Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Generation af ventrikulær-lignende HiPSC-afledte Kardiomyocytter og høj kvalitet celle præparater til calcium håndtering karakterisering

Published: January 17, 2020 doi: 10.3791/60135
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Her beskriver og validerer vi en metode til konsekvent at generere robuste menneskeskabte pluripotente stamcelle afledte kardiomyocytter og karakterisere deres funktion. Disse teknikker kan hjælpe med at udvikle mekanistisk indsigt i signalering veje, give en platform for storstilet Drug screening, og pålideligt model hjertesygdomme.

Abstract

Human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter (iPSC-CMs) give en værdifuld menneskelig kilde til at studere den grundlæggende videnskab om calcium (ca2 +) håndtering og signalering veje samt høj-gennemløb Drug screening og toksicitet assays. Heri giver vi en detaljeret beskrivelse af de metoder, der anvendes til at generere iPSC-CMs af høj kvalitet, der konsekvent kan gengive molekylære og funktionelle egenskaber på tværs af forskellige cellelinjer. Desuden beskrives en metode til pålideligt at vurdere deres funktionelle karakterisering gennem evaluering af ca2 + håndterings egenskaber. Lav ilt (O2) betingelser, laktat udvælgelse, og langvarig tid i kulturen producerer høj renhed og høj kvalitet ventrikulær-lignende kardiomyocytter. Svarende til isolerede voksne rotte kardiomyocytter (ARCMs), 3-måneders-gamle iPSC-CMs udviser højere ca2 + amplitude, hurtigere hastighed på ca2 + reuptake (forfald-Tau), og en positiv lusitropic respons på β-adrenerge stimulation sammenlignet med dag 30 IPSC-CMS. Strategien er teknisk enkel, omkostningseffektiv og reproducerbar. Det giver en robust platform til at modellere hjertesygdomme og til storstilet Drug screening for at målrette ca2 + håndtering proteiner.

Introduction

Human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter (IPSC-CMS) er en attraktiv Human-baserede platform til at modellere en lang række hjertesygdomme in vitro1,2,3,4,5,6,7,8. Desuden, IPSC-CMS kan anvendes til forudsigelse af patientens respons på nye eller eksisterende lægemidler, at screene hit forbindelser, og udvikle nye personlige stoffer9,10. På trods af betydelige fremskridt skal der dog tages hensyn til flere begrænsninger og udfordringer ved brug af iPSC-CMs11. Derfor, metoder til at forbedre kardiale differentiering protokoller, for at forbedre IPSC-CMS effektivitet og modning, og til at generere specifikke kardiomyocyte undertyper (ventrikulær, atrial, og nodal) er blevet intenst undersøgt og allerede ført til talrige kulturstrategier til at overvinde disse forhindringer12,13,14,15.

Uanset disse protokollernes soliditet er en stor bekymring for brugen af iPSC-CMs reproducerbarhed af lange og komplekse procedurer for at opnå høj kvalitet kardiomyocytter, der kan sikre den samme ydeevne og reproducerbare resultater. Reproducerbarhed er kritisk, ikke kun når man sammenligner cellelinjer med forskellige genetiske baggrunde, men også når man gentager cellulære og molekylære sammenligninger af samme cellelinje. Celle variabilitet, såsom well-to-Well forskelle i iPSCs tæthed, kan påvirke hjerte differentiering, genererer et lavt udbytte og dårlig kvalitet kardiomyocytter. Disse celler kan stadig bruges til at udføre eksperimenter, der ikke kræver en ren population af CMs (f. eks. ved udførelse af ca2 + forbigående målinger). Faktisk, når de udfører elektrofysiologisk analyse, ikke-CMs vil ikke slå, hverken spontant eller under elektrisk stimulation, så det vil være let at udelukke dem fra analysen. Men på grund af den dårlige kvalitet kan iPSC-CMs vise ændrede elektrofysiologiske egenskaber (f. eks. uregelmæssig ca2 + forbigående, lav ca2 + amplitude), som ikke skyldes deres genetiske makeup. Derfor, især når du bruger iPSC-CMs til at modellere hjertesygdomme, er det vigtigt ikke at forveksle resultater fra en dårlig kvalitet CM med sygdommen fænotype. Der kræves omhyggelige screenings-og udelukkelses processer, inden elektrofysiologiske undersøgelser fortsættes.

Denne metode omfatter optimerede protokoller til at generere høj renhed og høj kvalitet kardiomyocytter og til at vurdere deres funktion ved at udføre ca2 + forbigående målinger ved hjælp af et calcium-og kontraktilitet erhvervelse og analyse system. Denne teknik er en enkel, men kraftfuld, måde at skelne mellem høj effektivitet og lav effektivitet iPSC-CM præparater og give en mere fysiologisk relevant karakterisering af humane iPSC-CMs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsøgene med at bruge voksne rotte kardiomyocytter i dette studie blev udført med godkendt institutionel dyrepleje og brug Komité (IACUC) protokoller af Icahn School of Medicine på Mount Sinai. De voksne rotte kardiomyocytter blev isoleret fra Sprague Dawley rat Hearts af den Langendorff-baserede metode som tidligere beskrevet16.

1. forberedelse af medierne

  1. Forbered hiPSC-medier.
    1. Supplere og den basale medium til stuetemperatur (RT). Sørg for, at tillægget er optøet helt. Bland 400 mL af basal mediet og 100 mL af supplementet og filteret ved hjælp af et 0,22 μm vakuum drevet filter. Opbevares ved 4 °C og ækvibrere til RT før brug.
  2. Forbered RPMI + B27.
    1. Ækvibrere B27 supplement og basal medium (RPMI 1640) til RT. sikre, at tillægget er optøet helt. Bland 490 mL af det basale medium og 10 mL af 50x supplement og filter ved hjælp af en 0,22 μm vakuum drevet filter. Opbevares ved 4 °C og ækvibrere til RT før brug.
  3. Forbered RPMI + B27 (-) insulin.
    1. Ækvibrere de B27 (-) insulin supplement og basal medium (RPMI 1640) til RT. Sørg for, at tillægget er optøet helt. Bland 490 mL af det basale medium og 10 mL af 50x supplement og filter ved hjælp af en 0,22 μm vakuum drevet filter. Opbevares ved 4 °C og ækvibrere til RT før brug.
  4. Forbered markerings medier (RPMI (-) glucose + B27 + lactat).
    1. Ækvibrere B27 supplement og basal medium (RPMI 1640 (-) glukose) til RT. Sørg for, at tillægget er optøet helt. Bland 490 mL af basal mediet og 10 mL af 50x supplementet, tilsæt 4 mM natriumlactat, der er dannet i sterilt vand, og Filtrer ved hjælp af et 0,22 μm vakuum drevet filter. Opbevares ved 4 °C og ækvibrere til RT før brug.
  5. Forbered RPMI 20.
    1. Ligevægt mellem basal mediet (RPMI 1640) og RT. Bland føtal bovint serum (FBS) (20% slutkoncentration) og RPMI. Filter ved hjælp af et 0,22 μm vakuum drevet filter og opbevares ved 4 °C. Ækvibrere til RT før brug.
  6. Forbered passaging Media ved at tilføje Rho-associeret, coiled-Coil indeholdende protein kinase (ROCK) inhibitor (2 μM slutkoncentration) til hiPSC medier.
  7. Forbered d0 medier ved at tilføje GSK-3-hæmmer, CHIR 99021 til RPMI + B27 (-) insulin medier (10 μM Final).
  8. Forbered D3-og d4-mediet ved at blande RPMI + B27 (-) insulin mediet med IWR-1 (5 μM Final).
    Bemærk: D1 og D5 medierne består af RPMI + B27 (-) insulin. D7-mediet består af RPMI + B27.
  9. Forbered blokerende buffer (2% bovint serumalbumin [BSA], 2% FBS, 0,05% NP-40 i fosfatbuffer saltvand [PBS]): i et 50 mL konisk rør tilsættes 1 g BSA, 1 mL FBS, 49 mL PBS og 250 μL NP-40. Blandingen, indtil den er helt opløst.

2. fremstilling af humane embryonale stamceller (hESC)-kvalificerede matrix belagte plader og Dæksedler

Bemærk: Udfør alle trinene under en steriliseret vævskultur hætte.

  1. Thaw hESC-kvalificeret matrix stamopløsning natten over på isen ved 4 °C. Se produkt specifikationsarket for at bestemme de relevante alikvot volumener, da dette kan variere afhængigt af bestanden. Disse aliquoter opbevares ved-20 °C i 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
  2. For at kunne bruge matrixen til belægning af plader eller glas dæksedler, skal du først tø en alikvot af hESC-kvalificeret matrix ved 4 °C i 30 min.
  3. Aliquot 24 mL kold Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM): næringsstof blandingen F-12 (DMEM/F: 12) i et 50 mL konisk rør.
  4. Bland den kolde DMEM/F: 12 medier med en 2 mL glas pipette for at køle ned overfladen af pipetten.
  5. Brug den samme pipette til at optage ca. 500 − 700 μL kold DMEM/F: 12 og bland med den hESC-kvalificerede matrix-alikvot i selve mikrocentrifuge røret.
  6. Når blandingen er korrekt blandet, skal opløsningen overføres til 50 mL konisk slange med kold DMEM/F: 12 og blandes igen.
  7. For en standard 6 brønd plade tilsættes 1 mL af denne blanding til hver brønd. Sørg for, at brønden er helt dækket. Lad pladerne stå på RT under vævskultur hætten i mindst 30 minutter. Hvis det ønskes, opbevares ved 4 °C umiddelbart efter plating i op til 1 uge og ækvibrere til RT i 30 min før brug.
  8. For at bruge pladerne, aspirere matrixen og erstatte med passende medier. Bruges med det samme.
  9. Opbevar glas dæksedlen i et sterilt miljø (f. eks. inde i en steril vævs kulturs hætte).
  10. Før belægning tørres hver enkelt dækseddel med 70% ethanol. Når coversedlen er tør, skal du placere den inde i en brønd af en steril 6-brønd plade.
  11. Der tages 250 − 300 μL af den hESC-kvalificerede matrix opløsning, og den skal omhyggeligt dispenserer direkte på midten af glas dæksedlen. Lad dæksedlerne stå på RT under vævskultur hætten i mindst 30 minutter før brug.

3. fremstilling af små molekyler

Bemærk: rekonstruere alle små molekyler og WNT modulatorer i DMSO medmindre andet er angivet.

  1. 10 mM aliquoter på 25 μL hver af IWR-1 og CHIR 99021 og opbevares ved-20 °C.
  2. 10 mM aliquoter på 50 μL rekonstruere hver af Thiazovivin (klippe hæmmer) og opbevares ved-20 °C.

4. vedligeholdelse og Passaging af iPSCs

Bemærk: Udfør alle de følgende trin under en steril vævskultur hætte.

  1. Vedligehold iPSCs i standard 6 brønd plader og Udfør alle trin under sterile forhold. Vedligehold cellerne med 2 mL hiPSC-medier pr. brønd. Skift medierne hver anden dag. Cellerne opbevares ved 37 °C, 6% O2,5% Co2. Passage cellerne, når de er mellem 70 − 80% konflydende.
  2. Ækvibrate PBS uden ca2 + og mg2 + til rt.
  3. For at starte passaging processen, tilsættes 1 mL PBS uden ca2 + og mg2 + til brønden, der skal passaged. Inkubér ved RT i 7 − 10 min. Kontrollér cellerne under mikroskopet for at sikre, at PBS-behandlingen ikke har resulteret i fuldstændig dissociation af monolayer.
  4. Fjern PBS og Udskift med 1 mL passaging Media. Brug en celle løfteren til forsigtigt at skrabe og løft cellerne fra overfladen af brønden.
  5. Mekanisk dissocierer cellerne ved hjælp af en steril 2 mL glas pipette. Gentag, indtil cellerne er godt dissocierede jævnt i små kolonier, når de observeres under et mikroskop.
  6. Når cellerne er blevet tilstrækkeligt dissocierede, tilsættes 5 mL passaging Media for at opdele cellerne 1:6. Juster mængden af passaging Media, der skal tilføjes for at matche det foretrukne delingsforhold.
  7. Aspirer den hESC-kvalificerede matrix fra hESC-kvalificeret matrix-belagt plade og Udskift med 1 mL passaging medier per brønd. Tilsæt 1 mL dissocierede celler pr. brønd.

5. differentiering af kardiomyocyte

  1. Brug hiPSC linjer, der er veletablerede (mere end 20 passager) og udviser en homogen morfologi, før du starter hjerte differentiering.
  2. Sørg for, at Ipsc'erne er omkring 70 − 80% konflydende.
  3. Cellerne 1x i PBS vaskes uden ca2 + og mg2 +.
  4. Tilsæt 2 mL d0-medier (trin 1,7) pr. brønd, og Overfør cellerne tilbage til inkubator.
  5. Efter 24 timer udskiftes med 3 mL D1-medie pr. brønd for 48 h.
  6. På dag 3 skal mediet udskiftes med 2 mL D3-medie pr. brønd. Gentag med d4 medier på dag 4.
  7. På dag 5 skal du udskifte mediet med 3 mL D5-medier pr. brønd.
  8. På dag 7 skal mediet udskiftes med 3 mL D7-medie pr. brønd og overføres til en inkubator med 37 °C, 5% CO2og normal O2 -koncentration. Udskift D7-mediet (RPMI + B27) hver 2.

6. udvælgelses procedure og iPSC-CM dissociation

  1. Ti dage før du udfører ca2 + forbigående målinger eller enhver funktionel analyse, skal du udskifte Rpmi + B27-mediet med 3 ml markerings medie pr. brønd for 48 h.
  2. Udskift mediet med 3 mL markerings medie til en anden 48 h.
  3. Udskift mediet med 2 mL RPMI + B27-medier pr. brønd i 24 timer.
  4. Coat standard 6 brønd plader som beskrevet i punkt 2.
  5. Tilsæt 1 mL steril 0,25% trypsin med EDTA til hver brønd. Pladen inkubates ved 37 °C i 5 minutter.
  6. Ved hjælp af en 1.000 μL pipette, mekanisk dissocierer cellerne, så enkeltceller kan ses, når de observeres under et mikroskop.
  7. Cellerne overføres til et sterilt 15 mL konisk rør, og der tilsættes 2 mL RPMI 20-medier pr. brønd. Centrifuger i 5 minutter ved 800 x g.
  8. Aspirér supernatanten og resuspension cellerne i RPMI + B27 medier. Aspirer den hESC-kvalificerede matrix fra pladerne, og Udskift den med 1 mL RPMI + B27-medier.
  9. Ved hjælp af en 1.000 mL pipettespids, mekanisk dissocierer celle pellet, indtil opløsningen virker homogen.
  10. Overfør ca. 500.000 celler til hver brønd. Overfør til inkubator i 24 timer.
  11. Udskift mediet med 3 mL markerings medie pr. brønd for 48 h.
  12. Udskift mediet med 3 mL RPMI + B27 pr. brønd. Vedligehold celler i D7-medier (RPMI + B2, skiftende medier hver 2. dag, indtil de er klar til funktionel analyse.

7. klargøring af iPSC-CMs til strømnings cytometri

  1. Når cellerne er af den ønskede alder og har gennemgået metabolisk udvælgelse (afsnit 6), vaskes cellerne med PBS uden ca2 + og mg2 +.
  2. Tilsæt 1 mL pr. brønd af trypsin 0,25% og Inkuber i 5 − 7 min ved 37 °C.
  3. Blandingen afpipetteres 5 − 10x med en P1000-spids for at singulisere cellerne og overføres til et 15 mL rør, der indeholder 2 mL RPMI 20.
  4. Drej cellerne ved 600 x g i 5 min.
  5. Tilsæt 100 μL fikserings opløsning (4% PFA) til celle pellet. Tilføj opløsningen dråbevis med kontinuerlig, blid vortexning og derefter sat på is i 15 min.
  6. Tilsæt 1,5 mL PBS. Saml cellerne ved at centrifugeres og aspirere supernatanten.
  7. For hvert eksperiment, omfatter en uplettet kontrol pr fiksering/permeabilization tilstand.
  8. Resuspension af cellerne i 500 μL blokerende opløsning (2% FBS/2% BSA i PBS med 0,1% NP-40) i 30 minutter ved RT.
  9. Uden at fjerne blokerings opløsningen tilsættes det primære antistof MLC2V/MLC2A (5 mg/mL) og inkubates 45 min ved RT.
  10. Vask med blokerende buffer. Saml cellerne ved at centrifugeres og aspirere opløsningen.
  11. Tilsæt sekundært antistof Alexa fluor 555/488 (1:750) fortyndet i blokerende buffer til 45 min ved RT eller natten over ved 4 °C.
  12. Tilsæt 1,5 mL PBS. Saml cellerne ved at centrifugeres og aspirere opløsningen.
  13. Resuspension af celler i 250 − 300 μL PBS. Brug en P1000-pipette til at disaggregere cellerne.
  14. Forbered runde bund rør med en 35 μm nylon mesh celle si cap. Forvåd celle sien med 50 μL PBS og sæt røret på is.
  15. Overfør opløsningen med de disaggregerede celler til de runde bund rør med cellernes si hætter. Lad celle opløsningen dræne naturligt eller tryk på bunden af røret mod en flad overflade, hvis det er nødvendigt, for at sikre fuldstændig dræning og opsamling af cellerne i røret. Sørg for at sætte røret tilbage på isen så hurtigt som muligt.
  16. Skyl celle sien med 250 μL PBS for at genvinde eventuelle rest celler.
  17. Vedligehold rørene på is og dæk med aluminiumsfolie indtil flow flowcytometri analyse.

8. plating Kardiomyocytter på glas Dæksedler

Bemærk: Udfør alle trin i et sterilt miljø.

  1. Klargør glas dæksedlerne som beskrevet i trin 2,10 og 2,11.
  2. Når iPSC-CMs er valgt og er af den ønskede alder, skal du følge trin 6.5 − 6.7 for at adskille iPSC-CMs.
  3. Aspirér supernatanten, og resuspender cellerne i en tilstrækkelig mængde RPMI 20-medier til at have ca. 300.000 celler pr. 250 μL.
  4. Ved hjælp af en 2 mL glas pipette, mekanisk dissocierer celle pellet, indtil opløsningen virker homogen.
  5. Aspirer den hESC-kvalificerede matrix fra dæksedlerne.
  6. Ved hjælp af en 1000 μL pipette, blandes og trækkes 250 μL af opløsningen fra det 15 mL koniske rør.
  7. Du skal langsomt dispensere 250 μL af opløsningen på glas dæksedlen og tage ekstra omhu for kun at tilføje til det område, hvor den hESC-kvalificerede matrix belægning er til stede.
  8. Overfør forsigtigt til inkubator og Forlad natten, idet du sørger for ikke at ryste eller sprede cellerne på dæksedlerne. Næste morgen tilsættes forsigtigt 2 mL D7 (RPMI + B27) medier til hver brønd med dæksedlen. Skift mediet efter 24 timer og hver 2 dage efter.

9. fastsættelse af celler

  1. Sørg for, at en passende mængde PBS med ca2 + og mg2 + er ækvibreret til 4 °c.
  2. Forbered en 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) opløsning fortyndet i PBS med ca2 + og mg2 + og Ækvibrere til 4 °c.
  3. Når iPSC-CMs er af passende alder, har undergået metabolisk udvælgelse (punkt 6), og er blevet belagt på dæksedler (afsnit 8), vask cellerne 3x med 1 mL kold PBS med ca2 + og mg2 + pr brønd.
  4. Tilsæt 1 mL kold 4% PFA og Efterlad cellerne ved RT under hætten i 15 min.
  5. Vask cellerne med kolde PBS for at fjerne overskydende PFA.
  6. Tilsæt 2 mL PBS med ca2 + og mg2 + og opbevar ved 4 °c.

10. immunofluorescens farvning

  1. Fjern PBS fra de faste celler, og tilsæt 1 mL blokerende buffer. Inkuber i 1 time ved RT.
  2. Fjern blokerende buffer og tilsæt det primære antistof (5 mg/mL) fortyndet i blokerende buffer. Inkuber natten over ved 4 °C.
  3. Vask 3x i PBS med ca2 + og mg2 + i 5 min. hver.
  4. Tilsæt sekundært antistof fortyndet i blokerende buffer 1:1000.
  5. Dæk pladen med aluminiumsfolie for at beskytte den mod lys og Inkuber i 45 min ved RT. Opbevar aluminiums folien for følgende trin.
  6. Vask 3x i PBS med ca2 + og mg2 +, 5 min. hver.
  7. Tilsæt en tilstrækkelig mængde DAPI-arbejds løsning til fuldstændigt at dække cellerne og inkubere ved RT i 10 min.
  8. Prøven vaskes grundigt med PBS med ca2 + og mg2 + for at fjerne overskydende dapi.
  9. Tag nye glas slides og tilføje en dråbe af montering medier i midten. Brug pipette til jævnt at sprede monterings mediet. Placer dæksedlerne med cellerne med forsiden nedad på diasene.
    Bemærk: cellerne kan opbevares i 30 dage, hvis de beskyttes mod lys.

11. vurdering af intracellulære ca2 + transienter

  1. Når iPSC-CMs er mindst 3 måneder gammelt, har undergået metabolisk udvælgelse (punkt 6), og er blevet belagt på dæksedler, behandle dem med 2 μL Fura-2, AM (endelig koncentration: 1 μM) og inkubere ved 37 °C i 10 min.
    Bemærk: Fura-2 er lysfølsomt. Udfør alle belastnings procedurer og eksperimenter i mørket.
  2. Forbered calcium og kontraktilitet erhvervelse og analyse system.
    1. Tænd for systemet for at sikre, at Arc-lampen startes (figur 1B).
    2. Anbring kammeret på systemet, og Forbind rørene fra pumpen til de relevante indgangs-og afsætningskanaler og den elektriske ledning fra stimulatoren til kammeret som vist i figur 1C.
    3. Fyld perfusions røret, der løber gennem det Fluidic inline-varmelegeme med 37 °c forvarmede tyrode opløsning.
    4. Juster kameraets og indramningen af blænde dimensionerne for at minimere baggrundsområdet.
  3. Monter en glas dækseddel med iPSC-CMs ind i kammeret og fastgør.
  4. Tilsæt 500 μL af Tyrode opløsning direkte på toppen af det fastspændt glas dækslip og begynd at perfektionere kammeret (1,5 mL/min) med Tyrode opløsning.
  5. Pace iPSC-CMs med 1 Hz felt stimulation ved hjælp af den elektriske stimulator (10 V, 4 MS).
  6. Inkuber iPSC-CMs i kammeret med stimulation i mindst 3 − 5 min for cellerne til at vaske Fura-2 farvestof og tilpasse sig til miljøet og til at vaske ud fluorescerende farvestof.
  7. Juster visningsvinduet til det øverste venstre område af glas coveret.
  8. Begynd optagelsen.
  9. Når du har indsamlet en konsistent strøm på 5 − 10 toppe, skal du klikke på pause for midlertidigt at stoppe optagelsen.
  10. At sikre, at hverken fokus eller dimensioner af visningsvinduet ændres, flytte mikroskopet scenen til det tilstødende område, bevæger sig mod den modsatte ende, og genoptage optagelsen.
  11. Gentag trin 11,9 og 11,10 for at scanne på tværs af dæksedlen, der først flyttes til venstre og derefter nedad i en zig-zag-måde for at dække hele dækglas-området. Dette består af 80 − 100 målinger pr. Cover seddel.
    Bemærk: Begræns den samlede måle tid til 10 minutter, da sekundære faktorer medfører et fald i ca2 + forbigående.
  12. Når ca2 + transienter er erhvervet, analysere data med fluorescens Traces analyse software i henhold til producentens anvisninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den protokol, der er beskrevet i figur 1A , genererede meget rene kardiomyocytter, som fik en ventrikel/voksen lignende fænotype med tid i kulturen. Som vurderet af immunofluorescens farvning for atrieflimren og ventrikulær myosin regulerende lyskæde 2 isoformer (henholdsvis MLC2A og MLC2V), de fleste af cellerne genereret af denne protokol var MLC2A-positive på dag 30 efter induktion af hjerte differentiering, mens MLC2V blev udtrykt i meget lavere mængder på samme tidspunkt (figur 2A, top paneler). Da tiden i kulturen steg (dag 60 og 90), blev der observeret en komplet switch af MLC2 isoformer (MLC2A til MLC2V) (figur 2a, bundpaneler). For at kvantificere MLC2A-og MLC2V-positive celler blev der udført flow cytometri-analyse. I overensstemmelse med immunofluorescens resultater demonstrerede strømnings cytometri-data tidligt stadie (dag 30) iPSC-CMs, som for det meste udtrykker MLC2A (29,8% MLC2A + vs. 1,9% MLC2V +) (Se figur 2B, venstre panel), sammenlignet med sent stadie (dag 90) IPSC-CMS, som for det meste udtrykte MLC2V (41,3% MLC2V + vs. 16,7% MLC2A +) (Se figur 2B, højre panel). Fordi udtrykket mønster af MLC2A og MLC2V er kendt for at være et kendetegn for hjerte differentiering og modning, disse resultater tyder på, at langvarig kultur tid øger modning af iPSC-CMs og at størstedelen af cellerne synes at være forpligtet til ventrikel fænotype. Vi vurderede derefter tids afhængigheden af ca2 + håndterings modning. Ca2 + forbigående blev målt i IPSC-CMS ved de tre differentierings tider (dag 30, 60 og 90) og sammenlignet med isolerede voksne rotte kardiomyocytter (arcms). Ca2 + amplitude blev signifikant forøget i IPSC-CMS på dag 90 og var magen til arcms (figur 3A, B). Hastigheden på ca2 + reuptake (forfald-Tau) på dag 90 var signifikant hurtigere sammenlignet med dag 30 IPSC-CMS, og tættere på arcms (figur 3C). Effekten af β-adrenerge stimulation på ca2 + transienter blev yderligere evalueret ved at behandle cellerne med 10 nm izoproterenol (ISO) i 10 min ved 37 °c. Som observeret i ARCMs, ISO signifikant øget ca2 + forbigående og accelererede satsen på ca2 + reuptake i dag 90 IPSC-CMS. Der blev ikke observeret ændringer i dag 30 iPSC-CMs (figur 3D-F). Interessant, dag 90 iPSC-CMs var i stand til at følge stigende elektrisk stimulation (fra 0,5 − 3 Hz), på samme måde som observeret i ARCMs (figur 4B). Tilsammen viser disse resultater, at iPSC-CMs afledt af denne metode har lignende egenskaber som dem, der ses i indfødte CMs, specifikt ventrikulære-lignende fænotyper, modne ca2 + håndtering egenskaber, og positive β-adrenerge svar.

Kontaminerende ikke-hjerte celler kan påvirke den funktionelle modning af humant iPSC-CMs under differentiering17. Figur 4a viser en sammenligning mellem 3 måneder gamle celler opnået ved høj virkningsgrad differentieringer (toppaneler, video 1), robust udtrykker den specifikke ventrikel markør (MLC2V), og 3-måneders gamle celler opnået fra lav effektivitet differentieringer (nederste paneler, video 2), viser IPSC-CMS blandet med Alpha-glat muskel actin (αsma)-positive celler. Interessant, viste funktionel analyse ændret ca2 + transienter i den blandede IPSC-CMS/ikke-CMS præparat sammenlignet med IPSC-CMS fra den høje effektivitet differentiering. Især de celler, opnået fra lav effektivitet differentieringer udstillet meget lille ca2 + amplitude og automatiby (figur 4b, midterste panel) sammenlignet med ren IPSC-CMS (figur 4b, toppanel) og arvcs (figur 4b, bundpanel). Desuden præsenterede celler fra lav effektivitet differentieringer arytmiske mønstre (figur 4C).

Det er vigtigt at bemærke, at iPSC-CMs vist i øverste panel af figur 4A også undergik metaboliske udvælgelse, som er et vigtigt skridt til yderligere at berige en population af IPSC-CMS, der allerede er afledt af en meget effektiv differentiering. Disse data indikerer, at høj effektivitet kardiale differentierings protokoller, der genererer høj kvalitet CMs er nødvendige for præcist at rekapitulere en hjerte fænotype in vitro.

Figur 5 viser ca2 + amplitude variabilitet i forskellige områder af CMS-monolayer, plottet over et tidsforløb på 1.200 s. Ca2 + amplituder målt ved begyndelsen af en stimuleringsfrekvens på 1 Hz (200 s) var meget varierende og blev mere konsistent, da stimuleringen fortsatte (200 − 900 s). Efter en tidsperiode på 900 s blev ca2 + amplitude dog reduceret betydeligt. Disse data indikerer, at ved optagelse ca2 + transienter i IPSC-CMS, er det nødvendigt at lade cellerne stabilisere ved 37 °c under konstant stimulation for mindst 200 s. Derudover skal optagelser begrænses til et bestemt tidsvindue (200 − 900 s) for at sikre reproducerbare resultater.

Figure 1
Figur 1: samlet skematisk af iPCS-CMs-præparat og ca2 + forbigående instrumenter. (A) skematisk af kardiale differentierings protokol, der viser de udviklingsmæssige stadier af differentiering af ipscs. Scale bar = 50 μm. B) systemet for erhvervelse og analyse af calcium og kontraktilitet. a) peristalitisk pumpe b) inverteret mikroskop c) strømkilde til det digitale kamera d) elektrisk stimulator e) Fluorescens systemgrænseflade f) filter hjul regulator (c) system kammer. a) system kammer krop. b) væskeindtag. c) væske udtag. d) Fluidic inline Solution radiator. f) elektroderne, som forbinder system kammeret med den elektriske stimulator. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: sammenligning af MLC2A og MLC2V udtryk i iPSC-CMS på forskellige dage af differentiering. A) immunofluorescens farvning af IPSC-CMS på dag 30, 60 og 90 efter differentierings induktion for MLC2A og MLC2V. Skala bjælke = 20 μm. B) flow cytometri-analyse af IPSC-CMS for MLC2V og MLC2A efter 1 måned og 3 måneder efter differentiering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: sammenligning af iPSC-CMS egenskaber på forskellige dage af differentiering. A) repræsentative ca2 + forbigående spor på forskellige differentierings dage. (B-C) Gennemsnitlig ca2 + amplitude og ca2 + forfald fremkaldt under stimulation ved 1 Hz. (D-F) effekt af izoproterenol (ISO, 10 nm) behandling i IPSC-CMS på forskellige dage af differentiering. ARCMs indikerer isolerede rotte voksne kardiomyocytter. N = 70 − 100 områder; * p < 0,05; p < 0,001, som bestemt af elevens t-test. Data er repræsenteret som middelværdi ± S.E.M. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: sammenligning mellem høj effektivitet og lav effektivitet differentieringer af iPSC-CMS. A) immunofluorescens farvning af IPSC-CMS for αsma og MLC2V. Skala bjælke = 20 μm. B) repræsentative spor, der viser ca.2 + transienter fra høj virkningsgrad (ovenfor) og lav virkningsgrad (mellem) differentieringer, og isolerede rotte voksne kardiomyocytter (nedenfor). Myocytterne blev stimuleret ved 0,5 Hz, 1 Hz, 1,5 Hz, 2 Hz og 3 Hz. (C) repræsentativt spor, der viser et arytmisk mønster fra en dårlig differentiering. Pilene indikerer punkt pacing. ARCMs indikerer isolerede rotte voksne kardiomyocytter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: tidsafhængig ca2 + amplitude fra en enkelt dækseddel. Ca2 + amplituder fra forskellige områder i en dækseddel blev plottet på en tidsafhængig måde. Ikke-anbefalede tidsperioder til måling af ca.2 + forbigående er angivet i de stiplede områder (< 200 s eller > 900 s). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1
Video 1: repræsentativ video, der viser et eksempel på en høj effektivitets differentiering. Venligst klik her for at downloade denne video.

Video 2
Video 2: repræsentativ video, der viser et eksempel på en lav effektivitets differentiering. Venligst klik her for at downloade denne video.

Video 3
Video 3: repræsentativ video, der viser et eksempel på en homogen enkeltlags fordeling af IPSC-CMS på en glas dækseddel. Denne video viser den anbefalede celletæthed, der skal bruges til funktionel analyse. Venligst klik her for at downloade denne video.

Video 4
Video 4: repræsentativ video, der viser et eksempel på celler fra en lav effektivitets differentiering belagt på en glas dækseddel. Cellerne i videoen blev opnået fra en lav effektivitets differentiering. Celler fra sådanne differentieringer distribueres normalt ikke homogent på tværs af dæksedlen, og det er svært at finde hele tiden at slå celler. Venligst klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trin for brug af humant iPSC-CMs som eksperimentelle modeller er: 1) genererer høj kvalitet cardiomyocytter (CMs), der kan sikre en ensartet ydeevne og reproducerbare resultater; 2) at lade cellerne modne i kulturen i mindst 90 dage til tilstrækkelig vurdering af deres fænotype; 3) udføre elektrofysiologiske undersøgelser, fx calcium (ca2 +) forbigående målinger, at give en fysiologisk relevant funktionel karakterisering af humant IPSC-CMS. Vi udviklede en monolayer-baseret differentierings metode, der producerer høj kvalitet ventrikel-lignende iPSC-CMs. Vores metode bygger på flere afgørende faktorer og er en variant af eksisterende protokoller14,18. I modsætning til andre protokoller, denne ene bruger lav ilt betingelser (5% O2) for ipscs vedligeholdelse samt i den første uge af deres differentiering i CMS. lave niveauer af ilt efterligner den miljømæssige tilstand under embryonal og føtal hjerte udvikling19. Hypoxic betingelser har også vist sig at øge iPSCs spredning og deres efterfølgende differentiering til CMs20. Såning tæthed og ordentlig iPSCs passaging er også kritiske faktorer for en vellykket hjerte differentiering. Der observeres en høj differentierings effektivitet, når 70 − 80% flydende-ipscs adskilles i små celle aggregater ved hjælp af en enzym fri opløsning og seedes i et splitforhold på 1:6. Kardiel differentiering kan påbegyndes, når cellerne når en sammenhæng på 70 − 80%, forventes omkring 4 dage efter opdeling. CHIR99021 (10 μM) behandling i begyndelsen af differentieringen vil forårsage betydelig celledød. Men, celle spredning observeres, når CHIR99021 fjernes fra kulturen den følgende dag. En korrekt balance mellem celledød og spredning er afgørende for at bevare en enkeltlags kultur under hele differentieringen, hvilket er en anden vigtig faktor for en vellykket differentiering. Hvis iPSC-tætheden er enten for lav eller for høj, vil den efterfølgende differentiering være en lav virkningsgrad af hjerte differentiering (figur 4a, video 2). Figur 4a viser et sådant eksempel på en lav virkningsgrad differentiering, hvor kardiomyocytterne afledt af en sund donor blandes med andre celletyper, såsom α-glatte muskel actin-positive celler. Vigtigere, ca2 + transienter registreret fra sådanne præparater viste ændrede egenskaber, såsom lav ca2 + amplitude og arytmiske mønstre, som let kunne misfortolkes som biologisk variation. En vellykket og høj virkningsgrad differentiering fra den samme cellelinje, i stedet, genereret en ren population af ventrikulære-lignende kardiomyocytter (figur 4a, video 1) sammen med regelmæssige ca2 + transienter (figur 4B, top panel). Således er kvaliteten af differentieringen spiller en vigtig rolle i den samlede størrelse, form, regelmæssighed, og hyppigheden af en ca2 + forbigående.

Et andet vigtigt aspekt af en vellykket og effektiv differentiering er at opnå en beriget population af kardiomyocytter. Mens udifferentierede stamceller og andre IPSC-afledte celletyper bruger glukose som en energikilde, kan CMS bruge laktat effektivt til ATP og glutamat produktion21. Således, for at opnå en endnu renere population af CMs, cellerne dyrkes i laktat-suppleret og glukose-forarmet kulturmedium. Dyrkning af iPSC-CMs i dette valg af medier i lang tid kan dog føre til funktionsnedsættelse. Derfor, at rense iPSC-CMs og stadig bevare deres funktion, metaboliske udvælgelse udføres kun i 10 dage, fra dage 80 − 90 siden differentiering induktion. Efter denne periode erstattes markerings mediet, og cellerne vedligeholdes i RPMI/B27-medier. Mens udvælgelses protokollen kan gennemføres meget tidligere22 (f. eks, omkring dag 15), er det tilrådeligt at vente til dag 80, da dette kan forhindre resterende ipscs eller andre celletyper fra prolifererende ved den tid cellerne er klar til funktionelle undersøgelser (dag 90). Det er derfor afgørende, at alle ovennævnte faktorer tages i betragtning for en vellykket, effektiv og robust hjerte differentiering.

Ud over robusthed og effektivitet af kardiale differentierings protokoller, modning og celletype specifikation (f. eks, atrieflimren og ventrikel celletyper) også udgøre en stor udfordring for at bruge iPSC-CMs til model hjertesygdom. I løbet af de sidste par år er mange lovende modnings strategier blevet rapporteret, herunder elektrisk stimulation, mekanisk strækning og substrat stivhed23. Men, langvarig in vitro-kultur af IPSC-CMS fortsætter med at være en enkel og praktisk tilgang til at generere voksne-lignende kardiomyocytter24,25.

I overensstemmelse med andre offentliggjorte rapporter12, IPSC-CMS genereret af denne in vitro-differentierings protokol viser robust udtryk for ventrikel-specifikke MLC2V og meget lavere niveauer af MLC2A på dag 90 (figur 2A, B). Mens føtal CMs indeholder både MLC2A og MLC2V isoformer, indeholder voksne ventrikulære CMs kun MLC2V. Denne switch i MLC isoform prævalens forekommer under den neonatal fase26.

Kardiomyocytter genereret gennem denne protokol udtrykke ventrikel specifik markør, såsom MLC2V, som gradvist stigninger i overflod som cellerne holdes i kulturen længere (figur 2A, B). Dette indikerer, at en langvarig in vitro-kultur forbedrer modning af CMs, der synes at være forpligtet til ventrikel fænotype.

Tid i kulturen påvirker også i høj grad ca2 + håndtering modning24,25. Tidligere rapporter beskrev, at efter 20 dage af differentierings induktion, der var ingen større ændringer i Calc ca2 + transienter som cellerne voksede ældre25. De kardiomyocytter, der genereres af protokollen her, viser dog progressive ændringer i ca2 + amplitude og ca2 + forfald over de tre evaluerede tidspunkter (30, 60 og 90 dage efter induktion af kardiel differentiering) (figur 3A-C). Interessant, disse data viser, at ca2 + forbigående parametre, såsom ca2 + amplitude og ca2 + forfald, målt i dag 90 IPSC-CMS var magen til dem, der måles i isolerede rotte voksne Kardiomyocytter (arcms). Desuden var de 90 dage gamle iPSC-CMs også i stand til at følge forskellige elektriske stimuleringer, der spænder fra 0,5 Hz til 3 Hz konsekvent, svarende til ARCMs (figur 4B). I det fremtidige arbejde ville det være interessant at se, hvordan en endnu længere tid i kulturen påvirker de funktionelle karakteristika ved disse iPSC-CMs i forhold til ARCMs.

Da β-adrenerge receptor signalering viser et særskilt tidsafhængig modvirkende mønster efter kardiel induktion27, blev virkningen af izoproterenol på ca2 + forbigående i IPSC-CMS, der genereres gennem denne protokol, afprøvet. Stimulation med izoproterenol førte til en positiv lusitropic respons i dag 90 IPSC-CMS, svarende til hvad der er observeret i arcms (figur 3D-F).

De funktionelle vurderinger af iPSC-CMs udført i denne undersøgelse har nogle forskelle og begrænsninger i forhold til isolerede voksne CMs. Den voksne CMs har veludviklede og velordnede sarcomeres. Dette giver mulighed for kontraktilitet målinger gennem påvisning af sarcomere bevægelse. Fordi ingen af de nuværende protokoller genererer fuldt modnet, voksen-lignende iPSC-CMs, kontraktilitet målinger gennem sarcomere detektion er ikke muligt. Selv om det er muligt at detektere bevægelsen af cellekanterne, når cellen kontrakter, det er betydeligt mere udfordrende at spore disse bevægelser på en præcis måde i iPSC-CMs. Fra nu af er teknologiske fremskridt nødvendige for at give mulighed for præcise vurderinger af kontraktilitet i disse celler. På den anden side er det muligt at måle ca2 + transienter af IPSC-CMS ved hjælp af en ca2 + indikator som Fura-2. I modsætning til voksen CMs er iPSC-CMs dog grupperet og har ikke en veldefineret grænse. Derfor repræsenterer de registrerede ca2 + transienter normalt ikke en enkelt celle, men snarere en gruppe celler i et bestemt område. Selvom det er muligt at justere arealstørrelsen, er det utroligt udfordrende at optage ca2 + transienter fra en enkelt celle. Det er afgørende, at når CMS er belagt på dæksedlerne, Tætheden er sådan, at de opnår en homogen enkeltlags fordeling (video 3), som giver mulighed for konsekvent at finde områder med celler. Hvis cellerne ikke distribueres som et enkeltlags på dæksedlen (video 4), vil der være områder uden celler, og hvis dæksedlen screenes specifikt for områder med banke celler for at udføre målingerne, kan dette føre til en "selektionsbias". I stedet for at vælge et bestemt område med at slå celler, anbefales det at indsamle data fra flere områder i hele dæksedlen, hvilket kun er muligt, når cellerne distribueres som en homogen monolayer. Målinger fra 100 sådanne forskellige områder, som tager omkring 10 min, er tilstrækkelige til at give pålidelige funktionelle egenskaber af cellerne. Endelig har IPSC-CMs, som vist i figur 5, brug for tid til at tilpasse sig målebetingelserne. For pålidelige målinger anbefales det, at cellerne stabiliseres ved måle forholdene i mindst 3 minutter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af AHA forsker Development Grant 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2 Scholars Award for klinisk og Translationel forskning karriereudvikling KL2TR001435 (F.S.); NIH r00 HL116645 og AHA 18TPA34170460 (C.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal Sigma Aldrich A5228
Alexa Fluor 488 goat anti mouse Invitrogen A11001
Alexa Fluor 555 goat anti rabbit Invitrogen A21428
B27 Supplement Gibco 17504-044
B27(-) insulin Supplement Gibco A18956-01
CHIR-99021 Selleckchem S2924
DAPI nuclear stain ThermoFisher D1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes Gibco 11330-032
Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook Celltreat 229306
Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well Corning 353046
Fluidic inline heater Live Cell Instrument IL-H-10
Fura-2, AM Invitrogen F1221
hESC-qualified matrix Corning 354277 Matrigel Matrix
hPSC media Gibco A33493-01 StemFlex Basal Medium
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
Live cell imaging chamber Live Cell Instrument EC-B25
MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody Synaptic Systems 311011
Myocyte calcium and contractility system Ionoptix ISW-400
Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) Proteintech 10906-1-AP
Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane ThermoFisher 124-0045
PBS with Calcium and Magnesium Corning 21-030-CV
PBS without Calcium and Magensium Corning 21-031-CV
Premium Glass Cover Slips Lab Scientific 7807
RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) Gibco 11879-020
RPMI medium 1640 (1X) Gibco 11875-093
Sodium L-lactate Sigma Aldrich L7022
StemFlex Supplement Gibco A33492-01
Thiazovivin Tocris 3845
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher 25200056
Tyrode's solution Boston Bioproducts BSS-355w Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955 (2015).
  2. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  3. Davis, R. P., et al. Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease. Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).
  4. Fatima, A., et al. In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).
  5. Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).
  6. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  7. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  8. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. eLife. 6, (2017).
  9. Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).
  10. Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery. Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).
  11. Youssef, A. A., et al. The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).
  12. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).
  13. Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).
  14. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).
  15. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  16. Gorski, P. A., et al. Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro. Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  19. Patterson, A. J., Zhang, L. Hypoxia and fetal heart development. Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).
  20. Correia, C., et al. Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).
  21. Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).
  24. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  25. Hwang, H. S., et al. Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).
  26. Scuderi, G. J., Butcher, J. Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).
  27. Jung, G., et al. Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).

Tags

Medicin induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter (iPSC-CMs) iPSCs calcium forbigående calcium håndtering hjertesygdomme modellering kardiomyocyt modning
Generation af ventrikulær-lignende HiPSC-afledte Kardiomyocytter og høj kvalitet celle præparater til calcium håndtering karakterisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oh, J. G., Dave, J., Kho, C.,… More

Oh, J. G., Dave, J., Kho, C., Stillitano, F. Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization. J. Vis. Exp. (155), e60135, doi:10.3791/60135 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter