Summary
L'intégrité de la barrière hémato-encéphalique est essentielle à la fonction du système nerveux. Dans Drosophila melanogaster, la barrière hémato-encéphalique est formée par les cellules gliales au cours de l'embryogenèse tardive. Ce protocole décrit les méthodes à essayer pour la formation et l'entretien de barrière hémato-encéphalique dans les embryons de D. melanogaster et les larves de troisième instar.
Abstract
Le développement approprié du système nerveux comprend la formation de la barrière hémato-encéphalique, la barrière de diffusion qui régule étroitement l'accès au système nerveux et protège les tissus neuronaux contre les toxines et les agents pathogènes. Des défauts dans la formation de cette barrière ont été corrélés avec des neuropathies, et la panne de cette barrière a été observée dans beaucoup de maladies neurodegenerative. Par conséquent, il est essentiel d'identifier les gènes qui régulent la formation et le maintien de la barrière hémato-encéphalique pour identifier les cibles thérapeutiques potentielles. Afin de comprendre les rôles exacts de ces gènes dans le développement neuronal, il est nécessaire d'essayer les effets de l'expression génique altérée sur l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Beaucoup de molécules qui fonctionnent dans l'établissement de la barrière hémato-encéphalique se sont avérées être conservées à travers les espèces eucaryotes, y compris la mouche des fruits, Drosophila melanogaster. Les mouches des fruits se sont avérées être un excellent système modèle pour examiner les mécanismes moléculaires régulant le développement et la fonction du système nerveux. Ce protocole décrit une procédure étape par étape pour essayer l'intégrité de barrière hémato-encéphalique pendant les étapes embryonnaires et larvaires du développement de D. melanogaster.
Introduction
Pendant le développement, la communication et les interactions de cellule-cellule sont critiques pour établir la structure et la fonction de tissu et d'organe. Dans certains cas, ces interactions cellules-cellules scellent les organes de l'environnement environnant pour assurer le bon fonctionnement des organes. C'est le cas du système nerveux, qui est isolé par la barrière hémato-encéphalique (BBB). La dysfonction du BBB chez l'homme a été liée à des troubles neurologiques, y compris l'épilepsie, et la dégradation de la barrière a été observée dans les maladies neurodégénératives, y compris la sclérose en plaques et la sclérose latérale amyotrophique1. Chez les mammifères, le BBB est formé par des jonctions étroites entre les cellules endothéliales2,3. D'autres animaux, y compris la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, ont un BBB composé de cellules gliales. Ces cellules gliales forment une barrière sélectivement perméable pour contrôler le mouvement des nutriments, des déchets, des toxines et des grandes molécules dans et hors du système nerveux4. Cela permet le maintien du gradient électrochimique nécessaire pour tirer des potentiels d'action, permettant la mobilité et la coordination4. Dans D. melanogaster, la glie protège le système nerveux de l'hémolymphique riche en potassium et en forme de sang5.
Dans le système nerveux central (SNC) et le système nerveux périphérique (PNS) de D. melanogaster, deux couches gliales externes, la glie subperineuriale et la glie périnévriale, ainsi qu'un réseau externe de matrice extracellulaire, la lamelle neurale, forment le hémolymphe-cerveau et barrière hémolymphe-nerf6, dénommé le BBB tout au long de cet article. Pendant le développement des glissides subperineuriales deviennent polyploïdes et agrandissent pour entourer le système nerveux5,6,7,8,9,10,11 . Les glies subpériineuses forment des jonctions septates, qui fournissent la principale barrière de diffusion entre l'hémolymphe et le système nerveux5,6,12. Ces jonctions sont moléculairement similaires aux jonctions septates trouvées aux paranodes de la glie myélinisante chez les vertébrés, et elles remplissent la même fonction que les jonctions serrées dans le BBB des mammifères13,14, 15 Annonces , 16 Annonces , 17. Les glissides périnéales divisent, grandissent et s'enroulent autour de la glie subperineuriale pour réguler la diffusion des métabolites et des grandes molécules6,10,18,19. La formation de BBB est complète par 18,5 h après la ponte (AEL) à 25 oC5,8. Des études antérieures ont identifié des gènes qui sont des régulateurs critiques de la formation bBB20,21,22. Pour mieux comprendre les rôles exacts de ces gènes, il est important d'examiner l'effet de la mutation de ces régulateurs potentiels sur l'intégrité de BBB. Alors que des études antérieures ont décrit des approches pour l'analyse de l'intégrité BBB chez les embryons et les larves, un protocole complet pour cet essai n'a pas encore été décrit5,7. Ce protocole étape par étape décrit les méthodes d'analyse de l'intégrité bBB pendant les stades embryonnaires d'In. melanogaster et les troisièmes stades larvaires instar.
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Protocol
1. Collecte d'échantillons
- Collection d'embryons
- Dans chaque cage de collecte d'embryons, utiliser un minimum de 50 femelles vierges avec 20 à 25 mâles pour les collections. Incuber ces mouches dans une bouteille avec de la semoule de maïs-agar nourriture (Table of Materials) pendant 1/2 jours avant de commencer les collections23.
REMARQUE: Plus de mouches peuvent être utilisées, mais le rapport femme-mâle doit être maintenu à 2:1. - Pré-chauffer les assiettes d'agar de jus de pomme(tableau 1) à 25 oC pendant la nuit.
REMARQUE: Ceci est nécessaire pour la mise en scène appropriée des embryons. Si les assiettes se dessèchent rapidement, ajouter un bol avec de l'eau à l'incubateur pour augmenter l'humidité de la chambre. - Anesthésiez les mouches à partir de l'étape 1.1.1 avec le CO2 et transférez les mouches vers une cage de collecte. Placer une plaque d'agar de jus de pomme pré-chauffée avec un petit frottis de pâte de levure à l'extrémité ouverte et fixer à la cage avec la manche rouge (Table des matériaux). Afin d'éliminer les embryons plus âgés, permettre aux mouches de pondre des embryons/œufs sur une plaque d'agar de jus de pomme pendant 1 h à 25 oC.
- Retirer la cage de collecte de l'incubateur. Inverser le côté maille cage vers le bas et robinet vole vers le bas de la cage. Remplacer l'agar de jus de pomme par une nouvelle assiette d'agar de jus de pomme préréchauffée par un petit frottis de pâte de levure. Jeter la première assiette.
- Laisser les mouches pondre des embryons/œufs sur la nouvelle plaque d'agar de jus de pomme pendant 1 h à 25 oC. Jetez cette plaque après la collecte de 1 h et passez à l'étape suivante pour recueillir les embryons en cas d'injection.
- Pour recueillir les embryons de stade tardif 17 (20 à 21 h AEL), permettre aux mouches du génotype désiré à partir des étapes 1.1-1.1.5 de pondre sur une nouvelle plaque d'agar de jus de pomme préchauffée avec un petit frottis de pâte de levure à 25 oC pour 1 h. Plaque d'âge de 19 h dans un incubateur de 25 oC dans un incubateur de 25 oC , les embryons auront donc entre 20 et 21 h au moment de l'imagerie.
REMARQUE: Cette étape peut être répétée comme souhaité pour plusieurs tours de collecte d'échantillons, d'injection et d'imagerie. - Recueillir les embryons des plaques dans une passoire cellulaire avec un maillage en nylon de 70 m en ajoutant de la saline tamponnée de phosphate (PBS) avec un surfactant nonionique de 0,1 % (PBTx; Tableau 1) pour couvrir la surface de la plaque et desserrer les embryons de la surface à l'aide d'un pinceau.
- Décchorionate embryons recueillis dans la passoire cellulaire dans une solution d'eau de Javel de 50 % (tableau 1) dans un plat Petri de 100 mm pendant 5 min avec agitation occasionnelle à température ambiante. Rincer les embryons 3x en faisant tourbillonner la passoire cellulaire dans PBTx dans un plat Petri, en utilisant un plat frais de PBTx à chaque fois.
- Si tous les embryons sont du bon génotype, passez directement à l'étape 1.1.10. Si la génération d'embryons du génotype correct nécessite une croix avec des mouches hétérozygotes, sélectionnez des embryons du génotype correct en utilisant la présence ou l'absence de chromosomes d'équilibreur marqués fluorescents. Utilisez un stéréomicroscope avec des capacités fluorescentes pour la sélection du génotype.
REMARQUE: Chromosomes d'équilibriste marqués de protéines fluorescentes déformées-jaunes; Kruppel-Gal4, protéine fluorescente vert UAS (GFP); et torsion-Gal4, UAS-GFP fonctionnent bien pour la sélection de génotype dans l'embryogenèse tardive (tableau 2)24,25,26. - À l'aide d'une pipette en verre, transférer les embryons dans PBTx sur une dalle de gel agarose de 2 %(tableau 1). Retirer l'excès de liquide avec du papier filtre. Aligner les embryons de 6 à 8 sur la dalle de gel agarose de 2 % avec le côté postérieur vers la droite et le côté dorsal vers le haut (Figure 1B).
REMARQUE: Le micropyle, le petit trou par lequel le spermatozoïde pénètre dans l'ovule, est situé à l'extrémité antérieure de l'embryon. L'extrémité postérieure est plus arrondie. La trachée apparaît blanche et est localisée doralement dans l'embryon, permettant la distinction des côtés dorsaux et ventrals de l'embryon (Figure 1B). - Préparer une diapositive avec un morceau de ruban adhésif recto-verso. Appuyez fermement sur la diapositive sur le dessus des embryons pour les transférer sur la bande recto-verso.
- Descciquer les embryons par incubation à température ambiante pendant 25 min (aucun dessiccant n'est utilisé). Après la dessiccation, recouvrir les embryons d'huile d'halocarbone.
REMARQUE: Les périodes de dessiccation peuvent varier en fonction de la température, de l'humidité et de la ventilation dans la pièce. La période d'incubation devrait être utilisée pour mettre en place l'appareil pour l'injection et le microscope confocal pour l'imagerie, tel que décrit dans les sections 2 et 3 de ce protocole.
- Dans chaque cage de collecte d'embryons, utiliser un minimum de 50 femelles vierges avec 20 à 25 mâles pour les collections. Incuber ces mouches dans une bouteille avec de la semoule de maïs-agar nourriture (Table of Materials) pendant 1/2 jours avant de commencer les collections23.
- Collection Larvaire
- Mettre en place une croix avec 5 à 10 mouches femelles vierges du génotype désiré et la moitié autant de mâles du génotype désiré dans une fiole avec de la nourriture de semoule de maïs-agar et incuber à 25 oC23.
- Après 5 à 7 jours, selon le génotype, recueillir les larves errantes troisième instar de la fiole doucement avec des forceps. Rincer les larves dans 1x PBS pour enlever les aliments collés aux larves. Transférer les larves dans une plaque d'agar de jus de pomme pour le génotypage tel que décrit à l'étape 1.1.9 si nécessaire.
- Rouler les larves sur un tissu à l'aide d'un pinceau pour les sécher. Transférer 6 à 8 larves sur une lame préparée à l'aide de ruban adhésif recto-verso à l'aide de forceps.
2. Préparation des aiguilles et de l'injection de spécimens
- Tirez des aiguilles sur un puller micropipette avant le lancement de ce protocole. Fixez les tubes capillaires dans le pulleur d'aiguille et tirez selon la forme et les paramètres standard de l'aiguille pour les injections de D. melanogaster (tableau 3)27. Conserver les aiguilles dans un plat Petri en les ancrant dans l'argile jusqu'à ce qu'elles soient utilisées pour l'injection.
- Chargez une aiguille de 5 l de 10 kDa dextran conjuguée à la sulforhodamine 101 chlorure d'acide (Tableau des matériaux) à l'aide d'une tuyauterie à chargement de gel de 20 l pendant la période de dessiccation de 25 minutes pour les embryons (étape 1.1.12), ou immédiatement après le transfert de larves à la glissière (étape 1.2.3).
- Chargez l'aiguille dans un support d'aiguille et placez-la dans un micromanipulateur fixé à une base en acier (Tableau des matériaux).
REMARQUE: L'aiguille doit être presque parallèle au stade du microscope pour l'injection d'embryons et légèrement inclinée vers le bas pour les injections larvaires. - Définir l'appareil d'injection (Table des Matériaux) à 50 psi, 5 à 10 ms avec une gamme de 10.
REMARQUE: Il peut être nécessaire de modifier ces paramètres pour l'appareil d'injection particulier utilisé. - Placez la glissière sur scène et brossez le bord de l'aiguille contre le bord du ruban à double face à un angle de 45 degrés pour créer une pointe inclinée et brisée.
REMARQUE: Pour les embryons, il suffit de casser la pointe assez pour permettre l'écoulement de la dextran 10 kDa. Une aiguille parfaite a une pointe légèrement inclinée et seule une petite goutte de colorant sortira à chaque injection. Pour les larves, il est nécessaire de briser la pointe plus, mais avec une pointe inclinée pour pénétrer la paroi du corps larvaire. Une plus grande goutte de colorant sortira. - Pompez la pédale jusqu'à ce que le colorant soit à l'extrémité de l'aiguille.
- Alignez l'aiguille de sorte qu'elle soit parallèle à l'embryon ou inclinée légèrement vers le bas vers la larve.
- Déplacez l'aiguille pour percer l'extrémité postérieure du spécimen et injectez le spécimen en pompant la pédale. Injecter 2 nL de colorant dans les embryons, et 220 nL de colorant dans les larves.
REMARQUE: L'embryon ou la larve devrait inonder de colorant si l'injection est réussie. - Notez l'heure de l'injection à des fins d'incubation. Incuber les embryons pendant 10 min à température ambiante. Incuber les larves pendant 30 min à température ambiante.
- Continuer sur la diapositive pour injecter d'autres spécimens, en notant l'heure de l'injection pour chaque spécimen.
REMARQUE: Selon la vitesse à laquelle des étapes ultérieures de dissection et d'imagerie peuvent être effectuées, 4 à 8 spécimens peuvent être injectés à la fois.
3. Préparation d'échantillons pour l'imagerie
-
Imagerie d'embryons
- Après l'injection, préparer les embryons à l'imagerie. Appliquer de la gelée de pétrole avec un applicateur à pointe de coton sur les côtés droit et gauche des échantillons sur la glissière comme espaceur pour éviter les dommages aux embryons lors du placement de la glissière.
- Échantillons d'images à l'aide d'un microscope confocal dans toute la profondeur de l'embryon avec un objectif 20x. Calculer le pourcentage d'échantillons totaux avec colorant observé dans le cordon nerveux ventral (VNC) à l'aide de l'équation suivante : % des échantillons avec bBB compromis - Nombre d'échantillons avec accumulation de colorant dans le VNC/nombre total d'échantillons analysés.
-
Dissection et imagerie des larves
- Préparer à l'avance les diapositives pour les échantillons larvaires. Mont deux couvercles espacés d'environ 0,5 cm à la glissière avec du vernis à ongles.
REMARQUE: Les couvertures fonctionnent comme des espaceurs pour le cerveau, de sorte qu'il n'est pas endommagé pendant le processus de montage. - Après l'incubation de 30 min, disséquer les larves en 1x PBS directement sur la diapositive qui sera utilisée en imagerie. Tout d'abord, utilisez une paire de forceps pour saisir la larve à mi-chemin dans le corps larvaire, et utilisez une deuxième paire de forceps pour séparer les moitiés antérieures et postérieures de la larve.
- Ensuite, utilisez une paire de forceps pour saisir la région antérieure aux crochets buccaux, et utilisez une deuxième paire de forceps pour inverser la paroi du corps sur la pointe des forceps saisissant les crochets de la bouche. Le cerveau et le VNC seront exposés.
- Séparez le cerveau et le VNC de la paroi du corps en coupant les nerfs, et retirez la paroi du corps de la glissière (Figure 1C,D). Retirer les disques imaginaires si désiré.
- Couvrir l'échantillon de 10 là de 80 % de glycérol et placer une feuille de couverture sur l'échantillon pour l'imagerie.
- Image à travers la profondeur du tissu du système nerveux à l'aide d'un objectif 20x. Calculer le pourcentage d'échantillons totaux avec colorant observé dans le VNC.
- Préparer à l'avance les diapositives pour les échantillons larvaires. Mont deux couvercles espacés d'environ 0,5 cm à la glissière avec du vernis à ongles.
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Representative Results
Les méthodes décrites ici permettent de visualiser l'intégrité du BBB dans l'ensemble du SNC chez les embryons et larves de D. melanogaster (Figure 1). À l'achèvement de la formation de BBB en fin d'embryogenèse, le BBB fonctionne pour exclure de grandes molécules du cerveau et VNC5. Ce protocole tire parti de cette fonction pour essayer la formation de BBB. Lorsque des embryons de type sauvage (Oregon R) de type avancé 17 (20 à 21 h) ont été injectés avec 10 kDa dextran conjugués à la sulforhodamine 101 colorant fluorescent au chlorure acide, la grande molécule de dextran a été exclue du VNC, comme prévu (Figure 2A). Afin de démontrer l'effet des mutations génétiques sur l'intégrité de BBB, des embryons avec des mutations dans le gène brut ont été utilisés. Précédemment, le gène brut a été démontré pour réguler la rétraction de bande de germe pendant l'embryogenèse, et plus récemment a été montré pour fonctionner dans la glie pour régler des changements morphologiques dans le VNC pendant le développement28. Les embryons mutants heterozygous bruts1 présentaient un BBB intact, semblable aux résultats observés chez les embryons témoins de type sauvage (figure 2B). En revanche, homozygots cru1 embryons mutants présentaient des défauts dans l'intégrité de la BBB, avec 10 kDa dextran colorant inondant dans le VNC, ce qui indique que le BBB n'a pas réussi à se former (Figure 2C). Ces résultats démontrent la capacité de cette technique à essayer la formation de BBB pendant les étapes embryonnaires.
Des études antérieures ont démontré qu'un défaut de polyploidisation des glies subperineuriales entraîne une perturbation du BBB qui peut être observée dans les troisièmes stades larvaires instar7,9. Ainsi, des défauts dans la formation et/ou l'entretien de BBB pourraient entraîner un BBB compromis au cours des étapes ultérieures du développement, ce qui rendrait souhaitable d'essayer l'intégrité de la barrière au troisième stade larvaire instar. Par conséquent, le protocole utilisé pour l'analyse de l'intégrité bBB dans les stades embryonnaires a également été optimisé pour une utilisation chez les larves. Dans l'Oregon R échantillons de contrôle, 10 kDa dextran ne parvient pas à pénétrer le BBB et est exclu du cerveau et VNC (Figure 2D,E). Le colorant s'accumule à la périphérie du BBB.
Figure 1 : Le système nerveux des embryons de stade 17 et de la troisième larve instar. (A) Schéma d'une vue ventrale d'un système nerveux central embryonnaire de stade 17 (SNC). Le SNC se compose du cerveau (Br) et du cordon nerveux ventral (VNC), qui a des canaux dorsoventral (ch). Le micropyle (mp; pointe de flèche) à l'extrémité antérieure peut être utilisé pour orienter l'embryon. Postérieur vers la droite. (B) Embryon de stade 17 orienté avec le côté dorsal vers le haut et postérieur vers la droite, comme recommandé à l'étape 1.1.10. Les flèches pointent vers la trachée. Arrowhead indique le mp. Postérieur vers la droite. (C) Schéma du système nerveux dans la troisième larve instar. Le cerveau (Br) et le VNC composent le SNC, tandis que les nerfs s'étendant de la synapse vNC sur les muscles de la paroi du corps et font partie de la PNS. Postérieur vers la droite. (D) Disséqué troisième cerveau larvaire instar et VNC. Postérieur vers la droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Analyse de la formation de barrière hémato-encéphalique (BBB). (A-C) Les embryons de stade avancé 17 (20 à 21 h) injectés postérieurement de 10 kDa sulforhodamine 101 chlorure d'acide dextran. Postérieur vers le bas. Barre d'échelle de 20 m. Les points observés dans les contrôles sont des canaux dorsoventral qui enjambent le cordon nerveux ventral (VNC). (A) Contrôle De l'Oregon R. L'apport de teinture dans 6,25 % des échantillons, n ' 16. (B) contrôle brut1/mD de la fratrie. L'apport de teinture dans 6,67 % des échantillons, n ' 15. (C) Homozygous mutant brut1/1. Teinture dans 100% des échantillons, n '22. (D) Oregon R contrôle troisième cerveau larvaire instar. Le colorant s'accumule au BBB, mais ne pénètre pas dans le SNC, n . Barre d'échelle de 50 m. (E) Oregon R contrôle troisième instar larvaire VNC. Le colorant s'accumule au BBB, mais ne pénètre pas dans le SNC, n ' 11. Ligne en pointillés décrit le VNC. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Morphologie de Midgut dans le développement embryonnaire tardif. Les images lumineuses transmises des embryons de stade 13 à 17 permettent la visualisation de la morphologie intestinale (régions gris foncé dans la moitié postérieure de l'embryon). La morphologie de Midgut peut être employée pour déterminer le stade du développement embryonnaire, qui est utile en déterminant si les embryons sont vieillis convenablement pour l'injection. Barre d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| solution | recette |
| 2% gel Agarose | Ajouter 0,8 g d'agarose à 40 ml de H2O à double distillation (ddH2O) dans une fiole Erlenmeyer et un four à micro-ondes pour dissoudre l'agar. Verser dans un plateau de coulée de gel et laisser le gel se solidifier pendant 30 min à température ambiante. |
| Assiettes d'agar de jus de pomme | Mesurer 45 g d'agar et 1,5 L de ddH2O dans un flacon de 4 L. Autoclave de 40 à 45 min à 121 oC. Mesurer 50 g de sucre et 0,5 L de jus de pomme dans un bécher de 1 L et remuer à feu doux (réglage 3) pour dissoudre le sucre, en prenant soin de ne pas le brûler. Après l'autoclacage, ajouter le sucre préchauffé et le jus de pomme à l'agar et à l'eau. Remuer à feu doux avec le feu éteint pour laisser refroidir jusqu'à ce que vous pouvez le toucher. Ajouter 15 ml de tegosept à 70 % et remuer pour disperser. Verser dans un bécher de 0,5 L. Vaporiser avec de l'éthanol pour enlever les bulles ou la flamme avec un brûleur Bunsen. Verser dans la boîte de 60 mm. Laisser reposer au moins 24 h, ou jusqu'à ce qu'il y ait une condensation minimale sur les couvercles des boîtes de Pétri et conserver à 4 oC. |
| 50% de blanchiment | Ajouter 15 ml de ddH2O et 15 ml d'eau de Javel domestique dans un tube conique. |
| 80% de glycérol | Pour 10 ml, ajouter 8 ml de ddH2O autoclaved et 2 ml de glycérol dans un tube conique de 15 ml. Incuber sur un rocker jusqu'à ce que la solution soit homogène. |
| 1x PBS | Pour 1 L, diluer 100 ml de 10x PBS en 900 ml de ddH2O. |
| 10x PBS | Pour 2 L, dissoudre ce qui suit en 1 600 mL de ddH2O : 160 g de NaCl, 4 g de KCl, 28,8 g de Na2HPO4, et 4,8 g de KH2PO4. Ajuster le pH à 7,5 avec HCl. |
| PBTx (PBS - 0,1% de surfactant nonionique) | Pour 1 L, mélanger 100 ml de 10x PBS, 10 ml de surfactant nonionic 10% et 890 mL de ddH2O. |
| 70% Tegosept | Mélanger 1 g d'acide p-hydroxybenzoïque, ester méthyle pour chaque 10 ml d'éthanol 100%. Conserver à -20 oC. |
| 10% surfactant nonionic | Pour 50 ml, ajouter 45 ml de ddH2O autoclaved et 5 ml de surfactant nonionique à un tube conique. Tournez sur le rocker jusqu'à ce que la solution soit homogène. |
| Pâte de levure | Mélanger la levure active sèche avec le ddH2O dans un bécher en plastique de 50 ml jusqu'à consistance lisse. |
Tableau 1 : Réactifs et tampons utilisés tout au long de ce protocole.
| Génotype | stock |
| w[1118]; ln(2LR)Gla, wg[Gla-1]/CyO, P'w[mC]-GAL4-twi.GMD 2.2, P'w[mC]-UAS-2xEGFP-AH2.2 | #6662 Bloomington |
| w']; sna[Sco]/CyO, P'w[mC]-Dfd-EYFP2 | #8578 Bloomington |
| w']; L[2] Pin[1]/CyO, P'w[mC]-GAL4-Kr.C-DC3, P'w[mC]-UAS-GFP. S65T-DC7 | #5194 Bloomington |
| Df(1)JA27/FM7c, P'w[mC]-GAL4-Kr.C-DC1, P-w[MC]-UAS-GFP. S65T-DC5, sn[] | #5193 Bloomington |
| w[]; ry[506] Dr[1]/TM6B, Pôw[mc] -Dfd-EYFP3, Sb[1] Tb[1] ca[1] | #8704 Bloomington |
| y[1] w[MD]; D[MD] gl[3]/TM3, P'w[mC]-GAL4-Kr.C-DC2, P-w[MC]-UAS-GFP. S65T-DC10, Sb[1] | #5195 Bloomington |
| Oregon R | Plusieurs souches disponibles |
| raw[1] cn[1] bw[1] sp[1]/CyO | #2749 Bloomington |
| P'w[mW.hs] -GawB-elav[C155] | #458 Bloomington |
| w[1118]; Gal4-repo/TM3, Sb[1] | #7415 Bloomington |
| P-UAS-GFP | Plusieurs souches disponibles |
Tableau 2 : Souches de mouches. Les souches de mouche discutées tout au long de ce protocole. Le numéro de stock Bloomington Drosophila Stock Center est fourni le cas échéant.
| cycle | chaleur | tirer | vélocité | temps | pression | rampe d'accès |
| 1 | 590 | 115 | 15 | 250 | 600 | X |
| 2 | 575 | 130 | 60 | 250 | 600 | X |
Tableau 3 : Réglages de traction Micropipette. Paramètres de traction Micropipette utilisés pour générer des aiguilles pour l'injection dans ce protocole.
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Discussion
Ce protocole fournit une description complète des étapes nécessaires pour l'analyse de l'intégrité bBB au cours des derniers stades embryonnaires et troisièmes larvaires instar du développement de D. melanogaster. Des approches similaires ont été décrites ailleurs pour mettre en valeur l'intégrité de la BBB pendant le développement, ainsi que dans les stades adultes5,7,29,30. Cependant, les descriptions des procédures dans les sections des matériaux et des méthodes sont souvent de nature large et manquent de détails suffisants pour faciliter la mise en œuvre, ce qui a nécessité un dépannage important de la part du chercheur. Ce protocole fournit une description complète des étapes nécessaires pour l'analyse de l'intégrité du BBB pendant les stades embryonnaires et larvaires. À chaque étape, il y a des étapes critiques à suivre pour s'assurer que l'étape correcte du développement est examinée et que l'architecture tissulaire n'est pas perturbée, ce qui pourrait compromettre le BBB. Afin d'atteindre le succès dans ces approches, il était nécessaire de dépanner plusieurs étapes du protocole afin de produire des résultats précis. Des étapes critiques dans les protocoles embryonnaires et larvaires sont décrites ci-dessous.
Des études antérieures ont rapporté la mise en place de la BBB par 18,5 h AEL5. Pour assurer un bon moment de développement, il est important de maintenir les échantillons à une température constante pendant le vieillissement. Lors de la collecte des embryons, les plaques d'agar de jus de pomme doivent être portées à 25 oC avant d'être utilisées pour la collecte. L'utilisation de plaques de jus de pomme qui n'ont pas été réchauffées n'entraîne pas un développement plus lent et peut produire des échantillons qui n'ont pas encore établi de BBB et qui présenteraient donc une accumulation de 10 kDa dextran dans le système nerveux. En tant que tel, il est important de s'assurer que l'on injecte des échantillons de plus de 18,5 h. En outre, lors de l'exécution de ces expériences sur des embryons, il est nécessaire d'envisager la possibilité d'un retard de développement, car un tel retard pourrait simplement entraîner l'établissement ultérieur de la BBB. Pour tenir compte des retards de développement potentiels, les échantillons ont été analysés à 20 à 21 h AEL, légèrement après la formation de BBB signalée. L'utilisation de la morphologie d'autres tissus, en particulier le midgut en développement, peut aider à établir le stade correct du développement de l'embryon étant évalué (Figure 3). Inversement, un mauvais moment expérimental peut donner lieu à des échantillons qui sont déjà motiles et qui ont commencé le processus d'éclosion. Pour réduire le nombre de larves qui ont déjà commencé à éclore, il est important d'effectuer un minimum de deux 1 h de collectepour effacer les embryons plus âgés des femelles avant de recueillir des embryons pour l'injection. Si l'analyse du BBB chez les premières larves inétoiles est souhaitée, une brève incubation des larves dans 1x PBS dans un plat de 9 puits sur la glace peut être utilisée pour réduire la motilité avant l'injection. Les glissières peuvent également être conservées sur un bloc de glace pendant la procédure d'injection afin de réduire la motilité.
Afin d'assurer des images de qualité et des résultats précis concernant l'établissement du BBB dans l'embryon, des étapes supplémentaires doivent être suivies avec soin tout au long de la procédure. Lors de l'alignement des embryons sur la dalle d'agar, la trachée doit être orientée vers le haut, car c'est le côté dorsal de l'embryon (Figure 1B). Lorsque les embryons sont transférés sur la diapositive avec le ruban à double face, le côté ventral de l'embryon sera alors tourné vers le haut, permettant une visualisation optimale du cordon nerveux lors de l'imagerie confocale plus tard dans le protocole. Les embryons doivent également être solidement adhérés au ruban à double face pour inhiber le mouvement pendant l'injection. L'utilisation d'un tampon d'agarose plat de 2 % permet au chercheur de pousser la diapositive avec le ruban à double face fermement sur les embryons pendant le processus de transfert sans risque de dommages aux embryons. Après le transfert à la diapositive, la dessiccation est nécessaire pour empêcher l'embryon d'éclater lors de l'injection de colorant. L'injection d'une trop grande quantité de colorant peut également provoquer l'éclatement de l'embryon. Il est important d'insérer l'aiguille dans l'embryon assez pour injecter le colorant, mais pas tellement que l'aiguille perce potentiellement le système nerveux, ce qui donnerait un résultat faussement positif. Une blessure trop grande peut également entraîner l'inondation de l'hémolymphe et de la teinture de l'embryon, ce qui entraîne l'échec d'une expérience. Avec ces pièges potentiels à l'esprit, l'injection est plus réussie avec une aiguille qui a un léger angle à la pointe, de sorte qu'il ya un petit point avec lequel perforer soigneusement l'embryon.
Dans le cas de l'analyse des larves pour l'intégrité BBB, des défis peuvent survenir en raison de la motilité de l'échantillon. L'utilisation de ruban à double face de haute qualité est essentielle, car elle devrait être efficace pour immobiliser les larves pour l'injection. Si la larve se détache, elle peut être retournée sur le ruban adhésif et légèrement poussée vers le bas pour la sécuriser. Lors du transport des larves pour injection, il est utile de porter la lame dans un plat Petri au cas où les larves se détachent. Les étapes suivant l'injection exigent le plus de soin pour éviter la perturbation du BBB. Afin de minimiser les dommages potentiels à l'échantillon, il est plus facile de disséquer l'échantillon directement sur les diapositives qui seront utilisées pour l'imagerie. Si la larve est fortement adhérée à la bande lors du transfert de l'échantillon pour la dissection, une goutte de 1x PBS peut être ajoutée à la bande pour desserrer l'adhérence et pour permettre le transfert à la diapositive pour la dissection. Après la dissection, il est important d'aplatir l'échantillon suffisamment pour éviter les faux résultats positifs, mais pas tellement que l'intégrité de l'échantillon est compromise. Sandwiching la larve entre le couvercle et la diapositive en utilisant des couvertures supplémentaires que les espaceurs empêche le cerveau d'être endommagé, mais immobilise l'échantillon pour une imagerie efficace.
Afin d'obtenir du succès avec les protocoles pour les embryons et les larves, il est essentiel de s'assurer que l'appareil d'injection et le microscope confocal sont mis en place avant le début du traitement de l'échantillon. Cela permet un timing précis dans l'imagerie des échantillons, ce qui est nécessaire pour la comparaison des échantillons. D'autres approches ont utilisé des configurations d'injection plus avancées, nécessitant un microscope inversé mis en place pour l'injection d'embryons. Ce protocole utilise un microscope de dissection standard et un micromanipulateur avec un régulateur de pression. Dans ce cas, une injection de poisson zèbre a été simplement adaptée pour l'injection d'embryons et de larves de mouches. Ce protocole pourrait être simplifié davantage pour utiliser un micromanipulateur avec une seringue pour l'injection ainsi. Bon nombre de ces outils sont facilement disponibles dans les départements de biologie et peuvent même être disponibles dans les laboratoires de classe, ce qui permet une facilité maximale de la mise en œuvre du protocole.
Pendant la procédure d'imagerie, il peut être utile d'étiqueter les cellules du système nerveux pour identifier plus facilement la région souhaitée pour l'imagerie. Plus précisément, on pourrait utiliser le système GAL4/UAS pour exprimer gFP dans les neurones ou glia, en utilisant l'élav-Gal4 ou repo-Gal4 souches, respectivement (tableau 2)31,32,33. Un tel étiquetage fournirait un contraste avec la sulforhodamine 101 dextran acide pour visualiser l'intégrité du système nerveux.
Bien que cette méthode se concentre sur l'analyse de l'intégrité de la BBB pendant le développement de D. melanogaster, cette approche pourrait être adaptée pour examiner l'intégrité d'autres barrières à travers une variété d'organismes et de tissus. Par exemple, des protocoles similaires ont été publiés pour l'analyse du BBB chez la souris34. En outre, la perméabilité de la barrière des yeux du sang et la barrière somatique entourant les cellules germinales pendant la spermatogénèse dans D. melanogaster utiliser une approche similaire29,35. Le protocole pourrait également être adapté pour une utilisation dans d'autres tissus pour tester la perméabilité, y compris dans l'intestin. Lors de l'adaptation de ce protocole pour une utilisation dans d'autres tissus ou espèces, il sera nécessaire de considérer la taille des molécules qui peuvent pénétrer la barrière, car il est possible que 10 kDa dextran peut être assez petit pour imprégner certaines barrières. Dans l'ensemble, ce protocole fournit une procédure étape par étape pour l'analyse de l'intégrité BBB pendant le développement de D. melanogaster qui peut être facilement adapté pour une utilisation dans d'autres paramètres.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le Dr F. Bryan Pickett et le Dr Rodney Dale pour l'utilisation de l'équipement pour l'injection. Ces travaux ont été financés par le financement de la recherche de l'Université Loyola de Chicago à M.D., D.T., et J.J.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
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