Summary
Beskrivs är ett protokoll för att utföra intratracheal transplantation av mesenchymal stromal celler (MSCs) genom intratracheal injektion i termen neonatal råttor. Denna teknik är ett kliniskt gångbart alternativ för leverans av stamceller och läkemedel till neonatal råtta lungor för att utvärdera deras effekt.
Abstract
Långvarig exponering för höga koncentrationer av syre leder till inflammation och akut lungskada, som liknar mänskliga bronchopulmonary dysplasi (BPD). I för tidigt födda barn, BPD är en stor komplikation trots tidig användning av ytaktiva terapi, optimal ventilation strategier och noninvasive positivt tryck ventilation. Eftersom pulmonell inflammation spelar en avgörande roll i patogenesen vid BPD, kortikosteroid användning är en potentiell behandling för att förhindra det. Systemisk kortikosteroidbehandling rekommenderas dock vanligtvis inte för prematura spädbarn på grund av långsiktiga biverkningar. Prekliniska studier och kliniska prövningar i människa fas I visade att användning av mesenkymala stromala celler (MSCs) i hyperoxia-inducerad lungskador och prematura spädbarn är säker och genomförbar. Intratrakeal och intravenös MSC transplantation har visat sig skydda mot neonatal hyperoxic lung skada. Därför har intratrakeal administrering av stamceller och kombinerat ytaktivt och glukokortikoida behandling framkommit som en ny strategi för att behandla nyfödda med andningsbesvär. Utvecklingsstadiet av råttlungor vid födseln motsvarar det i mänskliga lungor vid 26−28 graviditetsvecka. Därför är nyfödda råttor lämpliga för att studera intratrakeal administrering till prematura spädbarn med luftvägsbesvär för att utvärdera dess effekt. Denna intratrakeal instillation teknik är ett kliniskt gångbart alternativ för leverans av stamceller och läkemedel i lungorna.
Introduction
Extra syre krävs ofta för att behandla nyfödda barn med andningsbesvär1. Hyperoxia terapi hos spädbarn har dock negativa långsiktiga effekter. Långvarig exponering för höga koncentrationer av syre leder till inflammation och akut lungskada, som liknar mänskliga bronchopulmonary dysplasi (BPD)2. BPD är en stor komplikation av hyperoxia behandling som kan uppstå trots tidig ytaktiva terapi, optimal ventilation förfaranden och ökad användning av noninvasive positivt tryck ventilation hos för tidigt födda barn. Medan många behandlingsstrategier har rapporterats för BPD3, ingen känd terapi kan minska denna komplikation.
Kortikosteroid användning är en potentiell behandling för att förhindra BPD, eftersom lunginflammation spelar en avgörande roll i dess patogenes. Systemisk kortikosteroidbehandling rekommenderas dock vanligtvis inte för prematura spädbarn på grund av långsiktiga biverkningar4,5.
Mesenkymala stromala celler (MSCs) har pluripotenta egenskaper och kan skilja sig i olika celltyper, inklusive ben, brosk, fettvävnad, muskler och senor6. MSCs har immunmodulerande, antiinflammatoriska och regenerativa effekter7, och djurstudier visar de terapeutiska fördelarna med MSCs och deras utsöndrade komponenter i hyperoxia-inducerad lungskada hos gnagare8,9. Intratrakeal och intravenös MSC transplantation har visat sig skydda mot neonatal hyperoxic lung skada. Intratrakeal administrering av stamceller och kombinerad ytaktiva och kortikosteroider terapi kan därför vara en potentiell behandlingsstrategi för att behandla nyfödda med luftvägssjukdomar. Prekliniska studier har använt intratrakeal administrering av stamceller och adeno-associerade virus hos nyfödda råttor10,,11,12. Det finns dock ingen steg-för-steg-presentation av tekniken och in vivo-spårningen av de transplanterade stamcellerna. Den nyfödda råttan är lämplig för att studera effekterna av intratrakeal administrering på prematura spädbarn med luftvägarna nöd eftersom saccular skede av råtta lungan vid födseln är likvärdig med den mänskliga lungan vid 26−28 graviditetsvecka13. En effektiv metod för administrering i råtta luftstrupen är avgörande för framgångsrik lungdistribution. Den teknik som presenteras här möjliggör studier av intratrakeal administrering av celler och/eller läkemedel för behandling av neonatal lungsjukdomar med råttor som modell för människor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta förfarande godkändes av Animal Care and Use Committee vid Taipei Medical University.
OBS: HumanASC:er som är stabilt transfekterade med grönt fluorescerande protein (GFP) och firefly luciferasgener (Fluc) erhölls från ett kommersiellt företag (Table of Materials).
1. Karakterisering av mänskliga MSC med firefly luciferas och grönt fluorescerande protein
- Upprätthålla humana MSCs transfected med GFP och Fluc i kompletta medier (minsta väsentliga medium eagle-alfa modifiering [αMEM], kompletteras med 10−15% fetala nötkreatur serum [FBS], 2 mM L-glutamin, 1 ng/mL grundläggande FGF, och polyesterstapel) vid 37 °C med mättad fuktighet och 5% CO2. Passageceller på ~70−90% sammanflödet.
- Observera MSC under en fluorescensfaskontrastmikroskop (figur 1A) och analysera uttrycksnivåerna för Fluc och GFP14.
- Karakterisera MSC genom att analysera uttrycket av CD-markörer inklusive CD44, CD73, CD90, CD105 med flödescytometri (figur 1B). Inducera trilineage differentiering av stamceller till adipocyter, kondrocyter och osteocyter, och bekräfta trilineage differentiering (figur 1C) av von Kossa, olja röd O, och Alcian blå färgning efter ett kommersiellt protokoll15,16.
2. Anesthetization av råttungar
- Tillåt tidsdaterade gravida Sprague-Dawley råttor att leverera vaginalt på sikt.
- Ta bort råttungarna från buren på postnatal dag 5.
- Bedöva råttungarna med hjälp av gasanestesi (dvs. 2 % isofluran) i en anestesikammare.
- Bekräfta adekvat anestesi genom att kontrollera andning och reflexer.
OBS: Andningen ska bli ytlig och reflexer bör minska. Råttungar förblir medvetslösa i minst ~10 min med denna isoflurankoncentration.
3. Intratrakeal instillation
- En gång bedövat, hindra råtta pups på en intubation stand vinklade på ~60° och hålla pups på plats med laboratorium märkning tejp på alla fyra lemmar.
- Applicera tejp under näsan för att fixera huvudet och peka ut nacken för punktering av trakeotomi.
- Desinficera snittområdet (dvs. hals) med en 75% alkohol prep pad.
- Gör ett 0,3 cm vertikalt mittlinje halssnitt ovanför luftstrupen med mikroscissorer för att undvika att skada halspulsådern.
- Dissekera fett- och muskellagren bort för att lokalisera luftstrupen med böjda spetssmalare pincett utan krok.
- Håll luftstrupen med den böjda spetsen avsmalnande pincett.
- Håll en 100 μl spruta upprätt och injicera långsamt 30 μL normal koksaltlösning (dvs. kontroll) eller 30 μL Fluc-GFP-märkta MSC (1 x 105 celler) i luftstrupen genom en 30 G sprutanål under inandningsfasen.
- Stäng snittet med en 6-0 silkessöm, knyt knuten så liten som möjligt och skär ändarna så kort som möjligt.
- Placera råttorna under infrarött ljus eller på en värmedyna för att hålla värmen och låt dem återhämta sig från anestesi.
- Bekräfta att råttorna är varma, rosa och kapabla till spontana rörelser innan råttorna återförs till buren.
4. Övervakning av lungdistributionen av belastningsbesvär
- För att spåra de transplanterade humana MSCs, injicera intraperitoneally råttorna med luciferin kaliumsalt i fosfatbuffratssaltlösning (PBS) vid en dos av 125 mg/kg kroppsvikt 15 min efter MSC-injektion.
- Söva råttorna med 2% isofluran genom näsan kottar.
- Förvärva sekventiella bilder med 5–15 s intervaller 10 min efter administrering av luciferin med medelstor binning, 1 f/stopp och ett 26 cm synfält med hjälp av ett bildsystem för små djur (Tabell över material).
- Kvantifiera luminescensaktiviteten från lungorna baserat på de automatiska intresseregionerna med hjälp av bildbehandlingsprogramvara(Tabell över material)17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lungfördelningen av intratrakeal instillation av stamceller i termen neonatalråttor bestämdes av firefly luciferas (Fluc)-märkta stamceller. MSCs var märkta med Fluc och märkta med grönt fluorescerande protein genom lentiviral transduktion. Figur 1A visar en hög nivå av GFP uttryck i mänskliga MSCs, och 93,7% av befolkningen visade GFP positiva uttryck som upptäcks av flöde cytometri. MSCs kännetecknades av att analysera uttrycket av CD-markörer (dvs. CD 44, CD73, CD90 och CD105) och förmågan att trilineage differentiering i osteocyter, kondrocyter och adipocyter (figur 1B, C). För att spåra den transplanterade mänskliga MSCs in vivo, luminescens bildbehandling av råttor utfördes med hjälp av ett litet djur bildsystem. Mätningarna togs ventrally. Råttorna fixerades med tejp och därefter administrerades en intraperitoneal injektion på 30 mg/ml luciferin kaliumsalt i PBS vid en dos på 125 mg/kg kroppsvikt. Luciferase kombinerar med luciferin, syre och ATP, och genererar ljus genom en kemisk reaktion, vilket resulterar i bioluminescens18. Under bildframställning förfarandet var råttorna sövda med 2% isofluran administreras genom näsan kottar. Råtta bilder förvärvades 10 min efter luciferin administration. Sekventiella bilder förvärvades med 5–15 s intervall (ingen tidsfördröjning) i minst 1 min, med medelstor binning, 1 f/stopp och ett 26 cm synfält. Med hjälp av mätdata från en sekvens av spektralbilder filtrerade vid olika våglängder (560–660 nm) fastställdes den bioluminescerande reporterns djup och placering. Luminescence signaler från lungorna beräknades baserat på de automatiska regioner av intresse i cirkeln urvalsläge. Den genomsnittliga luminescensintensiteten hos normala saltlösningsbehandlade djur tilldelades ett värde på ett och data för varje MSC-behandlat djur normaliserades till värdet hos normala saltlösningsbehandlade djur.
Figur 2A visar en representativ bild av luminescens i råttlungorna. Ingen blomning observerades i lungregionerna hos råttor som behandlades med normal koksaltlösning. Råttorna som behandlades med MSC uppvisade luminescens i luftstrupen och centrala lungregionerna. Kvantifieringen av luminescensintensiteten visade att råttorna som behandlades med MSC uppvisade en cirka 13 gånger fler blomningsaktivitet, jämfört med råttor som behandlades med enbart normal koksaltlösning (figur 2B).
Figur 1: Karakterisering av mänskliga belastningsbesvär.
(A)GFP-uttryck i humana MSC efter lentivirustransduktion. (B)Uttryck för mänskliga MSC-specifika CD-markörer (dvs. CD 44, CD73, CD90, CD105). (C)Trilineage differentiering av mänskliga MSCs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Övervakning av lungfördelning av luminescens med hjälp av ett bildsystem för små djur.
aA) En representativ bild av lungfördelningen av de märkta belastningsbesvären hos råttor. Ingen blomning observerades i lungregionen av råttor som behandlats med normal koksaltlösning. Råttor som behandlats med humana MSC uppvisade luminescens i trakeal- och lungregionerna. B)Kvantifiering av luminescensaktivitet i råttlungorna (n = 4). Felstaplarna representerar standardavvikelse. Skalan är fotoner/s/cm2/sri Y-axeln. **P & 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nyfödda barn med luftvägsbesvär kräver vanligen intratrakeal ytaktivt och/eller kortikosteroidbehandling19. Kliniska prövningar under human fas I har visat säkerheten hos intratrakeala MSC hos prematura spädbarn8. Dessa studier tyder på att intratrakeal administrering av läkemedel är ett viktigt alternativ för nyfödda spädbarn med luftvägarna nöd. Djurmodellstudier är mest användbara om modellfunktionerna är direkt relevanta för människor. Term nyfödda råttor är användbara modeller för prematur lungskada och utvecklingsstudier. Den övre luftvägarna hos neonatalråttor är dock för liten för att möjliggöra direkt trakeal intubation som utförs hos vuxna råttor20. Intratrakeal instillation genom trakeotomi är en genomförbar alternativ teknik för intratrakeal administrering av stamceller eller läkemedel till neonatal råtta lungorna.
In vivo bioluminescens imaging är ett värdefullt verktyg för in vitro och in vivo övervakning av ödet för den transplanterade stamceller, åstadkoms genom märkning celler med det konstituerande uttrycket av en luciferas reporter protein21. Luciferasenzymer katalyserar oxidationen av ett substrat (luciferin) och frigör ljus som en produkt av reaktionen. Visuell avbildning genom bioluminescens möjliggör en noninvasive och realtidsanalys av sjukdomsprocesser i levande organismer. Bioluminescens imaging användes för in vivo övervakning av migration, överlevnad och morfologiska differentiering av MSCs22. Denna studie utvärderade fördelningen av de transplanterade stamcellerna i lungorna med hjälp av ett in vivo-bildsystem. In vivo bioluminescens imaging bygger på övervakning av cell-innehöll partiklar. Eftersom dessa kan vara fagocytosed vid celldöd, det kan leda till spårning av värd makrofager. Därför mättes luminescence mindre än 10 min efter luciferin administration.
Begränsningen av denna studie är att interanimal variation uppfattades i IVIS-bilderna. Därför beräknades luminescenssignalerna från lungorna baserat på de automatiska regionerna av intresse och normaliserade den genomsnittliga luminescensintensiteten till en hos normala saltlösningsbehandlade djur.
Korrekt och effektiv intratrakeal instillation är viktigt för utvärdering av MSC effekt hos neonatal råttor, men det kan vara användbart för att testa andra medicinska behandlingar samt. Därför kan denna råtta modell teknik kan justeras till en mängd olika pulmonell applikationer. Intratrakeal instillation av stamceller eller läkemedel utgör en relativt enkel och kostnadseffektiv behandling av lungsjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes delvis av ett bidrag från Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan (A-109-008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 silk | Ethicon | 1916G | |
| Alcohol Prep Pad | CSD | 3032 | |
| BD Stemflow hMSC Analysis Kit | BD Biosciences | 562245 | CD markers |
| CMV-Luciferase-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging | SBI | BLIV511PA-1 | |
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| Human MSCs | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan | ||
| Infrared light | JING SHANG | JS300T | |
| Isoflurane | Halocarbon | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 small animal imaging system | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Luciferin potassium salt | Promega, Madison, WI | ||
| Micro-scissors, straight | Vannas | H4240 | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Isotonic Sodium Chloride Solution |
| Small Hub RN Needle, 30 gauge | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Syringe (100 µl) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
References
- Ramanathan, R., Bhatia, J. J., Sekar, K., Ernst, F. R. Mortality in preterm infants with respiratory distress syndrome treated with poractant alfa, calfactant or beractant: a retrospective study. Journal of Perinatology. 33, 119-125 (2013).
- Gien, J., Kinsella, J. P. Pathogenesis and treatment of bronchopulmonary dysplasia. Current Opinion in Pediatrics. 23, 305-313 (2011).
- Pasha, A. B., Chen, X. Q., Zhou, G. P. Bronchopulmonary dysplasia: Pathogenesis and treatment. Experimental and Therapeutic. 16, 4315-4321 (2018).
- Committee on Fetus and Newborn. Postnatal corticosteroids to treat or prevent chronic lung disease in preterm infants. Pediatrics. 109, 330-338 (2002).
- Watterberg, K. L. American Academy of Pediatrics; Committee on Fetus and Newborn. Policy statement-postnatal corticosteroids to prevent or treat bronchopulmonary dysplasia. Pediatrics. 126, 800-808 (2010).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)- dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (2), 42-49 (2009).
- Chou, H. C., Li, Y. T., Chen, C. M. Human mesenchymal stem cells attenuate experimental bronchopulmonary dysplasia induced by perinatal inflammation and hyperoxia. American Journal of Translational Research. 8, 342-353 (2016).
- Chen, C. M., Chou, H. C., Lin, W., Tseng, C. Surfactant effects on the viability and function of human mesenchymal stem cells: in vitro and in vivo assessment. Stem Cell Research & Therapy. 8, 180 (2017).
- Kim, Y. E., et al. Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats. Pediatric Research. 80, 415-424 (2016).
- Fleurence, E., et al. Comparative efficacy of intratracheal adeno-associated virus administration to newborn rats. Human Gene Therapy. 16, 1298-1306 (2005).
- Waszak, P., et al. Effect of intratracheal adenoviral vector administration on lung development in newborn rats. Human Gene Therapy. 13, 1873-1885 (2002).
- O'Reilly, M., Thébaud, B. Animal models of bronchopulmonary dysplasia. The term rat models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307, 948 (2014).
- Yu, J., et al. GFP labeling and hepatic differentiation potential of human placenta-derived mesenchymal stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 35, 2299-2308 (2015).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Zhang, Z. Y., et al. Superior osteogenic capacity for bone tissue engineering of fetal compared with perinatal and adult mesenchymal stem cells. Stem Cells. 27, 126-137 (2009).
- Huang, L. T., et al. Effect of surfactant and budesonide on pulmonary distribution of fluorescent dye in mice. Pediatric and Neonatology. 56, 19-24 (2015).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18, 164-172 (2012).
- Yeh, T. F., et al. Intra-tracheal administration of budesonide/surfactant to prevent bronchopulmonary dysplasia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193, 86-95 (2016).
- Nguyen, J. Q., et al. Intratracheal inoculation of Fischer 344 rats with Francisella tularensis. Journal of Visualized Experiments. (127), e56123 (2017).
- de Almeida, P. E., van Rappard, J. R., Wu, J. C. In vivo bioluminescence for tracking cell fate and function. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 663-671 (2011).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49, 3-10 (2011).
