Summary
L'integrità della barriera emato-encefalica è fondamentale per la funzione del sistema nervoso. Nella Drosophila melanogaster, la barriera emato-encefalica è formata da cellule gliali durante l'embriogenesi tardiva. Questo protocollo descrive i metodi per la formazione e la manutenzione delle barriere emato-encefalice negli embrioni di D. melanogaster e delle larve instar terze.
Abstract
Un corretto sviluppo del sistema nervoso include la formazione della barriera emato-encefalica, la barriera di diffusione che regola strettamente l'accesso al sistema nervoso e protegge il tessuto neurale dalle tossine e dagli agenti patogeni. I difetti nella formazione di questa barriera sono stati correlati con le neuropatie, e la ripartizione di questa barriera è stata osservata in molte malattie neurodegenerative. Pertanto, è fondamentale identificare i geni che regolano la formazione e il mantenimento della barriera emato-encefalica per identificare potenziali bersagli terapeutici. Per comprendere i ruoli esatti che questi geni svolgono nello sviluppo neurale, è necessario testare gli effetti dell'espressione genica alterata sull'integrità della barriera emato-encefalica. Molte delle molecole che funzionano nella creazione della barriera emato-encefalica sono state trovate per essere conservate attraverso le specie eucariotiche, tra cui la mosca della frutta, Drosophila melanogaster. I moscerini della frutta hanno dimostrato di essere un ottimo sistema modello per esaminare i meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo e la funzione del sistema nervoso. Questo protocollo descrive una procedura passo-passo per testare l'integrità della barriera emato-encefalica durante le fasi embrionali e larve dello sviluppo di D. melanogaster.
Introduction
Durante lo sviluppo, la comunicazione cellulare-cellula e le interazioni sono fondamentali per la creazione della struttura e della funzione dei tessuti e degli organi. In alcuni casi, queste interazioni cellula-cellula sigillano gli organi dall'ambiente circostante per garantire la corretta funzione dell'organo. Questo è il caso del sistema nervoso, che è isolato dalla barriera emato-encefalica (BBB). La disfunzione della BBB nell'uomo è stata collegata a disturbi neurologici tra cui l'epilessia, e la rottura della barriera è stata osservata nelle malattie neurodegenerative tra cui la sclerosi multipla e la sclerosi laterale amiotrofica1. Nei mammiferi, la BBB è formata da strette giunzioni tra le cellule endoteliali2,3. Altri animali, tra cui la mosca della frutta, Drosophila melanogaster, hanno un BBB composto da cellule gliali. Queste cellule gliali formano una barriera selettivamente permeabile per controllare il movimento di sostanze nutritive, prodotti di scarto, tossine e grandi molecole dentro e fuori il sistema nervoso4. Ciò consente la manutenzione del gradiente elettrochimico necessario per sparare potenziali di azione, consentendo la mobilità e la coordinazione4. In D. melanogaster, la glia proteggere il sistema nervoso dal potassio-ricco, emolymph sangue-come5.
Nel sistema nervoso centrale (CNS) e nel sistema nervoso periferico (PNS) di D. melanogaster, due strati gliali esterni, la glia subperineuriale e la glia perineuriale, così come una rete esterna di matrice extracellulare, la lamella neurale, formano barriera emolymph-brain e emolymph-nerve6, indicata come BBB in tutto questo articolo. Durante lo sviluppo glia subperineurial diventano poliploidi e ingrandiscono per circondare il sistema nervoso5,6,7,8,9,10,11 . La glia subperineuriale forma giunzioni di septate, che forniscono la barriera di diffusione principale tra l'emolina e il sistema nervoso5,6,12. Queste giunzioni sono molecolarmente simili alle giunzioni simili a septate che si trovano nei paranodi della glia mielinata nei vertebrati, e svolgono la stessa funzione delle giunzioni strette nella BBB dei mammiferi13,14, 15 Mi lasa del sistema , 16 , 17.La glia perineuriale si divide, cresce e avvolge la glia subperineuriale per regolare la diffusione di metaboliti e grandi molecole6,10,18,19. La formazione di BBB è completata da 18,5 h dopola deposizione delle uova (AEL) a 25 . Studi precedenti hanno identificato geni che sono regolatori critici della formazione di BBB20,21,22. Per comprendere meglio i ruoli esatti di questi geni, è importante esaminare l'effetto della mutazione di questi potenziali regolatori sull'integrità BBB. Mentre studi precedenti hanno delineato approcci per affermare l'integrità della BBB negli embrioni e nelle larve, un protocollo completo per questo test deve ancora essere descritto5,7. Questo protocollo passo-passo descrive i metodi per il test di integrità BBB durante gli stadi della larva embrionale e terza nella stella di D. melanogaster.
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Protocol
1. Raccolta di campioni
- Raccolta di embrioni
- In ogni gabbia di raccolta embrionale, usa un minimo di 50 femmine vergini con 20-25 maschi per le collezioni. Incubare queste mosche in una bottiglia con cibo di farina di mais-agar (Tabella dei Materiali) per 1/2 giorni prima di iniziare le collezioni23.
NOT: È possibile utilizzare più mosche, ma il rapporto femminile-maschio deve essere mantenuto a 2:1. - Piatti preriscaldati di succo di mela (Tabella 1) a 25 gradi durante la notte.
NOT: Ciò è necessario per una corretta messa in scena degli embrioni. Se le piastre si stanno asciugando rapidamente, aggiungere una ciotola con acqua all'incubatrice per aumentare l'umidità della camera. - Anestesizza le mosche dal passo 1.1.1 con CO2 e trasferizza in una gabbia di raccolta. Mettere un piatto di agar di succo di mela preriscaldato con un piccolo striscio di pasta di lievito all'estremità aperta e fissarlo alla gabbia con la manica rossa (Tabella dei Materiali). Per eliminare gli embrioni più vecchi, consentire alle mosche di deporre embrioni/uova su un piatto di agar di succo di mela per 1 h a 25 gradi centigradi.
- Togliere la gabbia di raccolta dall'incubatrice. Invertire il lato della rete della gabbia verso il basso e toccare vola verso il basso fino alla parte inferiore della gabbia. Sostituire l'agar di succo di mela con un nuovo piatto di agar preriscaldato con un piccolo svasatura di pasta di lievito. Scartare il primo piatto.
- Lasciare che le mosche depongano gli embrioni/uova sul nuovo piatto di agar di succo di mela per 1 h a 25 gradi centigradi. Scartare questa piastra dopo la raccolta di 1 h e procedere alla fase successiva per raccogliere gli embrioni per l'iniezione.
- Per raccogliere i 17 embrioni della fase tardiva (20-21 h AEL), permettete alle mosche del genotipo desiderato dai passi 1.1.1.1.5 di posare su un nuovo piatto di agar preriscaldato con un piccolo striscio di pasta di lievito a 25 gradi centigradi per 1 h. Piastra di età per 19 h in un incubatore di 25 gradi centigradi , quindi gli embrioni avranno 20/21 h di età al momento dell'imaging.
NOT: Questo passaggio può essere ripetuto come desiderato per più cicli di raccolta del campione, iniezione e imaging. - Raccogliere gli embrioni dalle piastre in un colino cellulare con una rete di nylon di 70 m aggiungendo una salina tamponata di fosfati (PBS) con 0,1% di surfactant nonionico (PBTx; Tabella 1) per coprire la superficie della piastra e allentare gli embrioni dalla superficie utilizzando un pennello.
- Embrioni dechorionati raccolti nel colino cellulare in una soluzione di candeggina al 50% (Tabella 1) in una piastra Petri da 100 mm per 5 min con agitazione occasionale a temperatura ambiente. Risciacquare gli embrioni 3x ruotando il colino cellulare in PBTx in un piatto Petri, utilizzando ogni volta un piatto fresco di PBTx.
- Se tutti gli embrioni sono del genotipo corretto, procedere direttamente al passaggio 1.1.10. Se la generazione di embrioni del genotipo corretto richiede una croce con mosche eterozigole, selezionare gli embrioni del genotipo corretto utilizzando la presenza o l'assenza di cromosomi bilanciatori marcati fluorescente. Utilizzare uno stereoscopio con capacità fluorescenti per la selezione del genotipo.
NOT: Cromosomi bilanciatori contrassegnati con proteina fluorescente deformata-gialla; Kruppel-Gal4, proteina fluorescente verde UAS (GFP); e torsione-Gal4, UAS-GFP funzionano bene per la selezione del genotipo nella tarda embriogenesi (Tabella 2)24,25,26. - Utilizzando una pipetta di vetro, trasferire gli embrioni in PBTx a una lastra di gel di agarose del 2%(Tabella 1). Rimuovere il liquido in eccesso con carta da filtro. Allineare gli embrioni di 6-8 dollari sulla lastra di gel di agarose del 2% con il posteriore a destra e il lato dorsale rivolto verso l'alto (Figura 1B).
NOT: La micropirle, il piccolo foro attraverso il quale gli spermatozoi entrano nell'uovo, si trova all'estremità anteriore dell'embrione. L'estremità posteriore è più arrotondata. La trachea appare bianca e si trova dorsalmente nell'embrione, consentendo la distinzione dei lati dorsale e ventrale dell'embrione (Figura 1B). - Preparare uno scivolo con un pezzo di nastro adesivo. Premere saldamente il vetrino sulla parte superiore degli embrioni per trasferirli sul nastro a due lati.
- Desiccate gli embrioni per incubazione a temperatura ambiente per 25 min (non viene utilizzato alcun disint). Dopo la disidratazione, coprire gli embrioni con olio di alocarbonio.
NOT: I periodi di desciccazione possono variare a seconda della temperatura, dell'umidità e della ventilazione nella stanza. Il periodo di incubazione deve essere utilizzato per impostare l'apparecchio per l'iniezione e il microscopio confocale per l'imaging, come descritto nelle sezioni 2 e 3 di questo protocollo.
- In ogni gabbia di raccolta embrionale, usa un minimo di 50 femmine vergini con 20-25 maschi per le collezioni. Incubare queste mosche in una bottiglia con cibo di farina di mais-agar (Tabella dei Materiali) per 1/2 giorni prima di iniziare le collezioni23.
- Raccolta larva
- Impostare una croce con 5-10 mosche femmine vergini del genotipo desiderato e la metà di altrettanti maschi del genotipo desiderato in una fiala con cibo di farina di mais-agar e incubare a 25 c23.
- Dopo 5/7 giorni, a seconda del genotipo, raccogli le larve erranti della terza stella dalla fiala delicatamente con le pinze. Risciacquare le larve in 1x PBS per rimuovere il cibo attaccato alle larve. Trasferire le larve a un piatto di agar succo di mela per genotipine come descritto al punto 1.1.9 se necessario.
- Rotolare le larve su un tessuto utilizzando un pennello per asciugarli. Trasferisci le larve di 6-8 su uno scivolo preparato con nastro adesivo fronte/retro usando pinze.
2. Preparazione di aghi e iniezione di campioni
- Estrarre gli aghi su un estotraine a micropipette prima dell'avvio di questo protocollo. Fissare i tubi capillari nell'aghieretto e tirare secondo la forma dell'ago standard e i parametri per le iniezioni di D. melanogaster (Tabella 3)27. Conservare gli aghi in un piatto Petri ancorando in argilla fino all'uso per l'iniezione.
- Caricare un ago con 5 10 kDa dextran coniugato al sulforhodamina 101 cloruro acido (Tabella dei materiali) utilizzando una punta di pipetta da 20 litri a carica gel durante il periodo di disidratazione di 25 minuti per gli embrioni (passaggio 1.1.12), o immediatamente dopo il trasferimento di larve alla diapositiva (passaggio 1.2.3).
- Caricare l'ago in un porta ago e la posizione in un micromanipolatore fissato a una base in acciaio (Tabella dei materiali).
NOT: L'ago deve essere quasi parallelo allo stadio del microscopio per l'iniezione di embrioni e inclinato leggermente verso il basso per le iniezioni larvali. - Impostare l'apparato di iniezione (Tabella dei materiali) a 50 psi, 5,10 ms con un intervallo di 10.
NOT: Potrebbe essere necessario modificare queste impostazioni per il particolare apparato di iniezione utilizzato. - Posizionare la diapositiva sul palco e il bordo del pennello dell'ago sul bordo del nastro a due lati ad un angolo di 45 gradi per creare una punta angolata e rotta.
NOT: Per gli embrioni è solo necessario rompere la punta abbastanza per consentire il flusso del 10 kDa dextran. Un ago perfetto ha una punta leggermente angolata e solo una piccola goccia di tinenza uscirà ad ogni iniezione. Per le larve, è necessario rompere la punta più, ma con una punta angolata per penetrare la parete del corpo larvale. Una goccia più grande di tine verrà fuori. - Pompare il pedale del piede fino a quando il tinri è sulla punta dell'ago.
- Allineare l'ago in modo che sia parallelo con l'embrione o inclinato leggermente verso il basso verso la larva.
- Spostare l'ago per forare l'estremità posteriore del campione e iniettare il campione pompando il pedale del piede. Iniettare 2 nL di tintura negli embrioni e 220 nL di tinture nelle larve.
NOT: L'embrione o la larva deve inondare di tinrio se l'iniezione ha successo. - Si noti il tempo di iniezione per scopi di incubazione. Incubare gli embrioni per 10 min a temperatura ambiente. Incubare le larve per 30 min a temperatura ambiente.
- Continuare lungo il vetrino per iniettare campioni aggiuntivi, notando il tempo di iniezione per ogni campione.
NOT: A seconda della velocità con cui è possibile eseguire i passaggi di dissezione e di imaging successivi, è possibile iniettare alla volta campioni di 4,8 esemplari.
3. Preparazione di campioni per l'imaging
-
Imaging di embrioni
- Dopo l'iniezione, preparare gli embrioni per l'imaging. Applicare la gelatina di petrolio con un applicatore con punta di cotone sui lati destro e sinistro dei campioni sul vetrino come distanziale per evitare danni agli embrioni al momento del posizionamento del coperchio.
- Esempi di immagini che utilizzano un microscopio confocale per tutta la profondità dell'embrione con un obiettivo 20x. Calcolare la percentuale di campioni totali con tintura osservata nel cordone nervoso ventrale (VNC) utilizzando la seguente equazione: % di campioni con BBB compromessa - Numero di campioni con accumulo di tinture nel VNC/numero totale di campioni analizzati.
-
Dissezione e imaging delle larve
- Preparare i vetrini per i campioni larvali in anticipo. Montare due coprilabbra distanziate di circa 0,5 cm l'una dall'altra fino allo scivolo con smalto.
NOT: I copricoperture funzionano come distanziali per il cervello, quindi non è danneggiato durante il processo di montaggio. - Dopo l'incubazione di 30 min, sezionare le larve in 1x PBS direttamente sul vetrino che verrà utilizzato nell'imaging. In primo luogo, utilizzare una coppia di pinze per afferrare la larva a metà del corpo larvale e utilizzare una seconda coppia di pinze per separare le metà anteriori e posteriori della larva.
- Successivamente, utilizzare una coppia di pinze per afferrare la regione anteriore ai ganci della bocca e utilizzare una seconda coppia di pinze per invertire la parete del corpo sopra la punta delle pinze che afferrano i ganci della bocca. Il cervello e il VNC saranno esposti.
- Separare il cervello e il VNC dalla parete del corpo recidendo i nervi e rimuovere la parete del corpo dal vetrino (Figura 1C,D). Se lo si desidera, rimuovere i dischi immaginari.
- Coprire il campione con 10 luna dell'80% di glicerolo e posizionare un coperchio sopra il campione per l'imaging.
- Immagine attraverso la profondità del tessuto del sistema nervoso utilizzando un obiettivo 20x. Calcolare la percentuale di campioni totali con il tinrito osservato nel VNC.
- Preparare i vetrini per i campioni larvali in anticipo. Montare due coprilabbra distanziate di circa 0,5 cm l'una dall'altra fino allo scivolo con smalto.
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Representative Results
I metodi qui descritti consentono la visualizzazione dell'integrità della BBB in tutto il CNS in embrioni e larve di D. melanogaster (Figura 1). Al termine della formazione di BBB nella tarda embriogenesi, il BBB funziona per escludere grandi molecole dal cervello e VNC5. Questo protocollo sfrutta questa funzione per affermare la formazione di BBB. Quando furono iniettati embrioni di tipo selvaggio (Oregon R) in fase avanzata 17 (20-21 h- ) con 10 kDa dextran coniugati al sulforhodamina 101 colorante fluorescente acido cloruro, la grande molecola di dextran fu esclusa dal VNC, come previsto (Figura 2A). Per dimostrare l'effetto delle mutazioni genetiche sull'integrità della BBB, sono stati utilizzati embrioni con mutazioni nel gene grezzo. In precedenza, il gene grezzo è stato dimostrato per regolare la retrazione della banda germinale durante l'embriogenesi, e più recentemente ha dimostrato di funzionare nella glia per regolare i cambiamenti morfologici nel VNC durante lo sviluppo28. Eterozygous embrioni mutanti grezzi1 hanno mostrato un BBB intatto, simile ai risultati osservati negli embrioni di controllo di tipo selvatico (Figura 2B). Al contrario, gli embrioni mutanti crumi omozici hanno mostrato difetti nell'integrità della BBB, con 10 kDa dextran dye inondazione nel VNC, indicando che il BBB non è riuscito a formare (Figura 2C). Questi risultati dimostrano la capacità di questa tecnica di testare la formazione di BBB durante gli stadi embrionali.
Studi precedenti hanno dimostrato che un difetto nella poliploidizzazione glia subperineuriale provoca un'interruzione della BBB che può essere osservata nelle stadi larvali della terza stella7,9. Pertanto, i difetti nella formazione e/o nella manutenzione di BBB potrebbero comportare una BBB compromessa durante le fasi successive dello sviluppo, rendendo auspicabile la verifica dell'integrità della barriera nella terza fase larvale della stella. Pertanto, il protocollo utilizzato per affermare l'integrità BBB in stadi embrionali è stato ottimizzato per l'uso nelle larve. Nei campioni di controllo R dell'Oregon, 10 kDa dextran non riesce a penetrare nel BBB ed è escluso dal cervello e dal VNC (Figura 2D,E). Il tinrio si accumula alla periferia della BBB.
Figura 1: Il sistema nervoso degli embrioni di stadio 17 e della terza larva instar. (A) Schematico di una visione ventrale di un sistema nervoso centrale embrionale (SNC) stadio 17. Il CNS è costituito dal cervello (Br) e dal cordone nervoso ventrale (VNC), che ha canali dorsoventrali (ch). Il micropyle (mp; punta di freccia) all'estremità anteriore può essere utilizzato per orientare l'embrione. Posteriore a destra. (B) Fase 17 embrione orientato con il lato dorsale verso l'alto e posteriore a destra, come raccomandato nel passaggio 1.1.10. Le frecce puntano alla trachea. La punta della freccia indica l'mp. Posteriore a destra. (C) Schematica del sistema nervoso nella terza larva a stella. Il cervello (Br) e VNC compongono il SNC, mentre i nervi si estendono dalla sinapsi VNC sui muscoli della parete del corpo e fanno parte del PNS. Posteriore a destra. (D) Disincato terzo instar cervello larvale e VNC. Posteriore a destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi per la formazione di barriere emato-encefalice (BBB). (A-C) Alla fase avanzata 17 embrioni (20-21 h) iniettati posteriormente con 10 kDa sulforhodamine 101 dextran di cloruro acido. Posteriore verso il basso. Barra della scala: 20 m. I punti visti nei controlli sono canali dorsoventrali che si estendono lungo il cordone nervoso ventrale (VNC). (A) Controllo R dell'Oregon. Assorbimento della tinri nel 6,25% dei campioni, n . (B) controllo non elaboratodi1/a. Assorbimento della tinri nel 6,67% dei campioni, n . (C) Homozygous crudo1/1 mutante. Assorbimento del dato nel 100% dei campioni, n . (D) Oregon R controlla il terzo cervello larvale instar. La tinture si accumula al BBB, ma non penetra nel SNC, n . Barra della scala: 50 m. (E) Oregon R controllo terzo instar larvale VNC. La tinture si accumula al BBB, ma non penetra nel SNC, n . Linea tratteggiata delinea il VNC. Barra della scala: 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: morfologia Midgut nello sviluppo embrionale tardivo. Le immagini luminose trasmesse degli embrioni di stadio 13-17 consentono la visualizzazione della morfologia intestinale (regioni grigie scure nella metà posteriore dell'embrione). La morfologia midgut può essere utilizzata per determinare lo stadio di sviluppo embrionale, che è utile per determinare se gli embrioni vengono invecchiati in modo appropriato per l'iniezione. Barra della scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| soluzione | ricetta |
| 2% Gel di Agarose | Aggiungere 0,8 g di agarose a 40 mL di H2O a doppia distillazione (ddH2O) in una fiaschetta Erlenmeyer e microonde per sciogliere l'agar. Versare in un vassoio di colata gel e lasciare che il gel si solidifichi per 30 min a temperatura ambiente. |
| Piatti di agar succo di mela | Misurare 45 g di agar e 1,5 L di ddH2O in un flacone da 4 L. Autoclave per 40-45 min a 121 gradi centigradi. Misurare 50 g di zucchero e 0,5 L di succo di mela in un becher da 1 L e mescolare a fuoco basso (impostando 3) per sciogliere lo zucchero, facendo attenzione a non bruciarlo. Dopo l'autoclaving, aggiungere lo zucchero preriscaldato e il succo di mela all'agar e all'acqua. Mescolare a bassa temperatura con il fuoco spento per lasciar raffreddare fino a quando non si può toccarlo. Aggiungere 15 mL del 70% di tegosept e mescolare per disperdersi. Versare in un becher da 0,5 L. Spruzzare con etanolo per rimuovere bolle o fiamma con un bruciatore Bunsen. Versare in piatti di Petri da 60 mm. Lasciare impostare per almeno 24 h, o fino a quando non vi è una condensa minima sui coperchi dei piatti di Petri e conservare a 4 gradi centigradi. |
| 50% di candeggina | Aggiungere 15 mL di ddH2O e 15 mL di candeggina domestica in un tubo conico. |
| 80% Glicerolo | Per 10 mL, aggiungere 8 mL di autoclaved ddH2O e 2 mL di glicerolo a un tubo conico da 15 mL. Incubare su un rocker fino a quando la soluzione è omogenea. |
| 1x PBS | Per 1 L, diluire 100 mL di 10x PBS in 900 mL di ddH2O. |
| 10x PBS | Per 2 L, sciogliere quanto segue in 1.600 mL di ddH2O: 160 g di NaCl, 4 g di KCl, 28,8 g di 4HPO4e 4,8 g di KH2PO4. Regolare pH a 7,5 con HCl. |
| PBTx (PBS - 0,1% sovrascionianonlo nonionico) | Per 1 L, combinare 100 mL di 10x PBS, 10 mL di 10% di surfactant nonionico e 890 mL di ddH2O. |
| 70% Tegosept | Mescolare 1 g di acido p-idrossibenzoico, ester metilico per ogni 10 mL di 100% di etanolo. Conservare a -20 gradi centigradi. |
| 10% Surfactant nonionico | Per 50 mL, aggiungere 45 mL di autoclaved ddH2O e 5 mL di surfactant nonionico a un tubo conico. Ruotare sul rocker fino a quando la soluzione è omogenea. |
| Pasta di lievito | Mescolare il lievito attivo secco con ddH2O in un bicchiere di plastica da 50 ml fino a ottenere un composto omogeneo. |
Tabella 1: Reagenti e buffer utilizzati in tutto il protocollo.
| genotipo | merce |
| w[1118]; ln(2LR)Gla, wg[Gla-1]/CyO, P'w['mC]'GAL4-twi.G'2.2, P'w['mC]'UAS-2xEGFP'AH2.2 | Bloomington #6662 |
| il tasto W.']; sna[Sco]/CyO, P'w['mC]'Dfd-EYFP'2 | #8578 Bloomington |
| il tasto W.']; L[2] Pin[1]/CyO, P'w['mC]'GAL4-Kr.C'DC3, P'w['mC]'UAS'GFP. S65T-DC7 | #5194 Bloomington |
| Df(1)JA27/FM7c, P'w['mC]'-GAL4-Kr.C'DC1, P'w['mC]'UAS-GFP. S65T-DC5, sn['] | Bloomington #5193 |
| w[s]; ry[506] Dr[1]/TM6B, P'w['mc]'Dfd-EYFP'3, Sb[1] Tb[1] ca[1] | #8704 Bloomington |
| y[1] w[-]; D[']] gl[3]/TM3, P'w['mC]'GAL4-Kr.C'DC2, P'w['mC]'UAS-GFP. S65T-DC10, Sb[1] | Bloom #5195ington |
| Oregon R | Ceppi multipli disponibili |
| raw[1] cn[1] bw[1] sp[1]/CyO | #2749 Bloomington |
| P'w['mW.hs]'GawB'elav[C155] | #458 Bloomington |
| w[1118]; P'w['m'] , GAL4 , repo4/TM3, Sb[1] | #7415 Bloomington |
| P-UAS-GFP | Più ceppi disponibili |
Tabella 2: ceppi di volo. Ceppi di volo discussi in tutto questo protocollo. Il numero di azioni del Bloomington Drosophila Stock Center viene fornito ove applicabile.
| andare in bicicletta | calore | tirare | velocità f inv | ora | pressione | Rampa |
| 1 | 590 | 115 | 15 | 250 | 600 | X |
| 2 | 575 | 130 | 60 | 250 | 600 | X |
Tabella 3: Impostazioni dell'estraitore Micropipette. Impostazioni dell'emittente micropipette utilizzate per generare aghi per l'iniezione in questo protocollo.
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Discussion
Questo protocollo fornisce una descrizione completa dei passi necessari per testare l'integrità di BBB durante gli stadi larvali tardoembrionici e terzi instar dello sviluppo di D. melanogaster. Approcci simili sono stati descritti altrove per testare l'integrità della BBB durante lo sviluppo, così come nelle fasi adulte5,7,29,30. Tuttavia, le descrizioni delle procedure nelle sezioni dei materiali e dei metodi sono spesso di natura ampia e non dispongono di dettagli sufficienti per una facile implementazione, che richiedono una significativa risoluzione dei problemi per conto del ricercatore. Questo protocollo fornisce una descrizione completa dei passi necessari per testare l'integrità di BBB durante le fasi embrionali e larve. In ogni fase, ci sono passi critici da seguire per garantire che la fase corretta dello sviluppo venga esaminata e che l'architettura dei tessuti non venga interrotta, il che potrebbe compromettere la BBB. Per ottenere il successo in questi approcci è stato necessario risolvere i problemi relativi a più passaggi del protocollo in modo da ottenere risultati accurati. I passaggi critici nei protocolli embrionali e larvali sono descritti di seguito.
Studi precedenti hanno segnalato l'istituzione della BBB di 18,5 h AEL5. Per garantire tempi di sviluppo accurati, è importante mantenere i campioni a temperatura costante durante l'invecchiamento. Quando si raccolgono gli embrioni, le lastre di agar di succo di mela devono essere portate a 25 gradi centigradi prima dell'uso per la raccolta. Utilizzando piatti di succo di mela che non sono stati pre-riscaldati risultati in sviluppo più lento e può produrre campioni che non hanno ancora stabilito un BBB e mostrerebbe quindi accumulo di 10 kDa dextran nel sistema nervoso. Di conseguenza, è importante assicurarsi che si iniettano campioni più vecchi di 18,5 h. Inoltre, quando si eseguono questi esperimenti in embrioni, è necessario considerare la possibilità di un ritardo dello sviluppo, perché tale ritardo potrebbe semplicemente successiva costituzione della BBB. Per tenere conto di eventuali ritardi nello sviluppo, i campioni sono stati catalogati a 20-21 h AEL, leggermente dopo la formazione di BBB segnalata. L'uso della morfologia di altri tessuti, in particolare il midgut in via di sviluppo, può aiutare a stabilire la corretta fase di sviluppo dell'embrione analizzato (Figura 3). Al contrario, tempi sperimentali impropri possono provocare campioni che sono già motili e hanno iniziato il processo di schiusa. Per ridurre il numero di larve che hanno già iniziato a schiudersi, è importante eseguire un minimo di due raccolte da 1 h per eliminare gli embrioni più vecchi dalle femmine prima di raccogliere gli embrioni per l'iniezione. Se si desidera un'analisi della BBB nelle prime larve instelle, una breve incubazione delle larve in 1x PBS in un piatto a 9 pozzetti sul ghiaccio può essere utilizzata per ridurre la motilità prima dell'iniezione. I vetrini possono anche essere tenuti su una confezione di ghiaccio durante la procedura di iniezione per ridurre la motilità.
Al fine di garantire immagini di qualità e risultati accurati per quanto riguarda l'istituzione della BBB nell'embrione, è necessario seguire con attenzione ulteriori passaggi. Quando si allineano gli embrioni sulla lastra di agar, la trachea dovrebbe essere rivolta verso l'alto, in quanto questo è il lato dorsale dell'embrione (Figura 1B). Quando gli embrioni vengono trasferiti al vetrino con il nastro a due lati, il lato ventrale dell'embrione sarà quindi rivolto verso l'alto, consentendo una visualizzazione ottimale del cordone nervoso durante l'imaging confocale più avanti nel protocollo. Gli embrioni devono anche essere aderisti saldamente al nastro a due lati per inibire il movimento durante l'iniezione. L'uso di un cuscinetto piatto 2% agarose permette al ricercatore di spingere saldamente il vetrino con il nastro doppio lato sugli embrioni durante il processo di trasferimento senza il rischio di danni agli embrioni. Dopo il trasferimento al vetrino, l'idratazione è necessaria per evitare che l'embrione scoppi durante l'iniezione di tintura. L'iniezione di troppo tincolo può anche causare l'esplosione dell'embrione. È importante inserire solo l'ago nell'embrione abbastanza da iniettare il tinrito, ma non tanto che l'ago potenzialmente fora il sistema nervoso, il che darebbe un risultato falso positivo. Troppo grande di una ferita di puntura può anche provocare l'emolinfa e la tintura che fuoriesce dall'embrione, portando a un esperimento fallito. Con queste potenziali insidie in mente, l'iniezione ha più successo con un ago che ha una leggera angolazione alla punta, in modo che ci sia un piccolo punto con cui forare con attenzione l'embrione.
Nel caso di sodire le larve per l'integrità bBB, possono sorgere sfide a causa della motilità del campione. L'uso di nastro a doppio lato di alta qualità è fondamentale, in quanto dovrebbe essere efficace nell'immobilizzare le larve per l'iniezione. Se la larva si stacca, può essere arrotolata sul nastro e spinta delicatamente verso il basso per riproteggerla. Quando si trasportano le larve per l'iniezione, è utile trasportare la diapositiva in un piatto Petri nel caso in cui le larve si sblocchino. I passaggi successivi all'iniezione richiedono la massima attenzione per evitare l'interruzione della BBB. Al fine di ridurre al minimo i potenziali danni al campione, è più facile sezionare il campione direttamente sui vetrini che verranno utilizzati per l'imaging. Se la larva è fortemente aderente al nastro durante il trasferimento del campione per la dissezione, una goccia di 1x PBS può essere aggiunta al nastro per allentare l'adesione e per consentire il trasferimento al vetrino per la dissezione. Dopo la dissezione, è importante appiattire il campione sufficientemente per evitare risultati falsi positivi, ma non tanto che l'integrità del campione sia compromessa. Sandwiching la larva tra il coverslip e lo scivolo utilizzando ulteriori coverlips come distanziali impedisce al cervello di essere danneggiato, ma immobilizza il campione per un'imaging efficace.
Al fine di raggiungere il successo con protocolli sia per gli embrioni che per le larve, è fondamentale assicurarsi che l'apparato di iniezione e il microscopio confocale siano impostati prima dell'inizio dell'elaborazione del campione. Ciò consente una tempistica accurata nell'imaging dei campioni, che è necessaria per il confronto dei campioni. Altri approcci hanno utilizzato set up di iniezione più avanzati, che richiedono un microscopio invertito impostato per l'iniezione di embrioni. Questo protocollo utilizza un microscopio sezionante standard e micromanipolatore con un regolatore di pressione. In questo caso, un'iniezione di pesce zebra messa in piedi è stata semplicemente adattata per l'iniezione di embrioni di mosca e larve. Questo protocollo potrebbe essere ulteriormente semplificato per utilizzare un micromanipolatore con una siringa per l'iniezione pure. Molti di questi strumenti sono facilmente disponibili nei reparti di biologia e possono anche essere disponibili nelle impostazioni di laboratorio delle aule, consentendo la massima facilità di implementazione del protocollo.
Durante la procedura di imaging, può essere utile etichettare le cellule del sistema nervoso per identificare più facilmente la regione desiderata per l'imaging. In particolare, si potrebbe utilizzare il sistema GAL4/UAS per esprimere GFP in neuroni o glia, utilizzando i ceppi elav-Gal4 o repo-Gal4, rispettivamente (Tabella 2)31,32,33. Tale etichettatura fornirebbe un contrasto con la sulforhodamina 101 dextran di cloruro acido per visualizzare l'integrità del sistema nervoso.
Mentre questo metodo è focalizzato sul sogiurare l'integrità del BBB durante lo sviluppo di D. melanogaster, questo approccio potrebbe essere adattato per esaminare l'integrità di altre barriere attraverso una varietà di organismi e tessuti. Ad esempio, sono stati pubblicati protocolli simili per affermare la BBB nei topi34. Inoltre, la permeabilità della barriera occhiale ematoe e la barriera somatica che circonda le cellule germinali durante la spermatogenesi in D. melanogaster utilizzano un approccio simile29,35. Il protocollo potrebbe anche essere adattato per l'uso in altri tessuti per testare la permeabilità, anche nell'intestino. Quando si adatta questo protocollo per l'uso in altri tessuti o specie, sarà necessario considerare la dimensione delle molecole che possono penetrare la barriera, in quanto è fattibile che 10 kDa dextran possa essere abbastanza piccolo da permeare alcune barriere. Nel complesso, questo protocollo fornisce una procedura passo-passo per testare l'integrità di BBB durante lo sviluppo di D. melanogaster che può essere facilmente adattata per l'uso in altri ambienti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Dr. F. Bryan Pickett e il Dr. Rodney Dale per l'uso di attrezzature per l'iniezione. Questo lavoro è stato finanziato da finanziamenti per la ricerca della Loyola University di Chicago a M.D., D.T., e J.J.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
References
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
- Hindle, S. J., Bainton, R. J.
- Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
- Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
- Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
- von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
- Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
- Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
- Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
- Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
- Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
- Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
- Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
- von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
- Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
- DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
- BDSC Cornmeal Food. , Bloomington Drosophila Stock Center. Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017).
- Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).
- Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
- Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
- Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
- Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
- Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
- Love, C. R., Dauwalder, B. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. , Humana Press. New York, NY. 175-185 (2019).
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
- Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).
