Summary
Beskrevet er en protokol til udførelse af intratracheal transplantation af mesenkymale stromale celler (MSC' er) gennem intratracheal injektion i term neonatal rotter. Denne teknik er en klinisk levedygtig mulighed for levering af stamceller og lægemidler til neonatal rotte lunger til at vurdere deres effektivitet.
Abstract
Langvarig udsættelse for høje koncentrationer af ilt fører til betændelse og akut lungeskade, hvilket svarer til human bronkopulmonal dysplasi (BPD). Hos for tidligt fødte spædbørn, BPD er en stor komplikation trods tidlig brug af overfladeaktive terapi, optimal ventilation strategier, og noninvasive positivt tryk ventilation. Fordi lungebetændelse spiller en afgørende rolle i patogenesen af BPD, kortikosteroid brug er en potentiel behandling for at forhindre det. Ikke desto mindre anbefales systemisk kortikosteroidbehandling normalt ikke til præmature spædbørn på grund af langvarige bivirkninger. Prækliniske undersøgelser og kliniske forsøg med fase I på mennesker viste, at det er sikkert og muligt at anvende mesenkymale stromale celler (MSC) i hyperoxi-inducerede lungeskader og hos præmature spædbørn. Intratracheal og intravenøs MSC-transplantation har vist sig at beskytte mod neonatal hyperoxisk lungeskade. Derfor har intratracheal administration af stamceller og kombineret overfladeaktiv behandling og glukokortikoide behandling vist sig som en ny strategi til behandling af nyfødte med luftvejssygdomme. Den udviklingsfase af rottelunger ved fødslen svarer til den i humane lunger ved 26-28 uge svangerskab. Derfor er nyfødte rotter egnede til at studere intratracheal administration til præmature spædbørn med åndedrætsbesvær for at vurdere dens virkning. Denne intratracheal instillation teknik er en klinisk levedygtig mulighed for levering af stamceller og lægemidler i lungerne.
Introduction
Supplerende ilt er ofte nødvendig for at behandle nyfødte spædbørn med åndedrætsbesvær1. Hyperoxiabehandling hos spædbørn har dog negative langtidsvirkninger. Langvarig udsættelse for høje koncentrationer af ilt fører til betændelse og akut lungeskade, hvilket svarer til human bronkopulmonal dysplasi (BPD)2. BPD er en stor komplikation af hyperoxibehandling, der kan opstå på trods af tidlig overfladeaktiv behandling, optimale ventilationsprocedurer og øget brug af noninvasive positivt trykventilation hos for tidligt fødte spædbørn. Mens mange behandlingsstrategier er blevet rapporteret for BPD3,ingen kendt behandling kan reducere denne komplikation.
Kortikosteroid brug er en potentiel behandling for at forhindre BPD, fordi pulmonal inflammation spiller en afgørende rolle i sin patogenese. Systemisk kortikosteroidbehandling anbefales dog normalt ikke til præmature spædbørn på grund af langvarige bivirkninger4,5.
Mesenkymale stromale celler (MSC' er) har pluripotente egenskaber og kan differentiere sig i forskellige celletyper, herunder knogle, brusk, fedtvæv, muskel og sener6. Mscs har immunmodulerende, anti-inflammatoriske, og regenerative effekter7, og dyreforsøg viser de terapeutiske fordele af MSC'er og deres udskilles komponenter i hyperoxia-induceret lungeskade i gnavere8,9. Intratracheal og intravenøs MSC-transplantation har vist sig at beskytte mod neonatal hyperoxisk lungeskade. Derfor kan intratrakcheal administration af stamceller og kombineret overfladeaktiv behandling og kortikosteroidbehandling være en potentiel behandlingsstrategi til behandling af nyfødte med luftvejssygdomme. Prækliniske undersøgelser har anvendt intratrakcheal administration af stamceller og adenorelateret virus hosnyfødte rotter 10,,11,12. Der foreligger dog ikke en trinvis præsentation af teknikken og in vivo-sporing af de transplanterede stamceller. Den nyfødte rotte er egnet til at undersøge virkningerne af intratrakcheal administration på præmature spædbørn med åndedrætsbesvær, fordi den sackulære fase af rottelungen ved fødslen svarer til virkningen af den menneskelige lunge ved 26-28 ugers drægtighed13. En effektiv metode til administration i rotte luftrøret er afgørende for en vellykket lungefordeling. Den teknik, der præsenteres her giver mulighed for undersøgelse af intratracheal administration af celler og / eller lægemidler til behandling af neonatal lungesygdomme ved hjælp af rotter som en model for mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne procedure blev godkendt af Animal Care and Use Committee på Taipei Medical University.
BEMÆRK: Human MSC stabilt transced med grønne fluorescerende protein (GFP) og firefly luciferase gener (Fluc) blev fremstillet af en kommerciel virksomhed (Tabel over Materialer).
1. Karakterisering af humane MSC'er med firefly luciferase og grønt fluorescerende protein
- Bevar humane MSC'er, der er transsmittede med gfp og fluc i komplette medier (minimum væsentlig medium eagle-alpha modifikation [αMEM], suppleret med 10−15% føtalt kvægserum [FBS], 2 mM L-glutamin, 1 ng/lL grundlæggende FGF og PSF) ved 37 °C med mættet luftfugtighed og 5% CO2. Passage celler ved ~ 70−90% sammenløb.
- Msc'er overholdes under et fluorescensfasekontrastmikroskop (figur 1A) , og udtryksniveauet for Fluc og GFP14.
- Karakterisere MSC'erne ved at analysere ekspressionen af cd-mærker, herunder CD44, CD73, CD90, CD105 ved hjælp af flowcytometri (Figur 1B). Fremkalde trilineage differentiering af stamceller til adipocytter, chondrocytter, og osteocytter, og bekræfte trilineage differentiering (Figur 1C) af von Kossa, olie rød O, og Alcian blå farvning efter en kommerciel protokol15,16.
2. Anesthetization af rotte unger
- Tillad tid-dateret gravid Sprague-Dawley rotter til at levere vaginalt på sigt.
- Fjern rottehvalperne fra buret på postnatal dag 5.
- Bedøvelse rotte hvalpe ved hjælp af gas anæstesi (dvs. 2% isofluran) i en anæstesi kammer.
- Bekræft tilstrækkelig anæstesi ved at kontrollere vejrtrækning og reflekser.
BEMÆRK: Vejrtrækningen skal blive overfladisk, og reflekser bør aftage. Rotteunger forbliver bevidstløse i mindst ~10 min. med denne isoflurankoncentration.
3. Intratracheal instillation
- Når først anesthetized, fastholde den rotte pups oven på en intubation bengt beredning besænkde oven på ~ 60° og hold pups på plads hos laboratorium mærke tape oven på al fire lemmer.
- Påfør tape under næsen for at fastsætte hovedet og lokalisere halsen for punktering tracheotomi.
- Desinficer snitområdet (dvs. hals) med en 75% alkohol prep pad.
- Lav en 0,3 cm lodret midterlinjen hals snit over luftrøret med mikrostører for at undgå at beskadige halspulsårerne.
- Dissekere fedt og muskel lag væk for at finde luftrøret med buet spids tilspidset pincet uden en krog.
- Hold luftrøret med den buede spids tilspidset pincet.
- Hold en 100 μL sprøjte oprejst og indsprøjt langsomt 30 μL normal saltvand (dvs. kontrol) eller 30 μL Fluc-GFP mærket MSC 'er (1 x 105 celler) i luftrøret gennem en 30 G kanylesprøjte under inspiratorisk fase.
- Luk snittet med en 6-0 silkesøm, binde knuden så lille som muligt, og skær enderne så korte som muligt.
- Placer rotterne under infrarødt lys eller på en varmepude for at holde varmen og lad dem komme sig efter anæstesi.
- Bekræft rotterne er varme, lyserøde og i stand til spontan bevægelse, før rotterne returneres til buret.
4. Overvågning af lungefordelingen af MC'er
- For at spore de transplanterede humane MSC'er injiceres rotterne intraperitonealt med luciferinkaliumsalt i fosfatbufferet saltvand (PBS) med en dosis på 125 mg/kg kropsvægt 15 min efter MSC-injektion.
- Anesthetize rotterne ved hjælp af 2% isofluran gennem næse kegler.
- Ansk anskaffe sekventielle billeder med 5-15 s intervaller 10 min efter luciferin administration med medium binning, 1 f / stop, og en 26 cm synsfelt ved hjælp af et lille dyr billeddannelse system ( Tabel overMaterialer).
- Kvantificer luminescensaktiviteten fra lungerne baseret på de automatiske interesseområder ved hjælp af billedbehandlingssoftware (Materialetabel)17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den lungedetiske fordeling af intratracheal instillation af stamceller i udtrykket neonatal rotter blev bestemt af firefly luciferase (Fluc)-mærket stamceller. Mscs blev mærket med Fluc og mærket med grøn fluorescerende protein gennem lentiviral transduction. Figur 1A viser et højt niveau af gfp-udtryk i humane MSC'er, og 93,7 % af befolkningen viste, at gfp-positivt udtryk blev påvist ved flowcytometri. MSC'erne var karakteriseret ved at analysere udtrykket af cd-markører (f.eks. CD 44, CD73, CD90 og CD105) og muligheden for trelineringsdifferentiering til osteocytter, chondrocytter og adipocytter (Figur 1B, C). For at spore de transplanterede humane MSC'er in vivo blev der udført luminescensbilleddannelse af rotterne ved hjælp af et billeddannelsessystem med små dyr. Målingerne blev taget ventrally. Rotterne blev fastgjort med tape, og efterfølgende blev der givet en intraperitoneal injektion af 30 mg/ml luciferin kaliumsalt i PBS i en dosis på 125 mg/kg kropsvægt. Luciferase kombinerer med luciferin, ilt og ATP, og genererer lys gennem en kemisk reaktion, hvilket resulterer i bioluminescens18. Under billeddannelse procedure, rotterne blev anesthetized ved hjælp af 2% isofluran administreres gennem næse kegler. Rotte billeder blev erhvervet 10 min efter luciferin administration. Sekventielle billeder blev anskaffet med 5-15 s intervaller (ingen tidsforsinkelse) i mindst 1 min, med medium binning, 1 f / stop, og en 26 cm synsfelt. Ved hjælp af måledata fra en sekvens af spektrale billeder filtreret ved forskellige bølgelængder (560-660 nm) blev dybden og placeringen af den bioluminescerende reporter bestemt. Luminescenssignaler fra lungerne blev beregnet på grundlag af de automatiske interesseområder i cirkelvalgstilstanden. Den gennemsnitlige luminescensintensitet hos normale saltvandsbehandlede dyr blev tildelt en værdi på én, og data for hvert MSC-behandlede dyr blev normaliseret til normale saltvandsbehandlede dyrs.
Figur 2A viser et repræsentativt billede af luminescens i rottelungerne. Der blev ikke observeret luminescens i lungeområderne hos rotter behandlet med normal saltvand. Rotterne behandlet med MSC'er udviste luminescens i luftrøret og de centrale lungeområder. Kvantificeringen af luminescensintensiteten viste, at rotter behandlet med MSC'er udviste en ca. 13 gange større stigning i luminescensaktiviteten sammenlignet med rotter behandlet med normalt saltvand alene (figur 2B).
Figur 1: Karakterisering af humane MSC'er.
(A) GFP-udtryk i humane MSC'er efter eF-transduktion af lentivirus. ( B) Udtryk for humane MSC-specifikke cd-markører (dvs. CD 44, CD73, CD90, CD105). (C) Trilineage differentiering af menneskelige MSCs. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Overvågning af lungefordelingen af luminescens ved hjælp af et billeddannelsessystem med små dyr.
(A) Et repræsentativt billede af lungefordelingen af de mærkede MSC'er hos rotter. Der blev ikke observeret luminescens i lungeområdet hos rotter behandlet med normal saltvand. Rotter behandlet med humane MSC'er udviste luminescens i trakeal- og lungeområderne. (B) Kvantificering af luminescensaktivitet i rottelungerne (n = 4). Fejllinjerne repræsenterer standardafvigelsen. Skalaen er fotoner/s/cm2/sr i Y-aksen. **P < 0.01. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nyfødte spædbørn med åndedrætsbesvær kræver almindeligvis intratracheal overfladeaktivt stof og/eller kortikosteroidbehandling19. Kliniske forsøg med fase I hos mennesker har vist sikkerheden ved intratracheal MSC hos præmature spædbørn8. Disse undersøgelser tyder på, at intratrakcheal administration af lægemidler er en vigtig mulighed for nyfødte spædbørn med åndedrætsbesvær. Dyremodel undersøgelser er mest nyttige, hvis modellen funktioner er direkte relevante for mennesker. Term nyfødte rotter er nyttige modeller for præmature lungeskade og udvikling undersøgelser. Den øvre luftvej hos neonatale rotter er dog for lille til at tillade direkte luftrørsintubation som udført hos voksne rotter20. Intratracheal instillation gennem tracheotomi er en mulig alternativ teknik til intratrakeal administration af stamceller eller lægemidler til neonatal rotte lunger.
In vivo-bioluminescensbilleddannelse er et værdifuldt værktøj til in vitro- og in vivo-overvågning af den transplanterede stamcelles skæbne, udført ved at mærke celler med det konstituerende udtryk for et luciferase-reporterprotein21. Luciferase enzymer katalys oxidation af et substrat (luciferin), og frigive lys som et produkt af reaktionen. Visuel billeddannelse gennem bioluminescens giver mulighed for en noninvasive og real-time analyse af sygdomsprocesser i levende organismer. Bioluminescensscanning blev anvendt til in vivo-overvågning af migration, overlevelse og morfologisk differentiering afMSC'erne 22. Denne undersøgelse evaluerede fordelingen af de transplanterede stamceller i lungerne ved hjælp af et in vivo-billeddannelsessystem. In vivo bioluminescens imaging er afhængig af overvågning af celle-indeholdte partikler. Fordi disse kan være fagocytosed ved celledød, kan det føre til sporing af vært makrofager. Luminescens blev derfor målt mindre end 10 min. efter administration af luciferin.
Begrænsningen af denne undersøgelse er, at interanimal variation blev opfattet i IVIS billeder. Luminescenssignalerne fra lungerne blev derfor beregnet på grundlag af de automatiske interesseområder og normaliserede den gennemsnitlige luminescensintensitet til en i normale saltvandsbehandlede dyr.
Korrekt og effektiv intratrakeal instillation er afgørende for vurderingen af MSC-effekten hos neonatalrotter, men det kan også være nyttigt til test af andre medicinske behandlinger. Derfor kan denne rotte model teknik kan justeres til en række lungeapplikationer. Intratrakeal instillation af stamceller eller medicin udgør en forholdsvis nem og omkostningseffektiv behandling af lungesygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev delvis støttet af et tilskud fra Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan (A-109-008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 silk | Ethicon | 1916G | |
| Alcohol Prep Pad | CSD | 3032 | |
| BD Stemflow hMSC Analysis Kit | BD Biosciences | 562245 | CD markers |
| CMV-Luciferase-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging | SBI | BLIV511PA-1 | |
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| Human MSCs | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan | ||
| Infrared light | JING SHANG | JS300T | |
| Isoflurane | Halocarbon | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 small animal imaging system | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Luciferin potassium salt | Promega, Madison, WI | ||
| Micro-scissors, straight | Vannas | H4240 | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Isotonic Sodium Chloride Solution |
| Small Hub RN Needle, 30 gauge | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Syringe (100 µl) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
References
- Ramanathan, R., Bhatia, J. J., Sekar, K., Ernst, F. R. Mortality in preterm infants with respiratory distress syndrome treated with poractant alfa, calfactant or beractant: a retrospective study. Journal of Perinatology. 33, 119-125 (2013).
- Gien, J., Kinsella, J. P. Pathogenesis and treatment of bronchopulmonary dysplasia. Current Opinion in Pediatrics. 23, 305-313 (2011).
- Pasha, A. B., Chen, X. Q., Zhou, G. P. Bronchopulmonary dysplasia: Pathogenesis and treatment. Experimental and Therapeutic. 16, 4315-4321 (2018).
- Committee on Fetus and Newborn. Postnatal corticosteroids to treat or prevent chronic lung disease in preterm infants. Pediatrics. 109, 330-338 (2002).
- Watterberg, K. L. American Academy of Pediatrics; Committee on Fetus and Newborn. Policy statement-postnatal corticosteroids to prevent or treat bronchopulmonary dysplasia. Pediatrics. 126, 800-808 (2010).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)- dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (2), 42-49 (2009).
- Chou, H. C., Li, Y. T., Chen, C. M. Human mesenchymal stem cells attenuate experimental bronchopulmonary dysplasia induced by perinatal inflammation and hyperoxia. American Journal of Translational Research. 8, 342-353 (2016).
- Chen, C. M., Chou, H. C., Lin, W., Tseng, C. Surfactant effects on the viability and function of human mesenchymal stem cells: in vitro and in vivo assessment. Stem Cell Research & Therapy. 8, 180 (2017).
- Kim, Y. E., et al. Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats. Pediatric Research. 80, 415-424 (2016).
- Fleurence, E., et al. Comparative efficacy of intratracheal adeno-associated virus administration to newborn rats. Human Gene Therapy. 16, 1298-1306 (2005).
- Waszak, P., et al. Effect of intratracheal adenoviral vector administration on lung development in newborn rats. Human Gene Therapy. 13, 1873-1885 (2002).
- O'Reilly, M., Thébaud, B. Animal models of bronchopulmonary dysplasia. The term rat models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307, 948 (2014).
- Yu, J., et al. GFP labeling and hepatic differentiation potential of human placenta-derived mesenchymal stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 35, 2299-2308 (2015).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Zhang, Z. Y., et al. Superior osteogenic capacity for bone tissue engineering of fetal compared with perinatal and adult mesenchymal stem cells. Stem Cells. 27, 126-137 (2009).
- Huang, L. T., et al. Effect of surfactant and budesonide on pulmonary distribution of fluorescent dye in mice. Pediatric and Neonatology. 56, 19-24 (2015).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18, 164-172 (2012).
- Yeh, T. F., et al. Intra-tracheal administration of budesonide/surfactant to prevent bronchopulmonary dysplasia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193, 86-95 (2016).
- Nguyen, J. Q., et al. Intratracheal inoculation of Fischer 344 rats with Francisella tularensis. Journal of Visualized Experiments. (127), e56123 (2017).
- de Almeida, P. E., van Rappard, J. R., Wu, J. C. In vivo bioluminescence for tracking cell fate and function. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 663-671 (2011).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49, 3-10 (2011).
