Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Analys för blod-hjärnbarriären integritet i Drosophila melanogaster

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60233
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Loyola University Chicago

Summary

Blod-hjärnbarriären integritet är avgörande för nervsystemets funktion. I Drosophila melanogasterbildas blod-hjärnbarriären av glialceller under sen embryogenes. Detta protokoll beskriver metoder för att analys för blod-hjärnbarriären bildning och underhåll i D. melanogaster embryon och tredje INSTAR larver.

Abstract

Korrekt nervsystemet utveckling omfattar bildandet av den Blood-brain barriären, diffusions barriären som tätt reglerar tillgång till nervsystemet och skyddar nervvävnad från toxiner och patogener. Defekter i bildandet av denna barriär har korrelerats med neuropatier, och nedbrytningen av denna barriär har observerats i många neurodegenerativa sjukdomar. Därför är det viktigt att identifiera de gener som reglerar bildandet och underhållet av blod-hjärnbarriären för att identifiera potentiella terapeutiska mål. För att förstå de exakta rollerna dessa gener spelar i neurala utveckling, är det nödvändigt att analysen effekterna av förändrade genuttryck på integriteten av blod-hjärnbarriären. Många av de molekyler som fungerar i upprättandet av blod-hjärnbarriären har visat sig vara bevaras över eukaryota arter, inklusive bananfluga, Drosophila melanogaster. Fruktflugor har visat sig vara ett utmärkt modellsystem för att undersöka de molekylära mekanismerna som reglerar nervsystemets utveckling och funktion. Detta protokoll beskriver ett steg-för-steg-förfarande för att assay för blod-hjärnbarriären integritet under embryonala och larvstadier av D. melanogaster utveckling.

Introduction

Under utveckling, cell-cellkommunikation och interaktioner är avgörande för inrättandet av vävnad och organ struktur och funktion. I vissa fall, dessa cell-cell interaktioner tätning av organ från den omgivande miljön för att säkerställa korrekt organfunktion. Detta är fallet för nervsystemet, som isoleras av blod-hjärnbarriären (BBB). Dysfunktion av BBB hos människor har kopplats till neurologiska sjukdomar inklusive epilepsi, och nedbrytning av barriären har observerats i neurodegenerativa sjukdomar inklusive multipel skleros och amyotrofisk lateral skleros1. Hos däggdjur bildas BBB genom täta korsningar mellan endotelceller2,3. Andra djur, inklusive bananfluga, Drosophila melanogaster, har en BBB består av gliaceller. Dessa gliaceller celler bildar en selektivt permeabel barriär för att kontrollera rörligheten för näringsämnen, slaggprodukter, toxiner, och stora molekyler in i och ut ur nervsystemet4. Detta möjliggör underhåll av den elektrokemiska lutning som krävs för att avfyra actionpotentialer, möjliggör rörlighet och samordning4. I D. melanogasterskyddar glia nervsystemet från den kalium rika, blodliknande hemolymfa5.

I centralanervsystemet (CNS) och perifera nervsystemet (PNS) av D. melanogaster, två yttre glialskikt, subperineurial glia och perineurial glia, samt ett yttre nätverk av extracellulär matris, den neurala lamellerna, bildar den hemolymfa-hjärna och hemolymfa-nerv barriär6, kallad BBB hela denna artikel. Under utveckling subperineurial glia bli polyploida och förstora för att omge nervsystemet5,6,7,8,9,10,11 . Subperineurial glia bildar septate korsningar, som ger den huvudsakliga diffusion barriären mellan hemolymfa och nervsystemet5,6,12. Dessa korsningar är molekylärt liknar septate-liknande korsningar finns på paranodes av myelinating glia i ryggradsdjur, och de utför samma funktion som täta korsningar i BBB av däggdjur13,14, 15 , 16 , 17. den perineurial glia dividera, växa, och Linda runt subperineurial glia att reglera spridningen av metaboliter och stora molekyler6,10,18,19. BBB-bildningen är avslutad med 18,5 h efter äggläggningen (AEL) vid 25 ° c5,8. Tidigare studier har identifierat gener som är kritiska regulatorer av BBB-formation20,21,22. För att bättre förstå de exakta rollerna för dessa gener, är det viktigt att undersöka effekten av mutation av dessa potentiella tillsynsmyndigheter på BBB integritet. Medan tidigare studier har skisserat metoder för testmetoder BBB integritet i embryon och larver, ett omfattande protokoll för denna analys har ännu inte beskrivits5,7. Detta steg-för-steg-protokoll beskriver metoder för testmetoder BBB integritet under D. melanogaster embryonala och tredje INSTAR larvstadier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. provtagning

  1. Embryosamling
    1. I varje embryosamlingsbur, Använd minst 50 jungfru honor med 20 − 25 hanar för samlingar. Inkubera dessa flugor i en flaska med majsmjöl-agar mat (tabell över material) för 1 − 2 dagar före början samlingar23.
      Anmärkning: Fler flugor kan användas, men förhållandet mellan kvinnor och män bör hållas vid 2:1.
    2. Pre-Warm äppeljuice agar tallrikar (tabell 1) vid 25 ° c över natten.
      Anmärkning: Detta krävs för korrekt iscensättning av embryon. Om plattorna torkar ut snabbt, tillsätt en skål med vatten till inkubatorn för att öka luftfuktigheten i kammaren.
    3. Anesthetize flyger från steg 1.1.1 med CO2 och överföra flugor till en samling bur. Placera en förvärmd äppeljuice agar tallrik med ett litet utstryk av jästpasta på den öppna änden och säkra till buren med den röda hylsan (tabell över material). För att klara äldre embryon, låt flugor att lägga embryon/ägg på en äppeljuice agar plattan för 1 h vid 25 ° c.
    4. Ta bort uppsamlings buren från inkubatorn. Vänd bur mesh sidan ner och knacka flugor ner till botten av buren. Ersätt äppeljuice agar med en ny förvärmda äppeljuice agar tallrik med ett litet utstryk av jästpasta. Kassera den första plattan.
    5. Låt flugor att lägga embryon/ägg på den nya äppeljuice agar plattan för 1 h vid 25 ° c. Kassera denna platta efter 1 h-kollektionen och fortsätt till nästa steg för att samla in embryon för injektion.
    6. För att samla in sena steg 17 embryon (20 − 21 h AEL), låt flugor av önskad genotyp från steg 1.1.1 − 1.1.5 att lägga på en ny förvärmda äppeljuice agar plattor med ett litet utstryk av jästpasta vid 25 ° c för 1 h. ålders skylt för 19 h i en 25 ° c inkubator , så embryon kommer att vara 20 − 21 h ålder vid tidpunkten för avbildning.
      Anmärkning: Det här steget kan upprepas efter behov för flera omgångar med provinsamling, injektion och avbildning.
    7. Samla in embryon från plattor i en cell SIL med 70 μm nylonnät genom att tillsätta fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 0,1% nonioniskt ytaktivt ämne (PBTx; Tabell 1) för att täcka ytan av plattan och lossa embryon från ytan med en pensel.
    8. Dekorionat embryon som samlats in i cellen SIL i en 50% blekmedel lösning (tabell 1) i en 100 mm petriskål i 5 min med tillfällig agitation i rumstemperatur. Skölj embryon 3x genom att virvlande cellen SIL i PBTx i en petriskål, med hjälp av en ny maträtt av PBTx varje gång.
    9. Om alla embryon är av rätt genotyp, Fortsätt direkt till steg 1.1.10. Om generering av embryon av den korrekta genotyp kräver ett kors med heterozygot flugor, Välj embryon av rätt genotyp med närvaro eller frånvaro av fluorescerande märkta Balanserare kromosomer. Använd stereomikroskop med fluorescerande funktioner för genotyp markering.
      Anmärkning: Balanserarens kromosomer markerade med deformerade-gult fluorescerande protein; Kruppel-GAL4, UAS-grönt fluorescerande protein (GFP); och twist-Gal4, UAS-GFP fungerar bra för genotyp val i sena embryogenes (tabell 2)24,25,26.
    10. Överför embryon i PBTx till en 2-procentig agaros gel platta (tabell 1) med hjälp av en glaspipett. Ta bort överflödig vätska med filterpapper. Align ~ 6 − 8 embryon på 2% agaros gel platta med bakre till höger och ryggsidan vänd uppåt (figur 1B).
      Anmärkning: Den micropyle, det lilla hålet genom vilket spermier in i ägget, ligger på den främre änden av embryot. Den bakre änden är mer rundad. Luftstrupen verkar vit och ligger dorsalt i embryot, vilket möjliggör distinktionen av dorsala och ventrala sidorna av embryot (figur 1B).
    11. Förbered en bild med en bit dubbelhäftande tejp. Tryck hårt på bilden ovanpå embryona för att överföra dem till dubbelhäftande tejp.
    12. Desiccate embryon genom inkubation vid rumstemperatur för ~ 25 min (inget torkmedel används). Efter uttorkning, täck över embryon med halokololja.
      Anmärkning: Tork perioderna kan variera beroende på temperatur, fuktighet och ventilation i rummet. Inkubationstiden bör användas för att ställa in den utrustning för injektion och det konfokala mikroskopet för avbildning som beskrivs i avsnitten 2 och 3 i detta protokoll.
  2. Larval Collection
    1. Ställ in ett kors med 5 − 10 Virgin kvinnliga flugor av önskad genotyp och hälften så många hanar av den önskade genotypen i en injektionsflaska med majsmjöl-agar mat och inkubera vid 25 ° c23.
    2. Efter 5 − 7 dagar, beroende på genotyp, samla vandrande tredje INSTAR larver från injektionsflaskan försiktigt med tång. Skölj larverna i 1x PBS för att ta bort mat som fastnat på larverna. Överför larver till en äppeljuice-agar-platta för genotypning enligt beskrivningen i steg 1.1.9 vid behov.
    3. Rulla larver på en vävnad med en pensel för att torka av dem. Överför 6 − 8 larver till en rutschkana med dubbelhäftande tejp med hjälp av pinpetten.

2. beredning av nålar och preparat insprutning

  1. Dra nålar på en micropipett avdragare innan detta protokoll inleds. Säkra kapillärrör i nålavdragare och dra i enlighet med standard nål form och parametrar för D. melanogaster injektioner (tabell 3)27. Förvara nålar i en petriskål genom att förankra i lera tills de används för injektion.
  2. Fyll på en nål med 5 μL 10 kDa dextran konjugerat med sulforhodamin 101 syraflorid (tabell över material) med hjälp av en 20 μl gel-loading pipettspets under 25-min tork period för embryon (steg 1.1.12), eller omedelbart efter överföring av Larverna till bilden (steg 1.2.3).
  3. Fyll på nålen i en nålhållare och placera den i en mikromanipulator som är säkrad mot en stål bas (tabell över material).
    Anmärkning: Nålen bör vara nästan parallellt med mikroskopet skede för embryo injektion och vinklad något nedåt för larv injektioner.
  4. Ställ in injektions apparaten (tabell över material) till 50 psi, 5 − 10 MS med en räckvidd på 10.
    Anmärkning: Det kan vara nödvändigt att ändra dessa inställningar för den särskilda injektions apparat som används.
  5. Placera bilden på scenen och borst kanten av nålen mot kanten av dubbelhäftande tejp på en 45 ° vinkel för att skapa en vinklad, bruten spets.
    Anmärkning: För embryon är det bara nödvändigt att bryta spetsen tillräckligt för att möjliggöra flöde av 10 kDa dextran. En perfekt nål har en lätt vinklad spets och endast en liten droppe färg kommer att komma ut med varje injektion. För larver, är det nödvändigt att bryta spetsen mer, men med en vinklad spets för att tränga igenom larv kroppen väggen. En större droppe färg kommer att komma ut.
  6. Pumpen fotpedal tills färgen är på spetsen av nålen.
  7. Rikta in nålen så att den är parallell med embryot eller vinklad något nedåt mot larven.
  8. Flytta nålen för att punktera den bakre änden av preparatet och injicera preparatet genom att pumpa fotpedalen. Injicera ~ 2 nL av färgämne i embryon, och ~ 220 nL av Dye till larver.
    Anmärkning: Embryot eller larv bör översvämma med färgämne om injektionen är framgångsrik.
  9. Observera tiden för injektion för inkubations ändamål. Inkubera embryon i 10 minuter vid rumstemperatur. Inkubera larverna i 30 minuter vid rumstemperatur.
  10. Fortsätt nedåt i bilden för att injicera ytterligare prover och notera tidpunkten för injektionen för varje preparat.
    Anmärkning: Beroende på hastigheten med vilken efterföljande dissekera-och avbildnings steg kan utföras, kan 4 − 8 prover injiceras i taget.

3. beredning av prover för avbildning

  1. Avbildning av embryon
    1. Bered embryon för avbildning efter injektionen. Applicera vaselin med en bomull-tippad applikator på höger och vänster sida av proverna på bilden som en spacer för att förhindra skador på embryon vid placering av täckglas.
    2. Bild prov med hjälp av ett konfokala Mikroskop genom djupet av embryot med ett 20x mål. Beräkna procentandelen av totala prover med färg observeras i ventrala nerv sladden (VNC) med hjälp av följande ekvation:% av prover med komprometterad BBB = antal prover med färgning ackumulering i VNC/totalt antal prover analyseras.
  2. Dissektion och avbildning av larver
    1. Förbered diabilder för larv prover i förväg. Montera två täckband fördelade ca 0,5 cm isär till bilden med nagellack.
      Anmärkning: Täckglas fungerar som distaner för hjärnan, så det är inte skadat under monteringsprocessen.
    2. Efter 30 min inkubation, dissekera larverna i 1x PBS direkt på bilden som kommer att användas i Imaging. Först, Använd ett par tång för att greppa larven halvvägs ner i larv kroppen, och använda ett andra par tång för att separera den främre och bakre halvorna av larven.
    3. Nästa, använda ett par tång för att greppa den främre regionen vid munnen krokar, och använda ett andra par pinknålar för att invertera kroppen väggen över spetsen av Pinkett greppa munnen krokar. Hjärnan och VNC kommer att exponeras.
    4. Separera hjärnan och VNC från kroppen väggen genom att bryta nerverna, och ta bort kroppen väggen från bilden (figur 1C, D). Ta bort imaginal skivor om så önskas.
    5. Täck provet med 10 μL 80% glycerol och placera en täckslip ovanpå provet för avbildning.
    6. Bild genom djupet av nervsystemet vävnad med hjälp av en 20x mål. Beräkna procentandelen av totala prover med färg observeras i VNC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De metoder som beskrivs här möjliggör visualisering av integriteten hos BBB i hela CNS i D. melanogaster embryon och larver (figur 1). Efter avslutad BBB formation i sena embryogenes, BBB funktioner för att utesluta stora molekyler från hjärnan och VNC5. Detta protokoll utnyttjar denna funktion för att assay BBB formation. När Wild-Type (Oregon R) sent stadium 17 (20 − 21 h gamla) embryon injicerades med 10 kDa dextran konjugerat till sulforodamin 101 syra klorid fluorescerande färgämne, den stora dextran molekylen uteslöts från VNC, som förväntat (figur 2A). För att påvisa effekten av genetiska mutationer på BBB-integritet utnyttjades embryon med mutationer i den råa genen. Tidigare har den råa genen visats reglera Bakterie bands retraktion under embryogenes, och på senare tid har visats fungera i glia för att reglera morfologiska förändringar i VNC under utveckling28. Heterozygot rå1 Mutant embryon uppvisade en intakt BBB, liknande de resultat som observerats i vilda-typkontroll embryon (figur 2B). I motsats, homozygot rå1 Mutant embryon uppvisade defekter i integriteten hos BBB, med 10 kDa dextran färgämnen översvämningar i VNC, vilket indikerar att BBB inte bildas (figur 2C). Dessa resultat visar förmågan hos denna teknik för att assay BBB bildas under embryonala stadier.

Tidigare studier har visat att en defekt i subperineurial glia polyploidisering resulterar i en störning av BBB som kan observeras i tredje INSTAR larvstadier7,9. Således kan defekter i BBB formation och/eller underhåll resultera i en komprometterad BBB under senare stadier av utveckling, vilket gör det önskvärt att assay integritet barriären i den tredje INSTAR larv skede. Därför, protokollet utnyttjas för testmetoder BBB integritet i embryonala stadier har också optimerats för användning i larver. I Oregon R kontroll prover, 10 kDa dextran inte penetrera BBB och är utesluten från hjärnan och VNC (figur 2D, E). Färgen ackumuleras i periferin av BBB.

Figure 1
Figur 1: nervsystemet på Stadium 17 embryon och tredje INSTAR larv. (A) schematiskt av en ventrala syn på ett stadium 17 embryonala centralanervsystemet (CNS). CNS består av hjärnan (br) och ventrala nerv sladden (VNC), som har dorsoventral kanaler (CH). Den micropyle (MP; Arrowhead) i den främre änden kan användas för att orientera embryot. Posteriort till höger. B) steg 17 embryo orienterade med ryggsidan upp och posteriort till höger, som rekommenderas i steg 1.1.10. Pilarna pekar på luftstrupen. Arrowhead indikerar MP. Posteriort till höger. C) schematiska av nervsystemet i den tredje INSTAR larven. Hjärnan (br) och VNC komponera CNS, medan nerverna sträcker sig från VNC synapsen på kroppen väggen muskler och är en del av PNS. Posteriort till höger. (D) dissekerade tredje INSTAR larv hjärna och VNC. Posteriort till höger. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: analys för bildandet av blod-hjärnbarriären (BBB). (a-C) Sent stadium 17 embryon (20 − 21 h gamla) injiceras posteriort med 10 kDa sulforodamin 101 Acid klorid dextran. Posteriort ner. Skalstapel = 20 μm. Prickar som syns i kontrollerna är dorsoventrala kanaler som spänner över den ventrala nerv sladden (VNC). A) Oregon R-kontroll. Färg upptaget i 6,25% av proverna, n = 16. (B) rå1/+ syskon kontroll. Färg upptaget i 6,67% av proverna, n = 15. C) homozygot rå1/1 Mutant. Färg upptaget i 100% av proverna, n = 22. D) Oregon R kontrollera tredje INSTAR larv hjärna. Färgämne ackumuleras på BBB, men tränger inte in i CNS, n = 7. Skalstapel = 50 μm. (E) Oregon R kontroll tredje INSTAR larv VNC. Färgämne ackumuleras på BBB, men tränger inte in i CNS, n = 11. Streckad linje beskriver VNC. Skalstapel = 50 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: midgut morfologi i sen embryonal utveckling. Överförda ljus bilder av Stadium 13 − 17 embryon möjliggör visualisering av tarmmorfologi (mörkgrå regioner i den bakre halvan av embryot). Midgut morfologi kan användas för att bestämma stadiet av embryonal utveckling, vilket är användbart när man fastställer om embryon åldras på lämpligt sätt för injektion. Skalstapel = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Lösning Recept
2% aguppkommit gel Tillsätt 0,8 g Agreste till 40 mL dubbeldestillerat H2O (ddH2O) i en Erlenmeyerkolv och mikrovågsugn för att lösa upp agar. Häll i en gel gjutning bricka och låt gelen att stelna i 30 min vid rumstemperatur.
Äppeljuice agar tallrikar Mät 45 g agar och 1,5 L ddH2O i en 4 L kolv. Autoklav för 40 − 45 min vid 121 ° c. Mät 50 g socker och 0,5 L äppeljuice i en 1 L bägare och rör om låg värme (inställning 3) för att lösa upp socker, noga med att inte bränna den. Efter autoklavering, tillsätt förvärmd socker och äppeljuice till agar och vatten. Rör om låg med värmen av att svalna tills du kan röra den. Tillsätt 15 mL 70% tegosept och rör om för att skingra. Häll i en 0,5 L-bägare. Spraya med etanol för att ta bort bubblor eller flammor med en bunsenbrännare. Häll i 60 mm petriskålar. Låt ställa in minst 24 h, eller tills det finns minimal kondens på locken på Petriskålarna och förvara vid 4 ° c.
50% blekmedel Tillsätt 15 mL ddH2O och 15 ml hushållsblekmedel i ett koniskt rör.
80% glycerol Tillsätt 8 ml autoklaverad ddH2O och 2 ml glycerol till ett 15 ml koniskt rör för 10 ml. Inkubera på en rocker tills lösningen är homogen.
1x PBS För 1 L, späd 100 mL 10X PBS i 900 mL ddH2O.
10X PBS För 2 L, lös följande i 1 600 mL ddH2O: 160 g NaCl, 4 g kcl, 28,8 g na2hpo4och 4,8 g KH2Po4. Justera pH till 7,5 med HCl.
PBTx (PBS + 0,1% nonioniskt ytaktivt ämne) För 1 L, kombinera 100 ml 10X PBS, 10 ml 10% icke-jonaktivt tensid, och 890 ml DDH2O.
70% tegosept Blanda 1 g p-hydroxybensoesyra, metylester för varje 10 mL av 100% etanol. Förvaras vid-20 ° c.
10% nonioniskt ytaktivt ämne För 50 mL, tillsätt 45 mL autoklaverat ddH2O och 5 ml nonioniskt ytaktivt ämne till ett koniskt rör. Rotera på vippan tills lösningen är homogen.
Jäst pasta Blanda torr aktiv jäst med ddH2O i en 50 ml Plastbägare tills slät.

Tabell 1: reagenser och buffertar som används i detta protokoll.

Genotyp Lager
w [1118]; ln (2LR) gla, WG [gla-1]/CyO, P {w [+ mC] = GAL4-Twi. G} 2,2, P {w [+ mC] = UAS-2xEGFP} AH 2,2 Bloomington #6662
w {*]; SNA [SCO]/CyO, P {w [+ mC] = DFD-EYFP} 2 Bloomington #8578
w {*]; L [2] stift [1]/CyO, P {w [+ mC] = GAL4-kr. C} DC3, P {w [+ mC] = UAS = GFP. S65T}DC7 Bloomington #5194
DF (1) JA27/FM7c, P {w [+ mC] = GAL4-kr. C} DC1, P {w [+ mC] = UAS-GFP. S65T} DC5, SN [+] Bloomington #5193
w [*]; ry [506] Dr [1]/TM6B, P {w [+ MC] = DFD-EYFP} 3, SB [1] TB [1] ca [1] Bloomington #8704
y [1] w [*]; D [*] gl [3]/TM3, P {w [+ mC] = GAL4-kr. C} DC2, P {w [+ mC] = UAS-GFP. S65T} DC10, SB [1] Bloomington #5195
(Ramstedt) Flera stammar tillgängliga
rå [1] CN [1] BW [1] SP [1]/CyO Bloomington #2749
P {w [+ mW. HS] = GawB} elav [c155] Bloomington #458
w [1118]; P {w [+ m *] = GAL4} repo/avsett TM3, SB [1] Bloomington #7415
P {UAS-GFP} Flera stammar tillgängliga

Tabell 2: flug stammar. Flug stammar som diskuteras i detta protokoll. Den Bloomington Drosophila Stock Center lagernummer anges i tillämpliga fall.

Cykel Värme Dra Hastighet Tid Tryck Ramp
1 590 115 15 250 600 X
2 575 130 60 250 600 X

Tabell 3: inställningar för Micropipettavdragare. Micropipett avdragare inställningar används för att generera nålar för injektion i detta protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll ger en omfattande beskrivning av de steg som behövs för att assay för BBB integritet under sena embryonala och tredje INSTAR larvstadier av D. melanogaster utveckling. Liknande metoder har beskrivits på andra ställen för att assay integriteten av BBB under utveckling, samt i vuxen stadier5,7,29,30. Beskrivningar av procedurer i material-och metod avsnitt är dock ofta av bred karaktär och saknar tillräcklig detaljrikedom för enkel implementering, vilket kräver betydande felsökning på forskarens vägnar. Detta protokoll ger en omfattande beskrivning av de steg som behövs för att assay för BBB integritet under embryonala och larvstadier. I varje skede finns det kritiska steg som skall följas för att säkerställa att det korrekta utvecklingsstadiet undersöks och vävnads arkitekturen inte störs, vilket skulle kunna äventyra BBB. För att uppnå framgång i dessa metoder var det nödvändigt att felsöka flera steg i protokollet för att ge korrekta resultat. Kritiska steg i de embryonala och larv protokollen beskrivs nedan.

Tidigare studier har rapporterat inrättandet av BBB med 18,5 h AEL5. För att säkerställa noggrann utveckling timing, är det viktigt att underhålla prover vid en konstant temperatur under åldrande. Vid insamling av embryon bör äppeljuice-agar-plattor föras till 25 ° c före användning för uppsamling. Använda äppeljuice plattor som inte har förvärmts resulterar i långsammare utveckling och kan ge prover som ännu inte har etablerat en BBB och skulle därför uppvisar ackumulering av 10 kDa dextran i nervsystemet. Som sådan är det viktigt att se till att man injicerar prover som är äldre än 18,5 h. Dessutom, när de utför dessa experiment på embryon, är det nödvändigt att överväga möjligheten av en utvecklingsförsening, eftersom en sådan försening kan helt enkelt resultera i den mer sistnämnda etableringen av BBB. För att ta hänsyn till eventuella förseningar i utvecklingen har proverna analyserats vid 20 − 21 h AEL, något efter rapporterad BBB-bildning. Att använda morfologin i andra vävnader, särskilt utvecklingen av midgut, kan bidra till att fastställa det korrekta utvecklingsstadiet för embryot som analyseras (figur 3). Omvänt kan felaktig experimentell timing resultera i prover som redan är rörliga och har börjat kläcknings processen. För att minska antalet larver som redan har börjat kläckning, är det viktigt att utföra minst två 1 h samlingar för att rensa äldre embryon från kvinnor innan du samlar in embryon för injektion. Om analys av BBB i första INSTAR larver önskas, en kort inkubation av larver i 1x PBS i en 9-väl skålen på isen kan användas för att minska motilitet före injektion. Diabilder kan också hållas på en Ice Pack under injektionsproceduren för att minska motilitet.

För att säkerställa kvalitet bilder och korrekta resultat när det gäller inrättandet av BBB i embryot, ytterligare åtgärder måste följas noggrant under hela förfarandet. Vid uppställning av embryon på agarplattan bör luftstrupen vara vänd uppåt eftersom det är embryots rygg sida (figur 1B). När embryona överförs till bilden med dubbelhäftande tejp, kommer den ventrala sidan av embryot sedan vända upp, vilket möjliggör optimal visualisering av nerv sladden under konfokal avbildning senare i protokollet. Embryon måste också vara ordentligt fastklibbade på dubbelhäftande tejp för att hämma rörelse under injektionen. Användningen av en platt 2% aguppstod pad gör det möjligt för forskaren att driva bilden med dubbelhäftande tejp stadigt på embryon under överföringen utan risk för skador på embryon. Efter överföring till bilden, är uttorkning nödvändig för att förhindra att embryot spricker vid färg injektion. Injektion av för mycket färgämne kan också orsaka embryot att brista. Det är viktigt att bara sätta in nålen i embryot tillräckligt för att injicera färgämnet, men inte så mycket att nålen potentiellt punkteringar nervsystemet, vilket skulle ge ett falskt positivt resultat. För stor av ett punkteringssår kan också resultera i hemolymfa och färga översvämningar ut ur embryot, vilket leder till ett misslyckat experiment. Med dessa potentiella fallgropar i åtanke, injektion är mest framgångsrik med en nål som har en liten vinkel till spetsen, så att det finns en liten punkt som att försiktigt punktera embryot.

När det gäller testmetoder larver för BBB integritet, kan utmaningar uppstå på grund av motilitet av provet. Användningen av högkvalitativ dubbelhäftande tejp är kritisk, eftersom det bör vara effektiva i immobilisera larver för injektion. Om larven inte fastnar, kan den rullas tillbaka på bandet och försiktigt pressas ner för att återsäkra den. Vid transport av larver för injektion, är det bra att bära bilden i en petriskål i fall larverna blir lossnade. Stegen efter injektion kräver mest försiktighet för att undvika störningar av BBB. För att minimera risken för skador på provet, är det lättast att dissekera provet direkt på bilderna som kommer att användas för avbildning. Om larven starkt följs tejpen vid överföring av provet för dissektion, kan en droppe 1x PBS läggas till bandet för att lossa vidhäftning och för att möjliggöra överföring till bilden för dissektion. Efter dissektion, är det viktigt att platta provet tillräckligt för att undvika falskt positiva resultat, men inte så mycket att provet integritet äventyras. Sandwiching larven mellan täckglas och bilden med hjälp av extra täckglas som distanser hindrar hjärnan från att skadas, men immobilizes provet för effektiv avbildning.

För att uppnå framgång med protokoll för både embryon och larver är det viktigt att se till att injektions apparaten och konfokalmikroskopet ställs in innan prov bearbetningen påbörjas. Detta möjliggör exakt timing i bildtagning av prover, vilket är nödvändigt för prov jämförelse. Andra metoder har utnyttjat mer avancerade injektion set ups, kräver en inverterad Mikroskop inrättas för embryo injektion. Detta protokoll använder en standard dissekera Mikroskop och micromanipulator med en tryckregulator. I detta fall var en zebrafiskar injektion inrättas helt enkelt anpassad för injektion av flyga embryon och larver. Detta protokoll skulle kunna förenklas ytterligare för att använda en micromanipulator med en spruta för injektion också. Många av dessa verktyg är lätt tillgängliga i biologi avdelningar och kan även vara tillgängliga i klassrummet laboratorie inställningar, vilket möjliggör maximal enkel protokollimplementering.

Under avbildnings proceduren kan det vara bra att märka cellerna i nervsystemet för att lättare kunna identifiera den önskade regionen för avbildning. Specifikt kan man använda GAL4/UAS systemet för att uttrycka GFP i antingen neuroner eller glia, med hjälp av elav-GAL4 eller repo-GAL4 stammar, respektive(tabell 2)31,32,33. Sådan märkning skulle ge en kontrast till sulforodamin 101 Acid klorid dextran att visualisera integriteten i nervsystemet.

Medan denna metod är inriktad på testmetoder integriteten av BBB under utvecklingen av D. melanogaster, detta tillvägagångssätt kan anpassas för att undersöka integriteten hos andra hinder i en mängd olika organismer och vävnader. Till exempel, liknande protokoll har publicerats för testmetoder BBB i möss34. Dessutom, permeabilitet av blod-ögon barriären och den somatiska barriären kring könsceller under spermatogenes i D. melanogaster använda en liknande metod29,35. Protokollet kan också anpassas för användning i andra vävnader för att testa permeabilitet, även i tarmen. Vid anpassning av detta protokoll för användning i andra vävnader eller arter, kommer det att bli nödvändigt att beakta storleken på molekyler som kan tränga igenom barriären, eftersom det är möjligt att 10 kDa dextran kan vara tillräckligt liten för att genomtränga vissa hinder. Sammantaget ger detta protokoll ett steg-för-steg-förfarande för att assay för BBB integritet under D. melanogaster utveckling som lätt kan anpassas för användning i andra inställningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar Dr. F. Bryan Pickett och Dr Rodney Dale för användning av utrustning för injektion. Detta arbete finansierades genom forskningsfinansiering från Loyola University Chicago till MD, D.T., och J.J.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran ThermoFisher Scientific D1863 Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.
20 μL Gel-Loading Pipette Tips Eppendorf 22351656
100% Ethanol (200 proof) Pharmco-Aaper 11000200
Active Dry Yeast Red Star
Agar Fisher Scientific BP1423
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Air Compressor DeWalt D55140
Apple Juice Mott's Natural Apple Juice
Bleach Household Bleach 1-5% Hypochlorite
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Bottle Plugs Fisher Scientific AS-277
Cell Strainers BD Falcon 352350
Confocal Microscope Olympus FV1000 Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)
Cotton-Tipped Applicator Puritan 19-062614
Double-Sided Tape 1/2" Scotch
Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip Roboz RS-5015
Fly Food Bottles Fisher Scientific AS-355
Fly Food Vials Fisher Scientific AS-515
Foot Pedal Treadlite II T-91-S
Gel Caster Bio-Rad 1704422
Gel Tray Bio-Rad 1704436
Glass Pipette VWR 14673-010
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Granulated sugar Purchased from grocery store.
Halocarbon Oil Lab Scientific, Inc. FLY-7000
Light Source Schott Ace I
Manipulator Stand World Precision Instruments M10
Micromanipulator World Precision Instruments KITE-R
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Needle Holder World Precision Instruments MPH310
Nightsea Filter Sets Electron Microscopy Science SFA-LFS-CY For visualization of YFP
Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head Electron Microscopy Science SFA-RB For visualization of GFP
Paintbrush Simply Simmons Chisel Blender #6
Pipetter Fisher Scientific 13-683C
Pneumatic Pump World Precision Instruments PV830 This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Small Embryo Collection Cages Genesee Scientific 59-100
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Steel Base Plate World Precision Instruments 5052
Stereomicroscope Carl Zeiss Stemi 2000 Used for tissue dissection.
Stereomicroscope with transmitted light source Baytronix Used for injection.
Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) Genesee Scientific 20-258
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 Nonionic surfactant
Vial Plugs Fisher Scientific AS-273

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  2. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  3. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
  4. Hindle, S. J., Bainton, R. J. Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier. Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).
  5. Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
  6. Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
  7. Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
  8. Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
  9. Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
  10. von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
  11. Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
  12. Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
  13. Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
  14. Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
  15. Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
  16. Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
  17. Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
  18. von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
  19. Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
  20. Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
  21. Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
  22. DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
  23. BDSC Cornmeal Food. , Bloomington Drosophila Stock Center. Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017).
  24. Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).
  25. Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
  26. Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
  27. Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
  28. Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
  29. Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
  30. Love, C. R., Dauwalder, B. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. , Humana Press. New York, NY. 175-185 (2019).
  31. Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
  32. Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).
  33. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  34. Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
  35. Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).

Tags

Utvecklingsbiologi utgåva 151 Drosophila melanogaster blod-hjärnbarriären glia nervsystemet ventrala nerv sladden embryo larv
Analys för blod-hjärnbarriären integritet i <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J.… More

Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J. Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e60233, doi:10.3791/60233 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter