジェントに大きな変化はなかったと述べた。しかしながら、ここで詳述するプロトコルから生成された心筋細胞は、評価された3つの時点にわたるCa2+振幅およびCa2+崩壊の進行性変化を示す(30、60、および90日後の心臓分化の誘導後)(図3A-C)。興味深いことに、これらのデータは、Ca2+振幅やCa2+減衰などのCa2+過渡パラメータが90日目に測定され、単離されたラット成人心筋細胞(ARCM)で測定されたものと類似していることを示しています。さらに、90日前のiPSC-CMは、ArcMと同様に、0.5Hzから3Hzまでの様々な電気刺激に一貫して従うことができました(図4B)。今後の作業では、培養時間がさらに長いことが、ARCMと比較してこれらのiPSC-CMの機能特性にどのような影響を与えるかが興味深いでしょう。
さらに、βアドレナリン受容体シグナル伝達は、心臓誘導27後に明確な時間依存的な合致パターンを示すので、このプロトコルを介して生成されたiPSC-CmにおけるCa2+過渡性に対するイソプロテレノールの効果が試験された。イソプロテレノールによる刺激は、90日目のiPSC-CMにおける陽性の潤滑反応を引き起こし、ARCMで観察されるものと同様である(図3D-F)。
この研究で行ったiPSC-CMの機能評価には、孤立した成人用CMと比較していくつかの違いと制限があります。大人のCMは、よく発達し、よく配置されたサルコメアを持っています。これはサルコメア動きの検出によって収縮の測定を可能にする。現在のどのプロトコルも完全に成熟した成人型iPSC-CMを生成しないため、サルコメア検出による収縮測定は実現不可能です。細胞が収縮する際に細胞エッジの動きを検出することは可能ですが、iPSC-CMでそれらの動きを正確に追跡することは非常に困難です。現時点では、これらの細胞における収縮性の正確な評価を可能にするために、技術の進歩が必要である。一方、フラ-2のようなCa2+指標を用いてiPSC-CMのCa2+過渡を測定することが可能です。ただし、大人の CM とは異なり、iPSC-CM はクラスタ化されており、境界線が適切に定義されていません。したがって、記録されたCa2+トランジェントは、通常、単一のセルを表すのではなく、特定の領域内の細胞のグループを表す。エリアサイズを調整することは可能ですが、単一のセルからCa2+トランジェントを記録することは非常に困難です。CMをカバーリップにめっきすると、密度は均質な単層分布(ビデオ3)を達成し、細胞を持つ領域を一貫して見つけ出すことができるようにすることが重要です。セルがカバースリップ上の単層として分布していない場合(ビデオ4)、セルのない領域があり、カバースリップが測定を実行するために拍動細胞を持つ領域に対して特別にスクリーニングされる場合、これは「選択バイアス」につながる可能性があります。拍動細胞の特定の領域を選択する代わりに、カバースリップ全体の複数の領域からデータを収集することをお勧めします。100のそのような異なる領域からの測定は、約10分かかる、細胞の信頼性の高い機能特性を提供するのに十分である。最後に、図 5に示すように、iPSC-CM は測定条件に合わせて調整する時間が必要です。信頼性の高い測定を行う場合は、少なくとも3分間の測定条件で細胞を安定させる必要があります。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この研究は、AHA科学者開発助成金17SDG3700093(F.S.)によって支援されました。マウントシナイKL2学者賞臨床および翻訳研究キャリア開発KL2TR001435(F.S.);NIH R00 HL116645 および AHA 18TPA34170460 (C.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal | Sigma Aldrich | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti rabbit | Invitrogen | A21428 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| B27(-) insulin Supplement | Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DAPI nuclear stain | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook | Celltreat | 229306 | |
| Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well | Corning | 353046 | |
| Fluidic inline heater | Live Cell Instrument | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | Matrigel Matrix |
| hPSC media | Gibco | A33493-01 | StemFlex Basal Medium |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | EC-B25 | |
| MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody | Synaptic Systems | 311011 | |
| Myocyte calcium and contractility system | Ionoptix | ISW-400 | |
| Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane | ThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS with Calcium and Magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| PBS without Calcium and Magensium | Corning | 21-031-CV | |
| Premium Glass Cover Slips | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| StemFlex Supplement | Gibco | A33492-01 | |
| Thiazovivin | Tocris | 3845 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Tyrode's solution | Boston Bioproducts | BSS-355w | Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride |
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