Ici nous décrivons et validons une méthode pour générer uniformément les cardiomyocytes pluripotents pluripotents de cellules souches induits par l'homme robustes et caractériser leur fonction. Ces techniques peuvent aider à développer un aperçu mécaniste des voies de signalisation, fournir une plate-forme pour le dépistage à grande échelle des médicaments, et modéliser de façon fiable les maladies cardiaques.
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Article de méthode
Génération de cardiomyocytes dérivés de HiPSC ventriculaires et de préparations cellulaires de haute qualité pour la caractérisation de la manipulation du calcium
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cardiomyocytes pluripotents induits par l'homme (iPSC-CM) fournissent une source humaine précieuse pour l'étude de la science fondamentale du calcium (Ca2)des voies de manipulation et de signalisation ainsi que des tests de dépistage et de toxicité des médicaments à haut débit. Ici, nous fournissons une description détaillée des méthodologies utilisées pour générer des iPSC-CM de haute qualité qui peuvent reproduire de façon cohérente des caractéristiques moléculaires et fonctionnelles à travers différentes lignées cellulaires. En outre, une méthode est décrite pour évaluer de façon fiable leur caractérisation fonctionnelle par l'évaluation des propriétés de manutention Ca2. Les conditions à faible teneur en oxygène (O2), la sélection du lactate et le temps prolongé en culture produisent des cardiomyocytes ventriculaires de haute pureté et de haute qualité. Semblable aux cardiomyocytes adultes isolés de rat (ARCMs), les iPSC-CM de 3 mois présentent l'amplitude plus élevée de Ca2, le taux plus rapide de reuptake de Ca2MD (decay-tau), et une réponse lusitrope positive à la stimulation adrénergique de l'adrénergique par rapport au jour 30 iPSC-CM. La stratégie est techniquement simple, rentable et reproductible. Il fournit une plate-forme robuste pour modéliser les maladies cardiaques et pour le dépistage à grande échelle des médicaments pour cibler les protéines de manipulation Ca2.
Introduction
Les cardiomyocytes pluripotents induits par l'homme (iPSC-CM) sont une plate-forme humaine attrayante pour modéliser une grande variété de maladies cardiaques in vitro1,2,3,4,5,6,7,8. En outre, iPSC-CMs peut être utilisé pour la prédiction des réponses des patients à des médicaments nouveaux ou existants, pour dépister les composés touchés, et de développer de nouveaux médicaments personnalisés
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Protocole
Les expériences utilisant des cardiomyocytes de rat adultes dans cette étude ont été menées avec les protocoles approuvés du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'École de médecine Icahn à Mount Sinai. Les cardiomyocytes adultes de rat ont été isolés des coeurs de rat de Sprague Dawley par la méthode Langendorff-basée comme précédemment décrit16.
1. Préparation des médias
- Préparer les médias hiPSC.
- Équilibrez le supplément et la température moyenne à ambiante (RT) basale. Assurez-vous que le supplément a complètement décongelé. Mélanger 400 ml du milieu basal et 10....
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Résultats
Le protocole décrit dans la figure 1A a généré des cardiomyocytes très purs qui acquièrent un phénotype ventriculaire/adulte avec le temps dans la culture. Évalué par la coloration immunofluorescence pour les isoformes de la chaîne de lumière régulatrice de myosine auriculaire et ventriculaire 2 isoformes (MLC2A et MLC2V, respectivement), la majorité des cellules générées par ce protocole étaient MLC2A-positives au jour 30 après induction de la différenciation cardiaque, tan.......
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Discussion
Les étapes critiques pour l'utilisation des iPSC-CM humains comme modèles expérimentaux sont : 1) la génération de cardiomyocytes de haute qualité (CM) qui peuvent assurer les performances et les résultats reproductibles cohérents; 2) permettant aux cellules de mûrir en culture pendant au moins 90 jours pour évaluer adéquatement leur phénotype; 3) effectuer des études électrophysiologiques, par exemple des mesures transitoires du calcium (Ca2)pour fournir une caractérisation fonctionnelle physiologiquement per.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Cette recherche a été appuyée par la subvention de développement scientifique 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2 Scholars Award for Clinical and Translational Research Career Development KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 et AHA 18TPA34170460 (C.K.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Anti-Actine, &alpha ;-Anticorps musculaire lisse, souris monoclonale | Sigma Aldrich | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 chèvre anti souris | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 chèvre anti lapin | Invitrogen | A21428 | |
| B27 Supplément | Gibco | 17504-044 | |
| B27(-) insuline | Supplément Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| Coloration nucléaire DAPI | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| Élévateur de cellules à double extrémité, lame plate et J-Hook | Celltreat | 229306 | |
| Falcon Plaque de culture tissulaire multipuits, 6 puits | Corning 353046 | ||
| Chauffage fluidique en ligne | Cell Instrument | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| hESC Matrice qualifiée | Corning | 354277 | Matrigel |
| Matrice hPSC | Gibco | A33493-01 | StemFlex Basal Medium |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| Chambre d’imagerie de cellules vivantes | Live Cell Instrument | EC-B25 | |
| MLC-2A, anticorps de souris monoclonale | Systèmes synaptiques | 311011 | |
| Système de calcium et de contractilité des myocytes | Ionoptix | ISW-400 | |
| Anticorps à chaîne légère de myosine 2, polyclonal de lapin (MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| Nalgene Unités de filtre stérile jetable à flux rapide avec membrane | PESThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS avec Calcium et Magnésium | Corning | 21-030-CV | |
| PBS sans Calcium et Magensium | Corning | 21-031-CV | |
| Premium Glass Cover Slips | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| L-lactate de sodium | Sigma Aldrich | L7022 | |
| Supplément StemFlex | Gibco | A33492-01 | |
| Thiazovivin | Tocris | 3845 | |
| Trypsine-EDTA (0,25 %) | ThermoFisher | 25200056 | |
| La solution de Tyrode | Boston Bioproducts | BSS-355w | Ajuster le pH à 7,2. Ajouter 1,2 mM de chlorure de calcium |
Références
- Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955(2015).
- Moretti, A., et al.
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