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वेंट्रिकुलर की पीढ़ी-जैसे HiPSC-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स और कैल्शियम हैंडलिंग लक्षण वर्णन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले सेल की तैयारी

Published: January 17, 2020 doi: 10.3791/60135
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

यहां हम लगातार मजबूत मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स उत्पन्न करने और उनके कार्य की विशेषता के लिए एक विधि का वर्णन और मान्य करते हैं। इन तकनीकों के मार्ग संकेत में यंत्रवादी अंतर्दृष्टि विकसित करने में मदद कर सकते हैं, बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीनिंग के लिए एक मंच प्रदान करते हैं, और मज़बूती से मॉडल हृदय रोगों ।

Abstract

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (iPSC-सीएम) कैल्शियम के बुनियादी विज्ञान (Ca2 + +)हैंडलिंग और संकेत रास्तों के साथ ही उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग और विषाक्तता परख का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मानव स्रोत प्रदान करते हैं । इसके साथ, हम उच्च गुणवत्ता वाले आईपीएससी-सीएम उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धतियों का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं जो विभिन्न सेल लाइनों में आणविक और कार्यात्मक विशेषताओं को लगातार पुन: पेश कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, सीए2 + हैंडलिंग गुणों के मूल्यांकन के माध्यम से उनके कार्यात्मक लक्षण वर्णन का मज़बूती से आकलन करने के लिए एक विधि वर्णित है। कम ऑक्सीजन (ओ2)स्थितियां, लैक्टेट चयन, और संस्कृति में लंबे समय तक उच्च शुद्धता और उच्च गुणवत्ता वाले वेंट्रिकुलर जैसे कार्डियोमायोसाइट्स का उत्पादन करते हैं। अलग वयस्क चूहा कार्डियोमायोसाइट्स (एआरसीएमएस) के समान, 3 महीने पुराने आईपीएससी-सीएम उच्च सीए2 + आयाम, सीए2 + रीटेक (क्षय-ताऊ) की तेज दर और दिन 30 आईपीएससी-सीएम की तुलना में एड्रेनेर्जिक उत्तेजना के लिए एक सकारात्मक लुसिट्रोपिक प्रतिक्रिया प्रदर्शित करते हैं। रणनीति तकनीकी रूप से सरल, लागत प्रभावी और प्रजनन योग्य है। यह हृदय रोग मॉडल के लिए और बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीनिंग के लिए सीए2 + हैंडलिंग प्रोटीन को लक्षित करने के लिए एक मजबूत मंच प्रदान करता है ।

Introduction

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेम्पेट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) एक आकर्षक मानव आधारित मंच हैजो विट्रो1,2,3,4,5,6,7,8में हृदय रोगों की एक बड़ी विविधता को मॉडल करता है । इसके अलावा, आईपीएससी-सीएम का उपयोग उपन्यास या मौजूदा दवाओं के लिए रोगी प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी के लिए, हिट यौगिकों को स्क्रीन करने और नई व्यक्तिगत दवाओंको विकसितकरने के लिए किया जा सकता है9,10। हालांकि, महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, आईपीएससी-सीएम11का उपयोग करते समय कई सीमाओं और चुनौतियों पर विचार करने की आवश्यकता है। नतीजतन, कार्डियक भेदभाव प्रोटोकॉल में सुधार करने, आईपीएससी-सीएम दक्षता और परिपक्वता को बढ़ाने के लिए, और विशिष्ट कार्डियोमायोसाइट उपप्रकार (वेंट्रिकुलर, एट्रायल और नोडल) उत्पन्न करने के तरीकों का तीव्रता से अध्ययन किया गया है और पहले से ही इन बाधाओं को दूर करने के लिए कई संस्कृति रणनीतियों का नेतृत्व किया गयाहै 12,13,14,15।

इन प्रोटोकॉलकी मजबूती के बावजूद, आईपीएससी-सीएम के उपयोग के लिए एक बड़ी चिंता उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स प्राप्त करने के लिए लंबी और जटिल प्रक्रियाओं की प्रजनन क्षमता है जो एक ही प्रदर्शन और प्रजनन योग्य परिणाम सुनिश्चित कर सकती है। विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ सेल लाइनों की तुलना करते समय न केवल प्रजनन क्षमता महत्वपूर्ण है, बल्कि एक ही कोशिका रेखा की सेलुलर और आणविक तुलना को दोहराते समय भी महत्वपूर्ण है। सेल परिवर्तनशीलता, जैसे कि आईपीएससी घनत्व में अच्छी तरह से अंतर, कार्डियक भेदभाव को प्रभावित कर सकता है, जिससे कम उपज और खराब गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स पैदा हो सकते हैं। इन कोशिकाओं का उपयोग अभी भी ऐसे प्रयोग करने के लिए किया जा सकता है जिनमें सीएम की शुद्ध आबादी की आवश्यकता नहीं होती है (उदाहरण के लिए, सीए2 + क्षणिक माप प्रदर्शन करते समय)। दरअसल, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विश्लेषण करते समय, गैर-सीएम न तो अनायास और न ही विद्युत उत्तेजना के तहत नहीं हराएंगे, इसलिए उन्हें विश्लेषण से बाहर करना आसान होगा। हालांकि, खराब गुणवत्ता के कारण, आईपीएससी-सीएम बदल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं (जैसे, अनियमित सीए2 + क्षणिक, कम सीए2 + आयाम) दिखा सकते हैं जो उनके आनुवंशिक मेकअप के कारण नहीं हैं। इसलिए, विशेष रूप से जब आईपीएससी-सीएम का उपयोग हृदय रोग मॉडल के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि रोग फेनोटाइप के साथ एक खराब गुणवत्ता वाले सीएम से परिणाम भ्रमित न करें। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों पर आगे बढ़ने से पहले सावधानीपूर्वक स्क्रीनिंग और बहिष्कार प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है।

इस विधि में उच्च शुद्धता और उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स उत्पन्न करने और कैल्शियम और संकुचन अधिग्रहण और विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके सीए2 + क्षणिक माप प्रदर्शन करके उनके कार्य का आकलन करने के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल शामिल हैं। यह तकनीक उच्च दक्षता और कम दक्षता वाले आईपीएससी-सीएम की तैयारियों के बीच अंतर करने और मानव आईपीएससी-सीएम का अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक लक्षण वर्णन प्रदान करने का एक सरल, अभी तक शक्तिशाली तरीका है।

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Protocol

इस अध्ययन में वयस्क चूहा कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग कर प्रयोग माउंट सिनाई में इकाहान स्कूल ऑफ मेडिसिन के अनुमोदित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) प्रोटोकॉल के साथ किए गए थे । वयस्क चूहा कार्डियोमायोसाइट्स को पहलेवर्णित 16के रूप में लैंगेंडोर्फ आधारित विधि द्वारा स्प्राग डाले चूहा दिलों से अलग किया गया था।

1. मीडिया की तैयारी

  1. एचएसपीएससी मीडिया तैयार करें।
    1. पूरक और बेसल माध्यम से कमरे के तापमान (आरटी) को अलग करें। सुनिश्चित करें कि पूरक पूरी तरह से गल गया है। बेसल मीडियम का 400 मिलीआर और 0.22 माइक्रोन वैक्यूम-ड्रिवेन फिल्टर का उपयोग करके पूरक और फिल्टर का 100 मिलीएल मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और उपयोग से पहले आरटी को समान करें।
  2. आरपीएमआई + बी 27 तैयार करें।
    1. बी 27 पूरक और बेसल मीडियम (आरपीएमआई 1640) को आरटी में हासिल करें। सुनिश्चित करें कि पूरक पूरी तरह से गल गया है। बेसल मीडियम का 490 मिलीआर और 50x सप्लीमेंट का 10 मिलील मिलाएं और 0.22 माइक्रोन वैक्यूम ड्रिवेन फिल्टर का इस्तेमाल करके फिल्टर करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और उपयोग से पहले आरटी को समान करें।
  3. आरपीएमआई + बी27 (-) इंसुलिन तैयार करें।
    1. बी 27 (-) इंसुलिन सप्लीमेंट और बेसल मीडियम (आरपीएमआई 1640) को आरटी में हासिल करें। सुनिश्चित करें कि सप्लीमेंट पूरी तरह से गल गया है। बेसल मीडियम का 490 मिलीआर और 50x सप्लीमेंट का 10 मिलील मिलाएं और 0.22 माइक्रोन वैक्यूम ड्रिवेन फिल्टर का इस्तेमाल करके फिल्टर करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और उपयोग से पहले आरटी को समान करें।
  4. चयन मीडिया (आरपीएमआई (-) ग्लूकोज + बी 27 + लैक्टेट तैयार करें।
    1. बी 27 पूरक और बेसल मीडियम (आरपीएमआई 1640 (-) ग्लूकोज) को आरटी में अलग करें। सुनिश्चित करें कि पूरक पूरी तरह से गल गया है। बेसल मीडियम का 490 मिलीआर और 50x सप्लीमेंट का 10 मिलीएल मिलाएं, बाँझ पानी में गठित 4 एमएम सोडियम लैक्टेट जोड़ें, और 0.22 माइक्रोन वैक्यूम ड्रिवेन फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और उपयोग से पहले आरटी को समान करें।
  5. आरपीएमआई 20 तैयार करें।
    1. बेसल मीडियम (आरपीएमआई 1640) को आरटी मिक्स भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (20% फाइनल कंसंट्रेशन) और आरपीएमआई में मिला लें। 0.22 माइक्रोन वैक्यूम संचालित फिल्टर का उपयोग करफ़िल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग से पहले आरटी को समान करें।
  6. एचआईपीएससी मीडिया में रोसे-संबद्ध, कुंडलित-कुंडली युक्त प्रोटीन किनेज (रॉक) अवरोधक (2 माइक्रोएम अंतिम एकाग्रता) जोड़कर पासिंग मीडिया तैयार करें।
  7. जीएसके-3 अवरोधक, चरह 99021 को आरपीएमआई + बी 27 (-) इंसुलिन मीडिया (10 माइक्रोन फाइनल) में जोड़कर डी0 मीडिया तैयार करें।
  8. आरपीएमटीआई + बी27 (-) इंसुलिन मीडिया को आईडब्ल्यूआर-1 (5 माइक्रोएम फाइनल) के साथ मिलाकर D3 और D4 मीडिया तैयार करें।
    नोट: D1 और D5 मीडिया RPMI + B27 (-) इंसुलिन का गठन किया है । D7 मीडिया RPMI + B27 का गठन किया है।
  9. अवरुद्ध बफर तैयार करें (2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन [बीएसए], 2% एफबीएस, फॉस्फेट-बफर्ड लवण [पीबीएस]): 50 मिलीग्राम शंकुपूर्ण ट्यूब में 0.05% एनपी-40: बीएसए के 1 ग्राम, एफबीएस के 1 एमएल, पीबीएस के 49 एमएल और एनपी-40 के 250 माइक्रोन जोड़ें। पूरी तरह से भंग होने तक मिलाएं।

2. मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचएसएससी) की तैयारी- योग्य मैट्रिक्स कोटेड प्लेट्स और कवरस्लिप

नोट: एक निष्फल ऊतक संस्कृति हुड के तहत सभी कदम प्रदर्शन करते हैं ।

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर रात भर HESC-योग्य मैट्रिक्स स्टॉक समाधान गल । उचित एलिकोट वॉल्यूम निर्धारित करने के लिए उत्पाद विनिर्देश शीट को देखें क्योंकि यह स्टॉक के आधार पर भिन्न हो सकता है। इन एलिकोट्स को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज ट्यूब में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. कोटिंग प्लेटया ग्लास कवरस्लिप के लिए मैट्रिक्स का उपयोग करने के लिए, पहले 30 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एचएसईसी-योग्य मैट्रिक्स का एक बहाना गल।
  3. एक ५० mL शंकुन ट्यूब में ठंड Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) के Aliquot 24 mL: पोषक तत्वों का मिश्रण एफ-12 (DMEM/F:12) मीडिया ।
  4. पिपेट की सतह को ठंडा करने के लिए 2 मीटर ग्लास पिपेट के साथ ठंडे DMEM/F:12 मीडिया को मिलाएं ।
  5. एक ही पिपेट का उपयोग करके, लगभग 500−700 माइक्रोन कोल्ड डीएमईएम/एफ:12 लें और माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूब के भीतर एचएसईएससी-योग्य मैट्रिक्स एलिकोट के साथ मिलाएं।
  6. एक बार ठीक से मिश्रित, ५० mL शंकुट्यूब ठंडा DMEM युक्त करने के लिए समाधान हस्तांतरण/
  7. एक मानक 6 अच्छी तरह से थाली के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से इस मिश्रण का 1 mL जोड़ें। सुनिश्चित करें कि अच्छी तरह से पूरी तरह से कवर किया गया है। कम से कम 30 मिन के लिए ऊतक संस्कृति हुड के नीचे आर टी पर प्लेटें छोड़ दें। यदि वांछित हो, तो 1 सप्ताह तक चढ़ाना के तुरंत बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और उपयोग करने से पहले 30 मिन के लिए आरटी को समतुल्य करें।
  8. प्लेटों का उपयोग करने के लिए, मैट्रिक्स को एस्पिरेट करें और उपयुक्त मीडिया से प्रतिस्थापित करें। तुरंत उपयोग करें।
  9. एक बाँझ वातावरण में कांच कवरस्लिप स्टोर (उदाहरण के लिए, एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड के अंदर) ।
  10. कोटिंग से पहले, प्रत्येक व्यक्ति को 70% इथेनॉल के साथ कवरस्लिप को मिटा दें। एक बार कवरस्लिप सूखी होने के बाद इसे बाँझ 6 अच्छी प्लेट के कुएं के अंदर रखें।
  11. एचएसईएससी-योग्य मैट्रिक्स समाधान के 250−300 माइक्रोन लें और इसे सीधे ग्लास कवरस्लिप के केंद्र पर वितरित करें। उपयोग से पहले कम से कम 30 min के लिए ऊतक संस्कृति हुड के नीचे आर टी पर कवरस्लिप छोड़ दें।

3. छोटे अणुओं की तैयारी

नोट: डीएमएसओ में सभी छोटे अणुओं और WNt मॉड्यूलर का पुनर्गठन करें जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता।

  1. आईडब्ल्यूआर-1 और चिर 99021 के 25 माइक्रोन के 10 एमएम एलिकोट्स तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. थियाजोविविन (रॉक अवरोधक) के 50 माइक्रोन के 10 एमएम एलिकोट्स का पुनर्गठन करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. आईपीएससी का रखरखाव और पासिंग

नोट: एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड के तहत निम्नलिखित चरणों के सभी प्रदर्शन करते हैं।

  1. मानक 6 अच्छी प्लेटों में आईपीएससी बनाए रखें और बाँझ परिस्थितियों में सभी कदम प्रदर्शन करते हैं। प्रति अच्छी तरह से hiPSC मीडिया के 2 mL के साथ कोशिकाओं को बनाए रखें। हर दूसरे दिन मीडिया बदलें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 6% ओ2,5% सीओ2पर रखें। कोशिकाओं को पारित करना जब वे 70−80% के बीच हैं।
  2. सीए2 + और एमजी 2+ के बिना पीबीएस को आरटी में अलग करें।
  3. पासिंग प्रक्रिया शुरू करने के लिए, सीए2 + और एमजी2 + के बिना पीबीएस का 1 मिलील अच्छी तरह से जोड़ें जिसे पारित करने की आवश्यकता है। 7−10 मिन के लिए आरटी पर इनक्यूबेट। माइक्रोस्कोप के नीचे की कोशिकाओं की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पीबीएस उपचार के परिणामस्वरूप मोनोलेयर का पूरा वियोजन नहीं हुआ है।
  4. पीबीएस निकालें और पासिंग मीडिया के 1 mL के साथ बदलें। कोशिकाओं को कुएं की सतह से धीरे-धीरे कुरेदने और उठाने के लिए सेल लिफ्टर का उपयोग करें।
  5. यांत्रिक रूप से एक बाँझ 2 mL ग्लास पिपेट का उपयोग कर कोशिकाओं को अलग करें। तब तक दोहराएं जब तक कि कोशिकाओं को माइक्रोस्कोप के नीचे मनाए जाने पर छोटी उपनिवेशों में समान रूप से अलग न किया जाए।
  6. एक बार कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से अलग कर दिया गया है, कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए पासिंग मीडिया के 5 mL जोड़ें 1:6 । पसंदीदा विभाजन अनुपात से मेल खाने के लिए जोड़ा जाने वाला पासिंग मीडिया की राशि समायोजित करें।
  7. एचएसईएससी-योग्य मैट्रिक्स-कोटेड प्लेट से एचएसईएससी-योग्य मैट्रिक्स को एस्पिरेट करें और प्रति अच्छी तरह से पासिंग मीडिया के 1 मिलील के साथ प्रति स्थापित करें। प्रति अच्छी तरह से विसोसिएटेड कोशिकाओं के 1 मिलील जोड़ें।

5. कार्डियोमायोसाइट भेदभाव

  1. अच्छी तरह से स्थापित (20 से अधिक मार्ग) हैं कि hiPSC लाइनों का प्रयोग करें और हृदय भेदभाव शुरू करने से पहले एक सजातीय रूपविज्ञान प्रदर्शित करते हैं ।
  2. सुनिश्चित करें कि आईपीएससी लगभग 70−80% अभिप्रवाह हैं।
  3. सीए2 + और एमजी2 +के बिना पीबीएस में कोशिकाओं 1x धोलें।
  4. अच्छी तरह से प्रति डी0 मीडिया (चरण 1.7) के 2 mL जोड़ें और कोशिकाओं को वापस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
  5. 24 घंटे के बाद, 48 घंटे के लिए प्रति अच्छी तरह से D1 मीडिया के 3 mL के साथ बदलें।
  6. 3 दिन पर, मीडिया को प्रति अच्छी तरह से D3 मीडिया के 2 mL के साथ बदलें। 4 दिन पर D4 मीडिया के साथ दोहराएं ।
  7. 5 दिन पर, अच्छी तरह से प्रति D5 मीडिया के 3 mL के साथ मीडिया की जगह ।
  8. 7 दिन, मीडिया को प्रति अच्छी तरह से D7 मीडिया के 3 mL के साथ बदलें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2और सामान्य ओ2 एकाग्रता के साथ एक इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। हर 2 दिन में D7 (RPMI + B27) मीडिया की जगह।

6. चयन प्रक्रिया और आईपीएससी-सीएम विसोशन

  1. सीए2 + क्षणिक माप या किसी भी कार्यात्मक विश्लेषण करने से दस दिन पहले, RPMI + B27 मीडिया को 48 घंटे के लिए प्रति अच्छी तरह से चयन मीडिया के 3 मिलील के साथ प्रति वर्ष की जगह लें।
  2. एक और ४८ घंटे के लिए चयन मीडिया के 3 mL के साथ मीडिया की जगह ।
  3. 24 घंटे के लिए प्रति अच्छी तरह से RPMI + B27 मीडिया के 2 mL के साथ मीडिया की जगह ।
  4. कोट मानक 6 अच्छी तरह से प्लेटें के रूप में धारा 2 में वर्णित है ।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से EDTA के साथ बाँझ 0.25% ट्राइप्सिन के 1 mL जोड़ें। थाली को 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कर लें।
  6. 1,000 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके, कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से अलग करें ताकि माइक्रोस्कोप के नीचे मनाए जाने पर एकल कोशिकाओं को देखा जा सके।
  7. कोशिकाओं को एक बाँझ 15 mL शंकुट्यूब में स्थानांतरित करें और प्रति अच्छी तरह से आरपीएमआई 20 मीडिया के 2 एमआईएल जोड़ें। 800 x ग्रामपर 5 मिन के लिए सेंट्रलाइज।
  8. अधिष्णक्य को एस्पिरेट करें और आरपीएमआई + बी 27 मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। प्लेटों से एचएसईएससी-योग्य मैट्रिक्स को एस्पिरेट करें और आरपीएमआई + बी 27 मीडिया के 1 मिलील से बदलें।
  9. 1,000 mL पिपेट टिप का उपयोग करना, जब तक समाधान सजातीय दिखाई नहीं देता तब तक सेल पैलेट को यांत्रिक रूप से अलग कर दें।
  10. प्रत्येक अच्छी तरह से लगभग 500,000 कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में स्थानांतरण।
  11. 48 घंटे के लिए प्रति अच्छी तरह से चयन मीडिया के 3 mL के साथ मीडिया की जगह।
  12. मीडिया को प्रति अच्छी तरह से RPMI + B27 के 3 mL के साथ बदलें। कार्यात्मक विश्लेषण के लिए तैयार होने तक हर 2 दिनों में D7 मीडिया (RPMI + B2 बदलते मीडिया) में कोशिकाओं को बनाए रखें।

7. फ्लो साइटोमेट्री के लिए आईपीएससी-सीएम की तैयारी

  1. एक बार कोशिकाएं वांछित उम्र की होती हैं और मेटाबोलिक चयन (धारा 6) से गुजरी हैं, तो कोशिकाओं को सीए2 + और एमजी2 +के बिना पीबीएस से धोएं।
  2. ट्राइप्सिन 0.25% प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5−7 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. कोशिकाओं को अकेले करने के लिए पी1000 टिप के साथ मिश्रण 5−10x पिपेट करें, और आरपीएमआई 20 के 2 mL वाली 15 mL ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. कोशिकाओं को 5 मिन के लिए 600 x ग्राम पर स्पिन करें।
  5. सेल पैलेट में फिक्सेशन सॉल्यूशन (4% पीएफए) के 100 माइक्रोन जोड़ें। निरंतर, कोमल भंवर के साथ समाधान ड्रॉपवाइज जोड़ें और फिर 15 मिन के लिए बर्फ पर सेट करें।
  6. पीबीएस के 1.5 mL जोड़ें। कोशिकाओं को केंद्रीकरण द्वारा एकत्र करें और अधिनेत को एस्पिरेट करें।
  7. हर प्रयोग के लिए, निर्धारण/परमीबिलाइजेशन स्थिति के अनुसार एक अरंजित नियंत्रण शामिल करें ।
  8. आरटी में 30 मिन के लिए ब्लॉकिंग सॉल्यूशन (0.1% एनपी-40 के साथ पीबीएस में 2% एफबीएस/2% बीएसए) के 500 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  9. अवरुद्ध समाधान को हटाने के बिना, प्राथमिक एंटीबॉडी MLC2V/MLC2A (5 मिलीग्राम/एमएल), और आरटी में ४५ min इनक्यूबेट जोड़ें ।
  10. बफर को अवरुद्ध करने के साथ धोएं। सेंट्रलाइज्ड और एस्पिरेट सॉल्यूशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  11. माध्यमिक एंटीबॉडी एलेक्सा फ्लोर 555/488 (1:750) आरटी में ४५ मिन के लिए अवरुद्ध बफर में पतला या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर जोड़ें ।
  12. पीबीएस के 1.5 mL जोड़ें। सेंट्रलाइज्ड और एस्पिरेट सॉल्यूशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  13. पीबीएस के 250−300 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को अलग करने के लिए P1000 पिपेट का उपयोग करें।
  14. 35 माइक्रोन नायलॉन जाल सेल छलनी टोपी के साथ गोल नीचे ट्यूब तैयार करें। पीबीएस के 50 माइक्रोन के साथ सेल छलनी को प्री-वेट करें और ट्यूब को बर्फ पर सेट करें।
  15. सेल छलनी टोपियां के साथ गोल नीचे ट्यूबों के लिए अलग कोशिकाओं के साथ समाधान हस्तांतरण। कोशिका समाधान को स्वाभाविक रूप से छानने या ट्यूब में कोशिकाओं के पूर्ण जल निकासी और संग्रह को सुनिश्चित करने के लिए, आवश्यक के रूप में एक फ्लैट सतह के खिलाफ ट्यूब के नीचे टैप करने की अनुमति दें। जितनी जल्दी हो सके बर्फ पर ट्यूब वापस सेट करने के लिए सुनिश्चित करें।
  16. किसी भी अवशिष्ट कोशिकाओं को ठीक करने के लिए पीबीएस के 250 माइक्रोन के साथ सेल छलनी कुल्ला।
  17. बर्फ पर ट्यूबों को बनाए रखें और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण तक एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें।

8. ग्लास कवरस्लिप पर पैचढ़ाना कार्डियोमायोसाइट्स

नोट: एक बाँझ वातावरण में सभी कदम प्रदर्शन करते हैं।

  1. 2.10 और 2.11 चरणों में वर्णित ग्लास कवरस्लिप तैयार करें।
  2. एक बार जब आईपीएससी-सीएम का चयन हो जाता है और वांछित आयु के होते हैं, तो आईपीएससी-सीएम को अलग करने के लिए 6.5−6.7 कदमों का पालन करें।
  3. अधिवनाद और RPMI 20 मीडिया की एक पर्याप्त राशि में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए २५० μL प्रति लगभग ३००,००० कोशिकाओं है ।
  4. 2 एमएल ग्लास पिपेट का उपयोग करके, समाधान सजातीय दिखाई देने तक सेल पैलेट को यांत्रिक रूप से अलग कर दें।
  5. कवरस्लिप से एचएसईएससी-योग्य मैट्रिक्स को एस्पिरेट करें।
  6. 1000 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके, 15 मिलील शंकुई ट्यूब से समाधान के 250 माइक्रोन को मिलाएं और खींचें।
  7. धीरे-धीरे ग्लास कवरस्लिप पर समाधान के 250 माइक्रोन को वितरित करें, केवल उस क्षेत्र में जोड़ने के लिए अतिरिक्त देखभाल करें जहां एचएसईएससी-योग्य मैट्रिक्स कोटिंग मौजूद है।
  8. इनक्यूबेटर को ध्यान से स्थानांतरित करें और रात भर छोड़ दें, ध्यान रखें कि कवरस्लिप पर कोशिकाओं को हिलाया या फैलाएं नहीं। अगली सुबह, धीरे-धीरे कवरस्लिप के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से D7 (RPMI + B27) मीडिया के 2 mL जोड़ें। 24 घंटे के बाद और उसके बाद हर 2 दिन में मीडिया बदलें।

9. फिक्सिंग कोशिकाएं

  1. सुनिश्चित करें कि सीए 2+ और एमजी2+ के साथ पर्याप्त मात्रा में पीबीएस को 4 डिग्री सेल्सियस तक समान किया जाए।
  2. सीए2 + और एमजी2+ के साथ पीबीएस में पतला 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस तक समान करें।
  3. एक बार जब आईपीएससी-सीएम उचित आयु के होते हैं, तो मेटाबोलिक चयन (धारा 6) से गुजरे हैं, और कवरस्लिप (सेक्शन 8) पर चढ़ाया गया है, कोशिकाओं को सीए2 + और एमजी 2+ प्रति अच्छी तरह से सर्दी पीबीएस के 1 मिलील से धोएं।
  4. ठंड 4% पीएफए के 1 mL जोड़ें और 15 मिन के लिए हुड के नीचे आर टी पर कोशिकाओं को छोड़ दें ।
  5. अतिरिक्त पीएफए को हटाने के लिए कोशिकाओं को ठंडे पीबीएस से धोएं।
  6. सीए2+ और एमजी2+ के साथ पीबीएस के 2 मिलील जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

10. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. निश्चित कोशिकाओं से पीबीएस निकालें और बफर को अवरुद्ध करने का 1 मिलील जोड़ें। आरटी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट ।
  2. ब्लॉकिंग बफर निकालें और बफर को अवरुद्ध करने में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (5 मिलीग्राम/mL) जोड़ें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  3. 5 मिन के लिए सीए2 + और एमजी 2+ के साथ पीबीएस में 3x धोएं।
  4. बफर 1:1,000 को अवरुद्ध करने में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें।
  5. इसे आरटी में 45 मिन के लिए प्रकाश और इनक्यूबेट से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट को कवर करें। निम्नलिखित चरणों के लिए एल्यूमीनियम पन्नी रखें।
  6. सीए2 + और एमजी 2+, 5 मिन प्रत्येक के साथ पीबीएस में 3x धोएं।
  7. पूरी तरह से कोशिकाओं को कवर करने के लिए DAPI काम समाधान की एक पर्याप्त राशि जोड़ें और 10 मिन के लिए आरटी पर इनक्यूबेट ।
  8. अतिरिक्त डीपीआई को हटाने के लिए सीए2 + और एमजी2 + के साथ पीबीएस के साथ नमूना को अच्छी तरह से धोलें।
  9. नई स्लाइड लें और बीच में बढ़ते मीडिया की एक बूंद जोड़ें। बढ़ते मीडिया को समान रूप से फैलाने के लिए ड्रॉपर का उपयोग करें। स्लाइड्स पर कोशिकाओं के चेहरे के साथ कवरस्लिप रखो।
    नोट: कोशिकाओं को प्रकाश से सुरक्षित होने पर 30 दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

11. इंट्रासेल्युलर सीए2 + ट्रांसिएंट्स का आकलन

  1. एक बार जब आईपीएससी-सीएम कम से कम 3 महीने पुराने होते हैं, तो मेटाबोलिक चयन (धारा 6) से गुजरे हैं, और कवरस्लिप पर चढ़ाया गया है, उन्हें फुरा-2 के 2 माइक्रोन के साथ इलाज करें, AM (अंतिम एकाग्रता: 1 μM) और 10 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: फुरा-2 प्रकाश संवेदनशील है। अंधेरे में सभी लोडिंग प्रक्रियाओं और प्रयोगों को करें।
  2. कैल्शियम और संकुचन अधिग्रहण और विश्लेषण प्रणाली तैयार करें।
    1. यह सुनिश्चित करने वाली प्रणाली को शक्ति दें कि चाप लैंप शुरू किया गया है(चित्रा 1बी)।
    2. कक्ष को सिस्टम पर रखें और पंप से ट्यूबों को उपयुक्त इनलेट और आउटलेट्स और बिजली के तार को उत्तेजक से कक्ष तक कनेक्ट करें जैसा कि चित्र ा 1सीमें दिखाया गया है।
    3. तरल इनलाइन हीटर के माध्यम से चलने वाली परफ्यूजन ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस प्रीवार्म्ड टाइरोड के समाधान के साथ भरें।
    4. पृष्ठभूमि क्षेत्र को कम करने के लिए कैमरा और एपर्चर आयाम तैयार करें।
  3. चैंबर में आईपीएससी-सीएम के साथ एक ग्लास कवरस्लिप माउंट करें और जकड़ना।
  4. बांधा ग्लास कवरस्लिप के शीर्ष पर सीधे टाइरोड के समाधान के 500 माइक्रोन जोड़ें और टाइरोड के समाधान के साथ कक्ष (1.5 mL/min) को परफ्यूज करना शुरू करें।
  5. विद्युत उत्तेजक (10 वी, 4 एमएस) का उपयोग करके 1 हर्ट्ज फील्ड उत्तेजना के साथ पेस आईपीएससी-सीएम।
  6. कोशिकाओं के लिए कम से कम 3−5 मिन के लिए उत्तेजना के साथ कक्ष में आईपीएससी-सीएम इनक्यूबेट फुरा-2 रंग धोने और पर्यावरण के अनुकूल और फ्लोरोसेंट रंगे को धोने के लिए।
  7. देखने की खिड़की को ग्लास कवरस्लिप के बाएं ऊपरी क्षेत्र में समायोजित करें।
  8. रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं।
  9. 5−10 चोटियों की एक सुसंगत धारा इकट्ठा करने के बाद, अस्थायी रूप से रिकॉर्डिंग बंद करने के लिए ठहराव पर क्लिक करें।
  10. यह सुनिश्चित करना कि न तो ध्यान और न ही देखने की खिड़की के आयामों को बदल रहे हैं, माइक्रोस्कोप के मंच को आसन्न क्षेत्र में ले जाएं, विपरीत छोर की ओर बढ़ें, और रिकॉर्डिंग फिर से शुरू करें।
  11. कवरस्लिप के पार स्कैन करने के लिए 11.9 और 11.10 चरणों को दोहराएं, शुरू में बाईं ओर बढ़ते हैं, फिर पूरे कवरस्लिप क्षेत्र को कवर करने के लिए एक टेढ़े-मेढ़े फैशन में नीचे की ओर बढ़ते हैं। इसमें प्रति कवरस्लिप 80−100 माप होते हैं।
    नोट: कुल माप समय को 10 सीन तक सीमित करें क्योंकि माध्यमिक कारक सीए2 + क्षणिक में कमी का कारण बनते हैं।
  12. एक बार सीए2 + यात्रियों का अधिग्रहण कर लिया जाता है, तो निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ्लोरेसेंस निशान विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण करें।

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Representative Results

चित्रा 1में वर्णित प्रोटोकॉलअत्यधिक शुद्ध कार्डियोमायोसाइट्स उत्पन्न होता है जो संस्कृति में समय के साथ एक वेंट्रिकुलर/वयस्क की तरह फेनोटाइप प्राप्त करता है। जैसा कि एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसिन नियामक प्रकाश श्रृंखला 2 आइसोफॉर्म (एमएलसी 2ए और एमएलसी 2वी, क्रमशः) के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया गया है, इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न अधिकांश कोशिकाएं हृदय विभेदन के शामिल होने के बाद 30 दिन में एमएलसी2ए-सकारात्मक थीं, जबकि एमएलसी 2वी को एक ही समय बिंदु(चित्रा 2ए,शीर्ष पैनल) पर बहुत कम मात्रा में व्यक्त किया गया था। जैसे-जैसे संस्कृति में समय बढ़ गया (दिन 60 और 90), MLC2 आइसोफॉर्म (MLC2A से MLC2V) का एक पूरा स्विच मनाया गया(चित्रा 2ए,नीचे पैनल)। एमएलसी2ए और एमएलसी2वी-पॉजिटिव कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण किया गया था। प्रतिरक्षण परिणामों के अनुसार, प्रवाह साइटोमेट्री डेटा प्रारंभिक चरण (दिन 30) iPSC-सीएम ज्यादातर MLC2A (२९.८% MLC2A + बनाम व्यक्त का प्रदर्शन किया । 1.9% MLC2V +) (देखें Figure 2B,बाएं पैनल), देर से चरण (दिन 90) iPSC-सीएम की तुलना में, जो ज्यादातर MLC2V (41.3% MLC2V + बनाम 16.7% MLC2A +) (देखें चित्रा 2बी,दाएं पैनल) की तुलना में। क्योंकि MLC2A और MLC2V के अभिव्यक्ति पैटर्न हृदय भेदभाव और परिपक्वता की एक बानगी के रूप में जाना जाता है, इन परिणामों का सुझाव है कि लंबे समय तक संस्कृति समय आईपीएससी-सीएम की परिपक्वता बढ़ जाती है और कोशिकाओं के बहुमत के लिए वेंट्रिकुलर फेनोटाइप के लिए प्रतिबद्ध दिखाई देते हैं । इसके बाद हमने सीए2 + हैंडलिंग परिपक्वता के समय निर्भरता का आकलन किया । सीए2 + क्षणिक तीन भेदभाव समय (दिन 30, 60, और 90) पर आईपीएससी-सीएम में मापा गया था, और अलग वयस्क चूहा कार्डियोमायोसाइट्स (ARCMs) की तुलना में। सीए2 + आयाम 90 दिन में आईपीएससी-सीएम में काफी बढ़ा था और एआरसीएएमएस(चित्रा 3ए, बी)के समान था। 90 दिन में सीए2 + रीटेक (क्षय-ताऊ) की दर 30 दिन की तुलना में काफी तेज थी, और एआरसीएमएस(चित्रा 3सी)के करीब थी। सीए2 + यात्रियों पर एड्रेनेर्गिक उत्तेजना के प्रभाव का मूल्यांकन 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए आइसोप्रोटेरोल (आईएसओ) के 10 एनएम के साथ कोशिकाओं का इलाज करके किया गया था। जैसा कि एआरसीएमएस में देखा गया है, आईएसओ ने सीए2 + क्षणिक वृद्धि की और दिन 90 आईपीएससी-सीएम में सीए2 + रीटेक की दर में तेजी लाई। 30 आईपीएससी-सीएम(चित्रा 3डी-एफ)में कोई बदलाव नहीं देखा गया । दिलचस्प बात यह है कि दिन 90 आईपीएससी-सीएम एआरसीएमएस(चित्रा 4बी)में देखे गए समान तरीके से विद्युत उत्तेजना (0.5−3 हर्ट्ज से) का पालन करने में सक्षम थे। एक साथ लिया गया, इन परिणामों से पता चलता है कि इस विधि से प्राप्त आईपीएससी-सीएम में देशी सीएम, विशेष रूप से वेंट्रिकुलर जैसे फेनोटाइप, परिपक्व सीए2 + हैंडलिंग गुण, और सकारात्मक एड्रेनेर्गिक प्रतिक्रियाओं में देखे गए लोगों के समान विशेषताएं हैं।

नॉनकार्डिक कोशिकाओं को दूषित करने से भेदभाव17के दौरान मानव आईपीएससी-सीएम की कार्यात्मक परिपक्वता प्रभावित हो सकती है । चित्रा 4ए उच्च दक्षता भेदभाव (शीर्ष पैनलों, वीडियो 1),विशिष्ट वेंट्रिकुलर मार्कर (MLC2V) से प्राप्त 3 महीने पुरानी कोशिकाओं के बीच एक तुलना दिखाता है, और 3 महीने पुरानी कोशिकाओं को कम दक्षता भेदभाव (नीचे पैनलों, वीडियो 2)से प्राप्त, आईपीएससी-सीएम अल्फा चिकनी मांसपेशी actin (αSMA) के साथ मिश्रित दिखा-सकारात्मक कोशिकाओं । दिलचस्प बात यह है कि कार्यात्मक विश्लेषण ने उच्च दक्षता विभेदन से आईपीएससी-सीएम की तुलना में मिश्रित आईपीएससी-सीएम/गैर-सीएम तैयारी में सीए2 + यात्रियों को बदल दिया । विशेष रूप से, कम दक्षता विभेदन से प्राप्त कोशिकाओं ने शुद्ध आईपीएससी-सीएम(चित्रा 4बी,शीर्ष पैनल) और एआरवीसी(चित्रा 4बी,बॉटम पैनल) की तुलना में बहुत छोटे सीए2 + आयाम और स्वचालितता(चित्र4बी,मध्य पैनल) का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, कम दक्षता भेदभाव से कोशिकाओं अतालता पैटर्न प्रस्तुत(चित्र4सी)।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि चित्रा 4ए के शीर्ष पैनल में दिखाए गए आईपीएससी-सीएम का मेटाबोलिक चयन भी हुआ, जो आईपीएससी-सीएम की आबादी को और समृद्ध करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है जो पहले से ही अत्यधिक कुशल विभेदन से प्राप्त है । इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि उच्च गुणवत्ता वाले सीएम उत्पन्न करने वाले उच्च दक्षता हृदय विभेदन प्रोटोकॉल विट्रो में कार्डियक फेनोटाइप को सही ढंग से फिर से तैयार करने के लिए आवश्यक हैं।

चित्रा 5 1,200 एस के समय पाठ्यक्रम पर साजिश रची, सीएम मोनोलेयर के विभिन्न क्षेत्रों में सीए2 + आयाम परिवर्तनशीलता से पता चलता है। 1 हर्ट्ज (200 एस) की उत्तेजना आवृत्ति की शुरुआत में मापा गया सीए2 + आयाम अत्यधिक परिवर्तनशील था और उत्तेजना जारी रहने (200−900 एस) के रूप में अधिक सुसंगत हो गया। हालांकि, 900 एस की समय अवधि के बाद सीए2 + आयाम काफी कम हो गया था। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि, जब iPSC-सीएम में सीए2 + यात्रियों की रिकॉर्डिंग, यह आवश्यक है कि कोशिकाओं को कम से कम 200 एस के लिए निरंतर उत्तेजना के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर होने दें। इसके अतिरिक्त, रिकॉर्डिंग को प्रजनन योग्य परिणाम सुनिश्चित करने के लिए एक विशिष्ट समय खिड़की (200−900 एस) तक सीमित रहना होगा।

Figure 1
चित्रा 1: आईपीसी-सीएम तैयारी और सीए2 + क्षणिक उपकरणों की समग्र योजनाबद्ध । (A)हृदय विभेदन प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध आईपीएससी में अंतर के विकासात्मक चरणों को दर्शाया गया है । स्केल बार = 50 माइक्रोन। (ख)कैल्शियम और संकुचन अधिग्रहण और विश्लेषण प्रणाली । क)पेरिस्टिलिटिक पंप बी)उल्टे माइक्रोस्कोप सीडिजिटल कैमरा डीके लिए पावर सोर्स) इलेक्ट्रिकल उत्तेजक ई)फ्लोरेसेंस सिस्टम इंटरफेस एफ)फिल्टर व्हील कंट्रोलर(सी)सिस्टम चैंबर । क)सिस्टम चैंबर बॉडी। ख)द्रव इनलेट। ग)द्रव आउटलेट। द)फ्लूइडिक इनलाइन सॉल्यूशन हीटर। च)विद्युत उत्तेजक से सिस्टम चैंबर को जोड़ने वाले इलेक्ट्रोड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आईपीएससी-सीएम में एमएलसी2ए और एमएलसी2वी अभिव्यक्ति की तुलना विभिन्न दिनों में भेदभाव के विभिन्न दिनों में । (A)एमएलसी2ए और एमएलसी 2वी के लिए भेदभाव के बाद 30, 60 और 90 दिन में आईपीएससी-सीएम का इम्यूनोफ्लोरेंस धुंधला। स्केल बार = 20 माइक्रोन। (ख)एमएलसी 2वी और एमएलसी 2ए के लिए आईपीएससी-सीएम का फ्लो साइटोमेट्री एनालिसिस 1 महीने और 3 महीने के बाद भेदभाव पर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: भेदभाव के विभिन्न दिनों में आईपीएससी-सीएम गुणों की तुलना। (क)प्रतिनिधि सीए2 + विभेदन के विभिन्न दिनों में क्षणिक निशान । (बी-सी) औसत सीए2 + आयाम और सीए2 + क्षय 1 हर्ट्ज पर उत्तेजना के दौरान प्राप्त किया गया ।(डी-एफ)आइसोप्रोटेरोनॉल (आईएसओ, 10 एनएम) उपचार के प्रभाव को विभेदन के विभिन्न दिनों में आईपीएससी-सीएम में । ARCMs अलग चूहा वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स का संकेत देते हैं । एन = 70−100 क्षेत्र; * पी एंड एलटी; 0.05; पी एंड एलटी; 0.001, जैसा कि छात्र टी-टेस्ट द्वारा निर्धारित किया गया है। डेटा मतलब ± S.E.M. के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: आईपीएससी-सीएम की उच्च दक्षता और कम दक्षता भेदभाव के बीच तुलना। }एलेमा और एमएलसी2वी के लिए आईपीएससी-सीएम का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला। स्केल बार = 20 माइक्रोन। (ख)प्रतिनिधि उच्च दक्षता (ऊपर) और कम दक्षता (मध्य) भेदभाव, और अलग चूहा वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स (नीचे) से सीए2 + यात्रियों को दिखा निशान । माइकोसाइट्स को 0.5 हर्ट्ज, 1 हर्ट्ज, 1.5 हर्ट्ज, 2 हर्ट्ज और 3 हर्ट्ज(सी)प्रतिनिधि ट्रेस में प्रेरित किया गया था जो खराब भेदभाव से अतालता पैटर्न दिखा रहा था। तीर बिंदु पेसिंग का संकेत देते हैं। ARCMs अलग चूहा वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एक ही कवरस्लिप से समय पर निर्भर सीए2 + आयाम। कवरस्लिप में विभिन्न क्षेत्रों से सीए2 + आयामों को समय-निर्भर तरीके से प्लॉट किया गया था। सीए2 + क्षणिक को मापने के लिए गैर-अनुशंसित समय अवधि धराशायी क्षेत्रों (<200 s या >900 s) में इंगित की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Video 1
वीडियो 1: प्रतिनिधि वीडियो जिसमें उच्च दक्षता भेदभाव का उदाहरण दिखाया गया है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Video 2
वीडियो 2: प्रतिनिधि वीडियो कम दक्षता भेदभाव का एक उदाहरण दिखा। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Video 3
वीडियो 3: प्रतिनिधि वीडियो एक ग्लास कवरस्लिप पर आईपीएससी-सीएम के सजातीय मोनोलेयर वितरण का एक उदाहरण दिखा । इस वीडियो की सिफारिश की सेल घनत्व कार्यात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए दिखाता है । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Video 4
वीडियो 4: प्रतिनिधि वीडियो एक ग्लास कवरस्लिप पर चढ़ाया एक कम दक्षता भेदभाव से कोशिकाओं का एक उदाहरण दिखा । वीडियो में कोशिकाओं को कम दक्षता भेदभाव से प्राप्त किया गया था। इस तरह के भेदभाव से कोशिकाओं को आमतौर पर कवरस्लिप भर में सजातीय रूप से वितरित नहीं किया जाता है और लगातार पिटाई कोशिकाओं को ढूंढना मुश्किल होता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में मानव आईपीएससी-सीएम का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) पैदा करना जो लगातार प्रदर्शन और प्रजनन योग्य परिणाम सुनिश्चित कर सकते हैं; 2) कोशिकाओं को उनके फेनोटाइप का पर्याप्त रूप से आकलन करने के लिए कम से कम 90 दिनों तक संस्कृति में परिपक्व होने की अनुमति देता है; 3) मानव आईपीएससी-सीएम के शारीरिक रूप से प्रासंगिक कार्यात्मक लक्षण वर्णन प्रदान करने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन, उदाहरण के लिए कैल्शियम (सीए2 +)क्षणिक माप, प्रदर्शन करना। हमने एक मोनोलेयर-आधारित विभेदन विधि विकसित की है जो उच्च गुणवत्ता वाली वेंट्रिकुलर जैसी आईपीएससी-सीएम का उत्पादन करती है। हमारी विधि कई महत्वपूर्ण कारकों पर निर्भर करती है और मौजूदा प्रोटोकॉल14,18का एक संस्करण है . अन्य प्रोटोकॉल के विपरीत, यह एक आईपीएससी रखरखाव के लिए कम ऑक्सीजन की स्थिति (5% O2)का उपयोग करता है और साथ ही सीएम में उनके भेदभाव के पहले सप्ताह के दौरान । ऑक्सीजन का निम्न स्तर भ्रूण और भ्रूण हृदय विकास19के दौरान पर्यावरण की स्थिति की नकल करता है । आईपीएससी प्रसार और बाद में सीएम20में उनके भेदभाव को बढ़ाने के लिए हाइपोक्सिक स्थितियां भी दिखाई गई हैं । सीडिंग घनत्व और उचित आईपीएससी पासिंग भी एक सफल हृदय भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं। उच्च विभेदन दक्षता तब देखी जाती है जब 70−80% कन्फ्लोरेंट आईपीएससी को एंजाइम-मुक्त समाधान का उपयोग करके छोटे सेल समुचित में अलग किया जाता है, और 1:6 के विभाजन अनुपात में वरीयता प्राप्त होती है। हृदय विभेदन तब शुरू किया जा सकता है जब कोशिकाएं 70−80% की स्थिरता तक पहुंचती हैं, विभाजन के लगभग 4 दिनों बाद की उम्मीद होती है। अंतर की शुरुआत में CHIR99021 (10 μM) उपचार महत्वपूर्ण कोशिका मौत का कारण होगा। हालांकि, सेल प्रसार मनाया जाता है जब अगले दिन चिर 99021 संस्कृति से हटा दिया जाता है। कोशिका मृत्यु और प्रसार के बीच एक सही संतुलन भेदभाव के दौरान एक मोनोलेयर संस्कृति के संरक्षण के लिए आवश्यक है, जो एक सफल भेदभाव के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक है । यदि आईपीएससी घनत्व या तो बहुत कम या बहुत अधिक है, तो बाद का भेदभाव कम दक्षता हृदय विभेदन(चित्र 4ए, वीडियो 2)होगा। चित्र4ए कम दक्षता भेदभाव का ऐसा उदाहरण दिखाता है, जहां स्वस्थ दाता से प्राप्त कार्डियोमायोसाइट्स को अन्य कोशिका प्रकारों के साथ मिलाया जाता है, जैसे α-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन-पॉजिटिव कोशिकाएं। महत्वपूर्ण बात यह है कि ऐसी तैयारियों से दर्ज सीए2 + यात्रियों ने कम सीए2 + आयाम और अतालता पैटर्न जैसी बदली हुई विशेषताओं को दिखाया, जिन्हें आसानी से जैविक भिन्नता के रूप में गलत तरीके से समझा जा सकता है। एक ही सेल लाइन से एक सफल और उच्च दक्षता भेदभाव, बजाय, वेंट्रिकुलर की तरह कार्डियोमायोसाइट्स की एक शुद्ध आबादी उत्पन्न(चित्र4ए, वीडियो 1)नियमित रूप से Ca 2+ यात्रियों के साथ(चित्रा 4बी,शीर्ष पैनल) । इस प्रकार, भेदभाव की गुणवत्ता सीए2 + क्षणिक के समग्र परिमाण, आकार, नियमितता और आवृत्ति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है।

एक सफल और कुशल भेदभाव का एक और महत्वपूर्ण पहलू कार्डियोमायोसाइट्स की समृद्ध आबादी प्राप्त करना है। जबकि अविभेदित स्टेम सेल और अन्य आईपीएससी-व्युत्पन्न सेल प्रकार एक ऊर्जा स्रोत के रूप में ग्लूकोज का उपयोग करते हैं, सीएम एटीपी और ग्लूटामेट उत्पादन21के लिए कुशलता से लैक्टेट का उपयोग कर सकते हैं । इस प्रकार, सीएम की एक भी शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं को लैक्टेट-पूरक और ग्लूकोज-समाप्त संस्कृति माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है। हालांकि, लंबे समय तक इस चुनिंदा मीडिया में आईपीएससी-सीएम की जागृति, कार्यात्मक हानि का कारण बन सकती है । इसलिए, आईपीएससी-सीएम को शुद्ध करने और अभी भी उनके कार्य को संरक्षित करने के लिए, मेटाबोलिक चयन केवल 10 दिनों के लिए किया जाता है, दिनों से 80−90 दिनों से भेदभाव प्रेरण के बाद से। इस अवधि के बाद, चयन मीडिया को बदल दिया जाता है, और कोशिकाओं को आरपीएमआई/बी 27 मीडिया में बनाए रखा जाता है। जबकि चयन प्रोटोकॉल को बहुत पहले22 (उदाहरण के लिए, 15 दिन के आसपास) लागू किया जा सकता है, यह 80 दिन तक इंतजार करने की सलाह दी जाती है, क्योंकि ऐसा करने से अवशिष्ट आईपीएससी या अन्य सेल प्रकारों को कार्यात्मक अध्ययन (दिन 90) के लिए तैयार होने के समय तक अवशिष्ट आईपीएससी या अन्य सेल प्रकारों को रोका जा सकता है। इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि एक सफल, कुशल और मजबूत हृदय विभेदन के लिए उपरोक्त सभी कारकों को ध्यान में रखा जाता है ।

कार्डियक भेदभाव प्रोटोकॉल, परिपक्वता और सेल प्रकार विनिर्देश (जैसे, अलिंद और वेंट्रिकुलर सेल प्रकार) की मजबूती और दक्षता के अलावा भी कार्डियोकार्डिक रोग मॉडल के लिए आईपीएससी-सीएम का उपयोग करने के लिए एक बड़ी चुनौती पैदा करते हैं। पिछले कुछ वर्षों में, कई आशाजनक परिपक्वता रणनीतियों की सूचना दी गई है, जिसमें विद्युत उत्तेजना, यांत्रिक खिंचाव और सब्सट्रेट कठोरता23शामिल हैं। हालांकि, आईपीएससी-सीएम की लंबे समय तक इन विट्रो संस्कृति वयस्क जैसी कार्डियोमाइओसाइट्स24,25उत्पन्न करने के लिए एक सरल और व्यावहारिक दृष्टिकोण बनी हुई है।

अन्य प्रकाशित रिपोर्टों के अनुरूप12,आईपीएससी-सीएम इस इन विट्रो विडेशन प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न वेंट्रिकल-विशिष्ट MLC2V की मजबूत अभिव्यक्ति और 90 दिन में एमएलसी 2ए के बहुत निचले स्तर(चित्रा 2ए, बी)दिखाते हैं। जबकि भ्रूण सीएम दोनों MLC2A और MLC2V आइसोफॉर्म होते हैं, वयस्क वेंट्रिकुलर सीएम केवल MLC2V होते हैं । एमएलसी आइसोफॉर्म की व्यापकता में यह स्विच नवजात चरण26के दौरान होता है ।

इस प्रोटोकॉल एक्सप्रेस वेंट्रिकुलर विशिष्ट मार्कर के माध्यम से उत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स, जैसे MLC2V, जो उत्तरोत्तर बहुतायत में बढ़ जाता है क्योंकि कोशिकाओं को संस्कृति में लंबे समय तक रखा जाता है(चित्रा 2ए, बी)। यह इंगित करता है कि लंबे समय तक इन विट्रो संस्कृति सीएम की परिपक्वता को बढ़ाती है जो वेंट्रिकुलर फेनोटाइप के लिए प्रतिबद्ध प्रतीत होती है।

संस्कृति में समय भी सीए2 + हैंडलिंग परिपक्वता 24,25को बहुत प्रभावित करता है । पिछली रिपोर्टों में बताया गया था कि भेदभाव प्रेरण के 20 दिनों के बाद, कैलसी सीए2 + यात्रियों में कोई बड़ा परिवर्तन नहीं हुआ क्योंकि कोशिकाएं25वर्ष की हो गईं । हालांकि, यहां विस्तृत प्रोटोकॉल से उत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स सीए2 + आयाम और सीए2 + क्षय में तीन बार मूल्यांकन किए गए बिंदुओं (30, 60, और हृदय भेदभाव के शामिल होने के 90 दिनों के बाद)(चित्रा 3ए-सी)में प्रगतिशील परिवर्तन दिखाते हैं। दिलचस्प बात यह है कि इन आंकड़ों से पता चलता है कि सीए2 + क्षणिक मापदंड, जैसे सीए2 + आयाम और सीए 2+ क्षय, दिन में मापा गया 90 आईपीएससी-सीएम अलग चूहा वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स (एआरसीएमएस) में मापा गया उन लोगों के समान था। इसके अलावा, 90 दिनों पुराने आईपीएससी-सीएम भी एआरसीएमएस(चित्रा 4बी)के समान 0.5 हर्ट्ज से लेकर 3 हर्ट्ज तक विभिन्न विद्युत उत्तेजनाओं का पालन करने में सक्षम थे। भविष्य के काम में, यह देखना दिलचस्प होगा कि कैसे संस्कृति में एक भी लंबे समय से इन आईपीएससी-सीएम की कार्यात्मक विशेषताओं को प्रभावित करता है एआरसीएम की तुलना में ।

इसके अतिरिक्त, चूंकि कार्डियक इंडक्शन27के बाद एड्रेनेर्गिक रिसेप्टर सिग्नलिंग एक अलग समय-निर्भर मटुकपैटर्न दिखाता है, इसप्रोटोकॉल के माध्यम से उत्पन्न आईपीएससी-सीएम में सीए2 + क्षणिक पर आइसोप्रोटेरोनॉल का प्रभाव परीक्षण किया गया था। आइसोप्रोटेरेनॉल के साथ उत्तेजना ने एआरसीएमएस(चित्रा 3डी-एफ)में जो मनाया जाता है, उसके समान दिन 90 आईपीएससी-सीएम में सकारात्मक लुसिट्रोपिक प्रतिक्रिया का नेतृत्व किया।

इस अध्ययन में किए गए आईपीएससी-सीएम के कार्यात्मक आकलन में अलग-थलग वयस्क सीएम की तुलना में कुछ मतभेद और सीमाएं हैं। वयस्क सीएम अच्छी तरह से विकसित और अच्छी तरह से व्यवस्थित sarcomeres है । यह सरकोमे आंदोलन का पता लगाने के माध्यम से संकुचन माप के लिए अनुमति देता है। क्योंकि वर्तमान प्रोटोकॉल में से कोई भी पूरी तरह से परिपक्व उत्पन्न नहीं करता है, वयस्क जैसे iPSC-सीएम, सरकोमे का पता लगाने के माध्यम से संकुचन माप संभव नहीं हैं। हालांकि सेल अनुबंध ों के दौरान सेल किनारों के आंदोलन का पता लगाना संभव है, लेकिन आईपीएससी-सीएम में सटीक तरीके से उन आंदोलनों को ट्रैक करना काफी अधिक चुनौतीपूर्ण है। अभी तक, इन कोशिकाओं में संकुचन के सटीक आकलन के लिए अनुमति देने के लिए तकनीकी प्रगति की आवश्यकता है। दूसरी ओर, फुरा-2 जैसे सीए2 + संकेतक का उपयोग करके आईपीएससी-सीएम के सीए 2+ यात्रियों को मापना संभव है। वयस्क सीएम के विपरीत, हालांकि, आईपीएससी-सीएम संकुल हैं और उनके पास एक अच्छी तरह से परिभाषित सीमा नहीं है। इसलिए, दर्ज किए गए सीए2 + क्षणिक आमतौर पर एक ही कोशिका का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, बल्कि एक विशिष्ट क्षेत्र में कोशिकाओं का एक समूह होता है। हालांकि क्षेत्र के आकार को समायोजित करना संभव है, एक ही सेल से सीए2 + यात्रियों को रिकॉर्ड करना अविश्वसनीय रूप से चुनौतीपूर्ण है। यह महत्वपूर्ण है कि जब सीएम कवरस्लिप पर चढ़ाया जाता है, तो घनत्व ऐसा होता है कि वे एक समरूप मोनोलेयर वितरण(वीडियो 3)प्राप्त करते हैं, जो कोशिकाओं के साथ लगातार क्षेत्रों को खोजने की अनुमति देता है। यदि कोशिकाओं को कवरस्लिप(वीडियो 4)पर मोनोलेयर के रूप में वितरित नहीं किया जाता है, तो कोशिकाओं के बिना क्षेत्र होंगे, और यदि कवरस्लिप को मापने के लिए पिटाई कोशिकाओं वाले क्षेत्रों के लिए विशेष रूप से जांच की जाती है, तो इससे "चयन पूर्वाग्रह" हो सकता है। बीटिंग कोशिकाओं के एक विशिष्ट क्षेत्र का चयन करने के बजाय, कवरस्लिप में कई क्षेत्रों से डेटा एकत्र करने की सिफारिश की जाती है, जो केवल तभी संभव है जब कोशिकाओं को समरूप मोनोलेयर के रूप में वितरित किया जाता है। 100 ऐसे विभिन्न क्षेत्रों से माप, जो लगभग 10 किमी लेते हैं, कोशिकाओं के विश्वसनीय कार्यात्मक गुण प्रदान करने के लिए पर्याप्त हैं। अंत में, जैसा कि चित्रा 5में दिखाया गया है, आईपीएससी-सीएम को मापन की स्थिति में समायोजित करने के लिए समय की आवश्यकता होती है। विश्वसनीय माप के लिए, यह सिफारिश की जाती है कि कोशिकाओं को कम से कम 3 मिन के लिए माप की स्थिति में स्थिर किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को अहा वैज्ञानिक विकास अनुदान 17SDG33700093 (F.S.S.) द्वारा समर्थित किया गया था; माउंट सिनाई KL2 विद्वानों पुरस्कार नैदानिक और ट्रांसलेशनल रिसर्च कैरियर विकास KL2TR001435 (F.S.) के लिए; एनआईएच आर00 एचएल116645 व अहा 18TPA34170460 (सीके) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal Sigma Aldrich A5228
Alexa Fluor 488 goat anti mouse Invitrogen A11001
Alexa Fluor 555 goat anti rabbit Invitrogen A21428
B27 Supplement Gibco 17504-044
B27(-) insulin Supplement Gibco A18956-01
CHIR-99021 Selleckchem S2924
DAPI nuclear stain ThermoFisher D1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes Gibco 11330-032
Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook Celltreat 229306
Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well Corning 353046
Fluidic inline heater Live Cell Instrument IL-H-10
Fura-2, AM Invitrogen F1221
hESC-qualified matrix Corning 354277 Matrigel Matrix
hPSC media Gibco A33493-01 StemFlex Basal Medium
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
Live cell imaging chamber Live Cell Instrument EC-B25
MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody Synaptic Systems 311011
Myocyte calcium and contractility system Ionoptix ISW-400
Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) Proteintech 10906-1-AP
Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane ThermoFisher 124-0045
PBS with Calcium and Magnesium Corning 21-030-CV
PBS without Calcium and Magensium Corning 21-031-CV
Premium Glass Cover Slips Lab Scientific 7807
RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) Gibco 11879-020
RPMI medium 1640 (1X) Gibco 11875-093
Sodium L-lactate Sigma Aldrich L7022
StemFlex Supplement Gibco A33492-01
Thiazovivin Tocris 3845
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher 25200056
Tyrode's solution Boston Bioproducts BSS-355w Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride

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चिकित्सा अंक 155 प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) आईपीएससी कैल्शियम क्षणिक कैल्शियम हैंडलिंग हृदय रोग मॉडलिंग कार्डियोमायोसाइट परिपक्वता
वेंट्रिकुलर की पीढ़ी-जैसे HiPSC-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स और कैल्शियम हैंडलिंग लक्षण वर्णन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले सेल की तैयारी
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Oh, J. G., Dave, J., Kho, C., Stillitano, F. Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization. J. Vis. Exp. (155), e60135, doi:10.3791/60135 (2020).

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