Summary
Described ist ein Protokoll zur Durchführung einer intratrachealen Transplantation von mesenchymalen Stromalzellen (MSCs) durch intratracheale Injektion bei neonatalen Ratten. Diese Technik ist eine klinisch praktikable Option für die Abgabe von Stammzellen und Medikamenten in die Lungen der neonatalen Ratte, um ihre Wirksamkeit zu bewerten.
Abstract
Eine längere Exposition gegenüber hohen Sauerstoffkonzentrationen führt zu Entzündungen und akuten Lungenverletzungen, die der menschlichen Bronchopulmonaldysplasie (BPD) ähneln. Bei Frühgeborenen ist BPD eine hauptverkomplikation trotz des frühen Einsatzes von Tensidtherapie, optimalen Beatmungsstrategien und nichtinvasiver Positivdruckbelüftung. Da Lungenentzündung spielt eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von BPD, Kortikosteroid Verwendung ist eine mögliche Behandlung, um es zu verhindern. Dennoch, systemische Kortikosteroid Behandlung wird in der Regel nicht für Frühgeborene aufgrund langfristiger Nebenwirkungen empfohlen. Präklinische Studien und klinische Studien der Phase I zeigten, dass die Anwendung von mesenchymalen stromalen Zellen (MSCs) bei hyperoxiainduzierten Lungenverletzungen und bei Frühgeborenen sicher und machbar ist. Intratracheale und intravenöse MSC-Transplantation schützt nachweislich vor neonatalen hyperoxischen Lungenverletzungen. Daher hat sich die intratracheale Verabreichung von Stammzellen und kombinierte Tensid- und Glukokortikoidbehandlung als eine neue Strategie zur Behandlung von Neugeborenen mit Atemwegserkrankungen herauskristallisiert. Das Entwicklungsstadium der Rattenlunge bei der Geburt entspricht dem in der menschlichen Lunge bei der 26-28-Wöchigen Schwangerschaft. Daher sind neugeborene Ratten geeignet, um die intratracheale Verabreichung an Frühgeborene mit Atemnot zu untersuchen, um ihre Wirksamkeit zu bewerten. Diese intratracheale Instillationstechnik ist eine klinisch praktikable Option für die Abgabe von Stammzellen und Medikamenten in die Lunge.
Introduction
Zusätzliche Sauerstoff ist oft erforderlich, um Neugeborene mit Atemnot zu behandeln1. Jedoch, Hyperoxia-Therapie bei Säuglingen hat negative langzeitige Auswirkungen. Längere Exposition gegenüber hohen Sauerstoffkonzentrationen führt zu Entzündungen und akuten Lungenverletzungen, die der menschlichen Bronchopulmonaldysplasie (BPD)2ähneln. BPD ist eine hauptverkompliktige Hyperoxia-Behandlung, die trotz früher Tensidtherapie, optimaler Beatmungsverfahren und vermehrter Anwendung nichtinvasiver Positivdruckbeatmung bei Frühgeborenen auftreten kann. Während viele Behandlungsstrategien für BPD3berichtet wurden, kann keine bekannte Therapie diese Komplikation reduzieren.
Kortikosteroid-Einsatz ist eine mögliche Behandlung, um BPD zu verhindern, weil Lungenentzündung spielt eine entscheidende Rolle bei seiner Pathogenese. Jedoch, systemische Kortikosteroid-Therapie wird in der Regel nicht für Frühgeborene aufgrund von langfristigen Nebenwirkungen empfohlen4,5.
Mesenchymale Stromalzellen (MSCs) haben pluripotente Eigenschaften und können sich in verschiedene Zelltypen differenzieren, einschließlich Knochen, Knorpel, Fettgewebe, Muskel und Sehnen6. MSCs haben immunmodulatorische, entzündungshemmende und regenerative Effekte7, und Tierstudien zeigen die therapeutischen Vorteile von MSCs und ihren sezernierten Komponenten bei Hyperoxia-induzierten Lungenverletzungen bei Nagetieren8,9. Intratracheale und intravenöse MSC-Transplantation schützt nachweislich vor neonatalen hyperoxischen Lungenverletzungen. Daher könnte die intratracheale Verabreichung von Stammzellen und eine kombinierte Tensid- und Kortikosteroidtherapie eine potenzielle Behandlungsstrategie zur Behandlung von Neugeborenen mit Atemwegserkrankungen sein. Präklinische Studien haben die intratracheale Verabreichung von Stammzellen und Adeno-assoziierten Viren bei neugeborenen Ratten10,11,12verwendet. Eine schrittweise Darstellung der Technik und in vivo-Tracking der transplantierten Stammzellen ist jedoch nicht verfügbar. Die neugeborene Ratte eignet sich für die Untersuchung der Auswirkungen der intratrachealen Verabreichung auf Frühgeborene mit Atemnot, da das sakkare Stadium der Rattenlunge bei der Geburt dem der menschlichen Lunge bei 26-28 Wochen Trächtigkeitentspricht. Eine wirksame Methode zur Verabreichung in die Rattentracheistin ist entscheidend für eine erfolgreiche Lungenverteilung. Die hier vorgestellte Technik ermöglicht die Untersuchung der intratrachealen Verabreichung von Zellen und/oder Medikamenten zur Behandlung von neonatalen Lungenerkrankungen unter Verwendung von Ratten als Modell für den Menschen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dieses Verfahren wurde vom Animal Care and Use Committee der Taipei Medical University genehmigt.
HINWEIS: Menschliche MSCs, die stabil mit grünem fluoreszierendem Protein (GFP) und Galgengifengen (Fluc) transfiziert wurden, wurden von einem kommerziellen Unternehmen(Tabelle der Materialien)gewonnen.
1. Charakterisierung menschlicher MSCs mit Gelfeluzifase und grünem fluoreszierendem Protein
- Bewahren Sie menschliche MSCs, die mit GFP und Fluc transfiziert sind, in vollständigen Medien (minimale wesentliche mittlere Adler-Alpha-Modifikation [MEM], ergänzt mit 10 bis 15 % fetalem Rinderserum [FBS], 2 mM L-Glutamin, 1 ng/ml Basis-FGF und PSF) bei 37 °C mit gesättigter Feuchtigkeit und 5 %CO2. Durchgangszellen bei einem Zusammenfluss von 70 bis 90 %.
- Beobachten Sie MSCs unter einem Fluoreszenzphasenkontrastmikroskop (Abbildung 1A) und analysieren Sie die Expressionswerte von Fluc und GFP14.
- Charakterisieren Sie die MSCs, indem Sie den Ausdruck von CD-Markern einschließlich CD44, CD73, CD90, CD105 mithilfe der Durchflusszytometrie analysieren (Abbildung 1B). Induzieren Trilineage Differenzierung von Stammzellen zu Adipozyten, Chondrozyten, und Osteozyten, und bestätigen Trilineage Differenzierung (Abbildung 1C) von Von Kossa, Öl rot O, und Alcian blaue Färbung nach einem kommerziellen Protokoll15,16.
2. Anästhesisierung von Rattenwelpen
- Lassen Sie zeitlich datierte schwangere Sprague-Dawley-Ratten vaginal zu liefern.
- Entfernen Sie die Rattenwelpen am postnatalen Tag 5 aus dem Käfig.
- Anästhetisieren Sie die Rattenwelpen mit Gasanästhesie (d.h. 2% Isofluran) in einer Anästhesiekammer.
- Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesie, indem Sie Atmung und Reflexe überprüfen.
HINWEIS: Die Atmung sollte flach werden und die Reflexe sollten abnehmen. Rattenwelpen bleiben mit dieser Isofluran-Konzentration mindestens 10 min unbewusst.
3. Intratracheale Instillation
- Nach der Beägung die Rattenwelpen auf einem intubationsständer von 60° anwinkelt zurückhalten und Welpen mit Labor-Etikettierungsband an allen vier Gliedmaßen an Ort und Stelle halten.
- Tragen Sie Klebeband unter der Nase auf, um den Kopf zu fixieren und den Hals für punktionstracheotomie zu lokalisieren.
- Desinfizieren Sie den Schnittbereich (d.h. Hals) mit einem 75% Alkohol-Prep-Pad.
- Machen Sie einen 0,3 cm vertikalen Mittellinienausschnitt über der Luftröhre mit Mikroschere, um eine Beschädigung der Karotisarterien zu vermeiden.
- Sezieren Sie die Fett- und Muskelschichten weg, um die Luftröhre mit gekrümmter Spitze verjüngte Pinzette ohne Haken zu lokalisieren.
- Halten Sie die Luftröhre mit der gekrümmten Spitze verjüngte Pinzette.
- Halten Sie eine 100-L-Spritze aufrecht und injizieren Sie während der Inspiratorei-Phase langsam 30 l normaler Saline (d. h. Kontrolle) oder 30 l Fluc-GFP-markierte MSCs (1 x 105 Zellen) in die Luftröhre.
- Schließen Sie den Schnitt mit einem 6-0 Seidenstich, binden Sie den Knoten so klein wie möglich und schneiden Sie die Enden so kurz wie möglich.
- Stellen Sie die Ratten unter Infrarotlicht oder auf ein Heizkissen, um warm zu halten und sie von der Anästhesie erholen zu lassen.
- Bestätigen Sie, dass die Ratten warm, rosa und in der Lage sind, sich spontan zu bewegen, bevor sie die Ratten in den Käfig zurückbringen.
4. Überwachung der Lungenverteilung von MsCs
- Um die transplantierten menschlichen MSCs zu verfolgen, injizieren sie die Ratten intraperitoneal mit Luziferin-Kaliumsalz in Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einer Dosis von 125 mg/kg Körpergewicht 15 min nach MSC-Injektion.
- Anästhesisieren Sie die Ratten mit 2% Isofluran durch Nasenkegel.
- Erfassen Sie sequenzielle Bilder in 5-15 s Intervallen 10 min nach der Luciferin-Verabreichung mit mittlerem Binning, 1 f/stop und einem 26 cm Sichtfeld mit einem Kleintier-Bildgebungssystem(Tabelle der Materialien).
- Quantifizieren Sie die Lumineszenzaktivität aus der Lunge basierend auf den automatischen Regionen von Interesse mit Bildgebungssoftware (Tabelle der Materialien)17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die pulmonale Verteilung der intratrachealen Instillation von Stammzellen im Begriff neonatale Ratten wurde durch Gunfly-Luziferase (Fluc)-markierte Stammzellen bestimmt. MSCs wurden mit Fluc gekennzeichnet und durch lentivirale Transduktion mit grünem fluoreszierendem Protein markiert. Abbildung 1A zeigt einen hohen GFP-Ausdruck in menschlichen MSCs, und 93,7 % der Bevölkerung zeigten eine GFP-positive Expression, die durch Durchflusszytometrie erkannt wurde. MSCs waren gekennzeichnet durch die Analyse der Expression von CD-Markern (d. h. CD 44, CD73, CD90 und CD105) und die Fähigkeit der Trilineage-Differenzierung in Osteozyten, Chondrozyten und Adipozyten(Abbildung 1B,C). Um die transplantierten menschlichen MSCs in vivo zu verfolgen, wurde die Lumineszenz-Bildgebung der Ratten mit einem Kleintier-Bildgebungssystem durchgeführt. Die Messungen wurden ventral durchgeführt. Die Ratten wurden mit Klebeband fixiert und anschließend eine intraperitoneale Injektion von 30 mg/ml Luziferin-Kaliumsalz in PBS in einer Dosis von 125 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Luziferase kombiniert mit Luziferin, Sauerstoff, und ATP, und erzeugt Licht durch eine chemische Reaktion, was zu Biolumineszenz18. Während des bildgebenden Verfahrens wurden die Ratten mit 2% Isofluran, das durch Nasenkegel verabreicht wurde, anästhesiert. Rattenbilder wurden 10 min nach der Verabreichung von Luziferin aufgenommen. Sequenzielle Bilder wurden in 5-15 s Intervallen (keine Zeitverzögerung) für mindestens 1 min, mit mittlerem Binning, 1 f/Stop und einem 26 cm Sichtfeld, aufgenommen. Anhand von Messdaten aus einer Sequenz von Spektralbildern, die mit unterschiedlichen Wellenlängen (560–660 nm) gefiltert wurden, wurde die Tiefe und Lage des biolumineszierenden Reporters bestimmt. Lumineszenzsignale aus der Lunge wurden auf DerGrundlage der automatischen Interessenbereiche im Kreisauswahlmodus berechnet. Der durchschnittlichen Lumineszenzintensität bei normalen, mit Saline behandelten Tieren wurde ein Wert von einem zugewiesen, und die Daten für jedes mit MSC behandelte Tier wurden auf die von normalen, mit Saline behandelten Tieren normalisiert.
Abbildung 2A zeigt ein repräsentatives Bild der Lumineszenz in der Lunge der Ratte. In den Lungenregionen der mit normaler Saline behandelten Ratten wurde keine Lumineszenz beobachtet. Die mit MSCs behandelten Ratten zeigten Lumineszenz in den Luftröhre- und zentralen Lungenregionen. Die Quantifizierung der Lumineszenzintensität ergab, dass die mit MSCs behandelten Ratten eine etwa 13-fache Zunahme der Lumineszenzaktivität zeigten, verglichen mit den Ratten, die allein mit normaler Kochinbehandlung behandelt wurden(Abbildung 2B).
Abbildung 1: Charakterisierung menschlicher MSCs.
(A) GFP-Expression in humanen MSCs nach Lentivirus-Transduktion. (B) Ausdruck menschlicher MSC-spezifischer CD-Marker (d. h. CD 44, CD73, CD90, CD105). (C) Trilineage Differenzierung von menschlichen MSCs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Überwachung der Lungenverteilung der Lumineszenz mit einem Kleintier-Bildgebungssystem.
(A) Ein repräsentatives Bild der Lungenverteilung der beschrifteten MSCs bei Ratten. Im Lungenbereich von Ratten, die mit normaler Saline behandelt wurden, wurde keine Lumineszenz beobachtet. Ratten, die mit menschlichen MSCs behandelt wurden, zeigten Lumineszenz in den Luftröhren- und Lungenregionen. (B) Quantifizierung der Lumineszenzaktivität in der Rattenlunge (n = 4). Die Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung dar. Die Skala ist Photonen/s/cm2/sr in Y-Achse. P < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neugeborene mit Atemnot benötigen häufig intratracheales Tensid und/oder Kortikosteroidbehandlung19. Klinische Studien der Phase I der menschlichen Phase i haben die8Sicherheit von intratrachealen MSCs bei Frühgeborenen 8 gezeigt. Diese Studien deuten darauf hin, dass die intratracheale Verabreichung von Medikamenten eine wichtige Option für Neugeborene mit Atemnot ist. Tiermodellstudien sind am hilfreichsten, wenn die Modellfunktionen direkt für den Menschen relevant sind. Begriff Neugeborene Nratten sind nützliche Modelle für präterm Lungenverletzungen und Entwicklungsstudien. Allerdings ist die obere Atemwege von neonatalen Ratten zu klein, um eine direkte Trachealintubation zu ermöglichen, wie sie bei erwachsenen Ratten durchgeführt wird20. Die intratracheale Instillation durch Tracheotomie ist eine praktikable alternative Technik zur intratrachealen Verabreichung von Stammzellen oder Medikamenten in die lungene neonatale Ratte.
In vivo Biolumineszenz-Bildgebung ist ein wertvolles Werkzeug zur In-vitro- und In-vivo-Überwachung des Schicksals der transplantierten Stammzelle, die durch die Kennzeichnung von Zellen mit der konstitutiven Expression eines Luziferase-Reporterproteins21erreicht wird. Luziferase-Enzyme katalysieren die Oxidation eines Substrats (Luciferin) und geben Licht als Produkt der Reaktion frei. Die visuelle Bildgebung durch Biolumineszenz ermöglicht eine nichtinvasive und Echtzeitanalyse von Krankheitsprozessen in lebenden Organismen. Die Biolumineszenz-Bildgebung wurde zur In-vivo-Überwachung der Migration, des Überlebens und der morphologischen Differenzierung der MSCs22verwendet. Diese Studie bewertete die Verteilung der transplantierten Stammzellen in der Lunge mit einem In-vivo-Bildgebungssystem. Die In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung beruht auf der Überwachung zellenthaltener Partikel. Da diese nach dem Zelltod phagozytosiert sein können, könnte es zur Verfolgung von Host-Makrophagen führen. Daher wurde die Lumineszenz weniger als 10 min nach der Verabreichung von Luziferin gemessen.
Die Einschränkung dieser Studie besteht darin, dass die interanimale Variation in den IVIS-Bildern wahrgenommen wurde. Daher wurden die Lumineszenzsignale aus der Lunge auf der Grundlage der automatischen Interessengebiete berechnet und normalisiert die durchschnittliche Lumineszenzintensität auf eins bei normalen, mit Strandlinien behandelten Tieren.
Korrekte und wirksame intratracheale Instillation ist wichtig für die Bewertung der MSC-Wirksamkeit bei neonatalen Ratten, aber es kann auch für die Prüfung anderer medizinischer Behandlungen nützlich sein. Daher kann diese Rattenmodelltechnik auf eine Vielzahl von Lungenanwendungen einstellbar sein. Die intratracheale Instillation von Stammzellen oder Arzneimitteln stellt eine relativ einfache und kostengünstige Behandlung von Lungenerkrankungen dar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde teilweise durch ein Stipendium der Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan (A-109-008) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 silk | Ethicon | 1916G | |
| Alcohol Prep Pad | CSD | 3032 | |
| BD Stemflow hMSC Analysis Kit | BD Biosciences | 562245 | CD markers |
| CMV-Luciferase-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging | SBI | BLIV511PA-1 | |
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| Human MSCs | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan | ||
| Infrared light | JING SHANG | JS300T | |
| Isoflurane | Halocarbon | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 small animal imaging system | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Luciferin potassium salt | Promega, Madison, WI | ||
| Micro-scissors, straight | Vannas | H4240 | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Isotonic Sodium Chloride Solution |
| Small Hub RN Needle, 30 gauge | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Syringe (100 µl) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
References
- Ramanathan, R., Bhatia, J. J., Sekar, K., Ernst, F. R. Mortality in preterm infants with respiratory distress syndrome treated with poractant alfa, calfactant or beractant: a retrospective study. Journal of Perinatology. 33, 119-125 (2013).
- Gien, J., Kinsella, J. P. Pathogenesis and treatment of bronchopulmonary dysplasia. Current Opinion in Pediatrics. 23, 305-313 (2011).
- Pasha, A. B., Chen, X. Q., Zhou, G. P. Bronchopulmonary dysplasia: Pathogenesis and treatment. Experimental and Therapeutic. 16, 4315-4321 (2018).
- Committee on Fetus and Newborn. Postnatal corticosteroids to treat or prevent chronic lung disease in preterm infants. Pediatrics. 109, 330-338 (2002).
- Watterberg, K. L. American Academy of Pediatrics; Committee on Fetus and Newborn. Policy statement-postnatal corticosteroids to prevent or treat bronchopulmonary dysplasia. Pediatrics. 126, 800-808 (2010).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)- dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (2), 42-49 (2009).
- Chou, H. C., Li, Y. T., Chen, C. M. Human mesenchymal stem cells attenuate experimental bronchopulmonary dysplasia induced by perinatal inflammation and hyperoxia. American Journal of Translational Research. 8, 342-353 (2016).
- Chen, C. M., Chou, H. C., Lin, W., Tseng, C. Surfactant effects on the viability and function of human mesenchymal stem cells: in vitro and in vivo assessment. Stem Cell Research & Therapy. 8, 180 (2017).
- Kim, Y. E., et al. Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats. Pediatric Research. 80, 415-424 (2016).
- Fleurence, E., et al. Comparative efficacy of intratracheal adeno-associated virus administration to newborn rats. Human Gene Therapy. 16, 1298-1306 (2005).
- Waszak, P., et al. Effect of intratracheal adenoviral vector administration on lung development in newborn rats. Human Gene Therapy. 13, 1873-1885 (2002).
- O'Reilly, M., Thébaud, B. Animal models of bronchopulmonary dysplasia. The term rat models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307, 948 (2014).
- Yu, J., et al. GFP labeling and hepatic differentiation potential of human placenta-derived mesenchymal stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 35, 2299-2308 (2015).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Zhang, Z. Y., et al. Superior osteogenic capacity for bone tissue engineering of fetal compared with perinatal and adult mesenchymal stem cells. Stem Cells. 27, 126-137 (2009).
- Huang, L. T., et al. Effect of surfactant and budesonide on pulmonary distribution of fluorescent dye in mice. Pediatric and Neonatology. 56, 19-24 (2015).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18, 164-172 (2012).
- Yeh, T. F., et al. Intra-tracheal administration of budesonide/surfactant to prevent bronchopulmonary dysplasia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193, 86-95 (2016).
- Nguyen, J. Q., et al. Intratracheal inoculation of Fischer 344 rats with Francisella tularensis. Journal of Visualized Experiments. (127), e56123 (2017).
- de Almeida, P. E., van Rappard, J. R., Wu, J. C. In vivo bioluminescence for tracking cell fate and function. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 663-671 (2011).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49, 3-10 (2011).
