Summary
תיאר הוא פרוטוקול לביצוע השתלת intratracheal של תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) באמצעות הזרקת intratracheal בטווח חולדות הלאומית. טכניקה זו היא אופציה מעשית מבחינה קלינית לאספקת תאי גזע ותרופות לתוך הריאות חולדה התינוק כדי להעריך את יעילותם.
Abstract
חשיפה ממושכת לריכוזים גבוהים של חמצן מובילה לדלקת ופגיעה בריאות חריפה, הדומה לדיספלזיה האנושית (BPD). ב תינוקות מוקדמת, BPD הוא סיבוך משמעותי למרות השימוש המוקדם של טיפול הגולש, אסטרטגיות אוורור אופטימלי, ואוורור לחץ חיובי לא פולשני. בגלל דלקת הריאות משחק תפקיד מכריע בפתוגנזה של BPD, סטרואידים השימוש הוא אחד הטיפול הפוטנציאלי כדי למנוע את זה. עם זאת, טיפול סטרואידים מערכתי אינו מומלץ בדרך כלל עבור תינוקות טרום לטווח עקב תופעות לוואי ארוכות טווח. מחקרים פרה-קליניים ובשלב האנושי הניסויים הקליניים הפגינו כי שימוש בתאי סטרומה mesenchymal (MSCs) ב hyperoxia המושרה פציעות ריאה בתינוקות טרום לטווח הוא בטוח וריאלי. לפני פגיעה בריאה היפראוקמית. לכן, המינהל intratracheal של תאי גזע ומשולב הטיפול הglucocorticoid התפתחה כאסטרטגיה חדשה לטיפול ילודים עם הפרעות בנשימה. השלב ההתפתחותי של ריאות החולדה בלידה הוא שווה ערך לזה בריאות האדם ב -26 לחודש בשבוע של ההיריון. מכאן, חולדות היילוד מתאימים לחקר intratracheal הממשל לקדם תינוקות לטווח עם מצוקה נשימתית כדי להעריך את יעילותה. טכניקת האינסטיציה הזאת היא אופציה קלינית לאספקת תאי גזע וסמים לתוך הריאות.
Introduction
חמצן משלים נדרש לעתים קרובות לטיפול בתינוקות היילוד עם מצוקה נשימתית1. עם זאת, טיפול עידות אצל תינוקות יש השפעות לטווח ארוך שלילית. חשיפה ממושכת לריכוזים גבוהים של חמצן מובילה לדלקת ופגיעה בריאות חריפה, הדומה לדיספלזיה האנושית (BPD)2. Bpd הוא סיבוך משמעותי של טיפול עידות שיכול להתרחש למרות טיפול מוקדם הסקר, הליכי אוורור אופטימלי, ושימוש מוגבר של אוורור לחץ חיובי לא פולשני בתינוקות מוקדמת. בעוד אסטרטגיות טיפול רבות דווחו עבור BPD3, אין טיפול ידוע יכול להפחית את הסיבוך הזה.
סטרואידים השימוש הוא אחד הטיפול הפוטנציאלי כדי למנוע BPD, כי דלקת ריאות ממלאת תפקיד מכריע בפתוגנזה שלה. עם זאת, טיפול סטרואידים מערכתית אינו מומלץ בדרך כלל עבור תינוקות טרום לטווח עקב תופעות לוואי ארוכות טווח4,5.
כדוריות העור mesenchymal (MSCs) יש תכונות pluripotent והוא יכול להבדיל לתוך סוגי תאים שונים, כולל עצם, סחוס, שומן הרקמה, שריר, והגידים6. MSCs יש השפעות אימונומודולטוריים, אנטי דלקתיות, ואת ההשפעות של משובי7, ומחקרים בעלי חיים להראות את היתרונות הטיפוליים של MSCs ואת הרכיבים המופרשים שלהם ב-hyperoxia המושרה פציעה הריאה במכרסמים8,9. לפני פגיעה בריאה היפראוקמית. לכן, המינהל intratracheal של תאי גזע ומשולב סטרואידים טיפול עשוי להיות אסטרטגיה הטיפול הפוטנציאלי לטיפול ילודים עם הפרעות בנשימה. מחקרים קדם-קליניים השתמשו בניהול intratracheal של תאי גזע וירוס הקשורים adeno בחולדות היילוד10,11,12. עם זאת, מצגת צעד אחר צעד של הטכניקה ובמעקב vivo של תאי גזע מושתלים אינו זמין. העכברוש היילוד מתאים לחקר ההשפעות של הממשל intratracheal על תינוקות טרום לטווח עם מצוקה נשימתית, כי השלב הסקולאני של ריאה החולדה בלידה הוא שווה ערך לזה של הריאה האנושית ב 26-28 שבוע של הריון13. שיטה יעילה עבור המינהל לתוך קנה הנשימה החולדה היא חיונית להפצת הריאות מוצלחת. הטכניקה המוצגת כאן מאפשרת לימוד של מינהל intratracheal של תאים ו/או תרופות לטיפול במחלות ריאות באמצעות חולדות כמודל לבני אדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הליך זה אושר על-ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשימוש באוניברסיטה הרפואית טייפה.
הערה: האדם MSCs באופן בלתי נשכח עם חלבון פלורסנט ירוק (GFP) ו גחלילית לוציפראז גנים (Fluc) הושגו מחברה מסחרית (טבלת חומרים).
1. אפיון MSCs אנושיים עם גחלילית לוציפראז וחלבון פלורסנט ירוק
- לשמור על MSCs האנושי עם GFP ו Fluc במדיה מלאה (מינימלי חיוני בינונית הנשר-אלפא שינוי [αMEM], שיושלם עם 10 לפחות 15% סרום של שור העובר [FBS], 2 מ"מ L-גלוטמין, 1 ng/mL בסיסי FGF, ו PSF) ב 37 ° צ' עם לחות רווי 5% CO תאי מעבר ב ~ 70-90% זרימה.
- התבוננו MSCs תחת מיקרוסקופ בניגוד לשלב של הפאזה הפלואורסצנטית (איור 1A) ולנתח את רמות הביטוי של fluc ו-gfp14.
- אפיון הMSCs על-ידי ניתוח הביטוי של סמני התקליטור, כולל CD44, CD73, CD90, CD105 באמצעות הזרימה cy try (איור 1B). לגרום טריהיוחסין בידול של תאי גזע כדי adipocytes, כונדרוציטים, ו אוסטאופציטים, ולאשר trilineage שושלת בידול (איור 1c) על ידי פון kossa, שמן אדום O, ו alcian כחול מכתים בעקבות פרוטוקול מסחרי15,16.
2. הפחתת גורי חולדה
- אפשר לילדים מלפני זמן מתוארך הריון-דאולי חולדות לספק וגינלית במונח.
- הסירו את גורי העכברושים. מהכלוב ביום הלידה 5
- בתוך תא הרדמה (2%).
- לאשר הרדמה נאותה על ידי בדיקת נשימה ורפלקסים.
הערה: הנשימה צריכה להיות רדודה ורפלקסים צריכים להצטמצם. גורי עכברושים נשארים ללא הכרה במשך. לפחות 10 דקות עם הריכוז הזה
3. המשך האינסטיציה
- פעם מורדם, לרסן את גורי החולדה על דוכן צנרור בזווית ב ~ 60 ° ולהחזיק כלבלבים במקום עם תיוג מעבדה קלטת על כל ארבעת הגפיים.
- החלת קלטת מתחת האף כדי לתקן את הראש ולאתר את הצוואר עבור ניקוב בקנה הנשימה.
- לחטא את אזור החתך (כלומר, צוואר) עם משטח הכנה של 75% אלכוהול.
- הפוך 0.3 ס מ אנכי חתך הצוואר האמצע מעל קנה הנשימה עם מיקרו מספריים כדי למנוע פגיעה בעורקים העורק.
- נתח את שכבות השומן ואת השריר משם כדי לאתר את קנה הנשימה עם מלקחיים קצה מעוקל מחודדות ללא קרס.
- להחזיק את קנה הנשימה עם מלקחיים עצה מעוקל.
- החזק מזרק 100 μL זקוף ובאיטיות להזריק 30 μL של תמיסת מלח רגיל (כלומר, שליטה) או 30 μL של Fluc-GFP עם תווית MSCs (1 x 105 תאים) לתוך קנה הנשימה דרך מזרק במחט של 30 גרם במהלך inspiratory שלב.
- סגור את החתך עם אחד 6-0 תפר משי, לקשור את הקשר קטן ככל האפשר, ולחתוך את הקצוות קצרים ככל האפשר.
- מניחים את החולדות תחת אור אינפרא אדום או על משטח חימום כדי לשמור על חום ולאפשר להם להתאושש מהרדמה.
- לאשר את החולדות הם חמים, ורוד, ומסוגל תנועה ספונטנית לפני החזרת חולדות לכלוב.
4. ניטור התפלגות הריאתי של MSCs
- כדי לעקוב אחר MSCs האנושית המושתלים, intraperitoneally להזריק חולדות עם מלח אשלגן מלוחים באגירה פוספט מלוחים (PBS) במינון של 125 מ"ג/ק"ג של משקל הגוף 15 דקות לאחר הזרקת MSC.
- שימוש ב -2%. בגביעי אף
- רכישת תמונות רציפים במרווחי זמן של 5 עד 15 דקות לאחר הממשל לוציפראב עם binning בינוני, 1 f/stop, ותחום 26 ס מ של תצוגה באמצעות מערכת הדמיה של בעל חיים קטן (טבלת חומרים).
- מכמת את פעילות האור מהריאות בהתבסס על אזורי העניין האוטומטיים באמצעות תוכנת דימות (טבלת חומרים)17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התפלגות הריאתי של האינסטיציה של תאי גזע במונח חולדות הלוטויום נקבע על ידי גחלילית לוציפראז (Fluc)-המסומנים בתאי גזע. MSCs התווית עם Fluc ו מתויג עם חלבון פלורסנט ירוק דרך התמרה ויראלית. איור 1A מדגים רמה גבוהה של ביטוי gfp ב-MSCs אנושי, ו 93.7% של האוכלוסייה הראו ביטוי חיובי gfp שזוהו על ידי cy try זרימה. MSCs האופיינים על ידי ניתוח הביטוי של סמני CD (כלומר, CD 44, CD73, CD90, ו CD105) ואת היכולת של בידול משולש השושלת לתוך אוסטאופציטים, כונדרוציטים, ו אדיפוציטים (איור 1B, ג). כדי לעקוב אחר הMSCs האנושית המושתלים ב vivo, הדמיה לומינסיית של החולדות בוצעה באמצעות מערכת הדמיה קטנה בעלי חיים. . המדידות נלקחו באופן וונטרואלי החולדות תוקנו עם סרט דביק ולאחר מכן הזרקה התוך הצפק של 30 מ"ג/mL של לוציפראב מלח אשלגן ב PBS במינון של 125 מ"ג/ק"ג של משקל הגוף היה מנוהל. לוציפראז משלבת עם לוציפראב, חמצן ו-ATP, ומפיקה אור באמצעות תגובה כימית, והתוצאה היא ביולומינסנציה18. במהלך תהליך ההדמיה, החולדות. השתמשו ב -2% מהאצטרובלים בגביעי אף תמונות חולדה נרכשו 10 דקות. לאחר הממשל הלוציפראני תמונות סדרתית נרכשו במרווחי זמן של 5-15 (ללא השהיית שעה) עבור לפחות 1 דקות, עם binning בינוני, 1 f/stop, ותחום 26 ס מ של נוף. שימוש בנתוני מדידה מרצף של תמונות ספקטרליות שסוננו באורכי גל שונים (560-660 nm), העומק והמיקום של כתב הביולומיאלי נקבע. אותות לומינסנציה מהריאות חושבו בהתבסס על אזורי העניין האוטומטיים במצב בחירת המעגל. העוצמה הממוצעת לאור בבעלי חיים מלוחים רגילה הוקצתה ערך של אחד, ונתונים עבור כל בעל חיים שטופלו MSC היו מנורמל לאלה של בעלי חיים נורמליים מלוחים.
איור 2A מראה תמונה מייצגת של לומינציה בריאות החולדה. באזורי הריאות של החולדות. שטופלו בתמיסת מלח רגילה העכברושים שטופלו בMSCs הציגו הזדקנות בקנה הנשימה ובאזורי הריאות המרכזיים. הקוונפיקציה של האינטנסיביות הלומיאלית עולה כי החולדות שטופלו עם MSCs הציגו כ -13 להגדיל את הגידול בפעילות האור, לעומת החולדות שטופלו עם מלוחים רגיל לבד (איור 2B).
איור 1: אפיון MSCs האדם.
(א) ביטוי gfp ב MSCs אנושי לאחרהתמרהוירוס. (ב) ביטוי של סמני תקליטורים האנושיים הספציפיים ל-MSC (כלומר, cd 44, CD73, CD90, CD105). (ג) בידול השושלת הMSCs של האדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניטור התפלגות הריאות של האור באמצעות מערכת הדמיה של בעל חיים קטן.
(א) דמות ייצוגית של התפלגות הריאתי של MSCs המסומנות בחולדות. באזור הריאות של חולדות. שטופלו בתמיסת מלח רגילה חולדות שטופלו בMSCs האנושית הציגו באזורי הקנה והריאות. (ב) כימות של פעילות הפריה בריאות החולדה (n = 4). קווי השגיאה מייצגים סטיית תקן. קנה המידה הוא פוטונים/s/cm2/sr בציר Y. * * P < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תינוקות יילוד עם מצוקה נשימתית מחייבים בדרך כלל את הטיפול בחומרים מקצועיים ו/או סטרואידים19. בשלב האנושי הניסויים הקליניים הפגינו הבטיחות של intratracheal MSCs בתינוקות טרום לטווח8. מחקרים אלה מראים כי הממשל intratracheal של תרופות היא אופציה חשובה עבור תינוקות היילוד עם מצוקה נשימתית. לימודי מודל בעלי חיים שימושיים ביותר אם תכונות המודל נוגעות ישירות לבני האדם. המונח חולדות היילוד הם מודלים שימושיים לפגיעה בריאות לטווח ולימודי פיתוח. עם זאת, נתיב האוויר העליון של חולדות ה, הוא קטן מדי כדי לאפשר צנרור קנה הנשימה ישירה כפי שבוצעה בחולדות למבוגרים20. הדרך לפתיחת קנה הנשימה היא טכניקה חלופית אפשרית עבור מינהל intratracheal של תאי גזע או תרופות לריאות החולדה הנובית.
בשנת vivo ביולומינציה הדמיה הוא כלי רב ערך עבור מבחנה ובניטור vivo של הגורל של תא גזע המושתלים, מושגת על ידי תיוג תאים עם הביטוי הקונסטיטוטיבי של חלבון כתבת לוציפראז21. אנזימים לוציפראז מזרז את החמצון של מצע (לוציב), ומשחררים אור כתוצר של התגובה. הדמיה חזותית באמצעות ביולומינסנציה מאפשרת ניתוח מחלות שאינו פולשני ובזמן אמת של תהליכי מחלה באורגניזמים חיים. הדמיה ביולומינסנציה שימש בניטור vivo של הגירה, הישרדות, ו מורפולוגית של MSCs22. מחקר זה העריך את ההתפלגות של תאי גזע המושתלים בריאות באמצעות מערכת הדמיה vivo. ב vivo הדמיה ביולומינסנציה מסתמך על ניטור של חלקיקים המכילים תאים. כי אלה עשויים להיות phagocytosed על מוות התאים, זה יכול להוביל למעקב של מקרופאגים מארחים. לכן, לומינציה נמדד פחות מ 10 דקות לאחר הממשל לוציפראב.
המגבלה של מחקר זה היא כי וריאציה בין בעלי חיים נתפס בתמונות IVIS. מכאן, אותות האור מהריאות חושבו על בסיס האזורים האוטומטיים של עניין ונרמול עוצמת האור הממוצעת לאחד בבעלי חיים נורמליים מלוחים.
תיקון מדויק ואפקטיבי של intratracheal הוא חיוני להערכת היעילות MSC בחולדות הנוקיים, אבל זה עשוי להיות שימושי לבדיקת טיפולים רפואיים אחרים, כמו גם. מכאן, טכניקה זו מודל עכברוש עשוי להיות מתכוונן למגוון של יישומים ריאתי. השימוש בתאי גזע או תרופות מייצג טיפול קל יחסית וחסכוני של מחלות ריאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחקר זה היה נתמך באופן חלקי על ידי מענק Meridigen ביוטכנולוגיה ושות, בע מ טאיפה, טייוואן (א-109-008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 silk | Ethicon | 1916G | |
| Alcohol Prep Pad | CSD | 3032 | |
| BD Stemflow hMSC Analysis Kit | BD Biosciences | 562245 | CD markers |
| CMV-Luciferase-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging | SBI | BLIV511PA-1 | |
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| Human MSCs | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan | ||
| Infrared light | JING SHANG | JS300T | |
| Isoflurane | Halocarbon | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 small animal imaging system | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Luciferin potassium salt | Promega, Madison, WI | ||
| Micro-scissors, straight | Vannas | H4240 | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Isotonic Sodium Chloride Solution |
| Small Hub RN Needle, 30 gauge | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Syringe (100 µl) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
References
- Ramanathan, R., Bhatia, J. J., Sekar, K., Ernst, F. R. Mortality in preterm infants with respiratory distress syndrome treated with poractant alfa, calfactant or beractant: a retrospective study. Journal of Perinatology. 33, 119-125 (2013).
- Gien, J., Kinsella, J. P. Pathogenesis and treatment of bronchopulmonary dysplasia. Current Opinion in Pediatrics. 23, 305-313 (2011).
- Pasha, A. B., Chen, X. Q., Zhou, G. P. Bronchopulmonary dysplasia: Pathogenesis and treatment. Experimental and Therapeutic. 16, 4315-4321 (2018).
- Committee on Fetus and Newborn. Postnatal corticosteroids to treat or prevent chronic lung disease in preterm infants. Pediatrics. 109, 330-338 (2002).
- Watterberg, K. L. American Academy of Pediatrics; Committee on Fetus and Newborn. Policy statement-postnatal corticosteroids to prevent or treat bronchopulmonary dysplasia. Pediatrics. 126, 800-808 (2010).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)- dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (2), 42-49 (2009).
- Chou, H. C., Li, Y. T., Chen, C. M. Human mesenchymal stem cells attenuate experimental bronchopulmonary dysplasia induced by perinatal inflammation and hyperoxia. American Journal of Translational Research. 8, 342-353 (2016).
- Chen, C. M., Chou, H. C., Lin, W., Tseng, C. Surfactant effects on the viability and function of human mesenchymal stem cells: in vitro and in vivo assessment. Stem Cell Research & Therapy. 8, 180 (2017).
- Kim, Y. E., et al. Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats. Pediatric Research. 80, 415-424 (2016).
- Fleurence, E., et al. Comparative efficacy of intratracheal adeno-associated virus administration to newborn rats. Human Gene Therapy. 16, 1298-1306 (2005).
- Waszak, P., et al. Effect of intratracheal adenoviral vector administration on lung development in newborn rats. Human Gene Therapy. 13, 1873-1885 (2002).
- O'Reilly, M., Thébaud, B. Animal models of bronchopulmonary dysplasia. The term rat models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307, 948 (2014).
- Yu, J., et al. GFP labeling and hepatic differentiation potential of human placenta-derived mesenchymal stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 35, 2299-2308 (2015).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Zhang, Z. Y., et al. Superior osteogenic capacity for bone tissue engineering of fetal compared with perinatal and adult mesenchymal stem cells. Stem Cells. 27, 126-137 (2009).
- Huang, L. T., et al. Effect of surfactant and budesonide on pulmonary distribution of fluorescent dye in mice. Pediatric and Neonatology. 56, 19-24 (2015).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18, 164-172 (2012).
- Yeh, T. F., et al. Intra-tracheal administration of budesonide/surfactant to prevent bronchopulmonary dysplasia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193, 86-95 (2016).
- Nguyen, J. Q., et al. Intratracheal inoculation of Fischer 344 rats with Francisella tularensis. Journal of Visualized Experiments. (127), e56123 (2017).
- de Almeida, P. E., van Rappard, J. R., Wu, J. C. In vivo bioluminescence for tracking cell fate and function. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 663-671 (2011).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49, 3-10 (2011).
