Summary
Denne metoden demonstrerer bruk av den nordlige hybridiseringsteknikken for å oppdage miRNAer fra totalt RNA-ekstrakt.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) er en klasse av endogene uttrykt ikke-koding, ~ 21 nt små RNAs involvert i regulering av genuttrykk i både planter og dyr. De fleste miRNAer fungerer som negative brytere av genuttrykk rettet mot viktige gener. I planter genereres primære miRNAs (pri-miRNAs) transkripsjoner av RNA polymerase II, og de danner varierende lengder av stabile stem-loop strukturer kalt pre-miRNAs. En endonuclease, Dicer-lignende1, behandler pre-miRNAs i miRNA-miRNA * duplekser. En av trådene fra miRNA-miRNA* duplex er valgt og lastet på Argonaute 1 protein eller dets homologer for å megle spalting av mål mRNAs. Selv om miRNAer er viktige signalmolekyler, utføres deres deteksjon ofte av mindre enn optimale PCR-baserte metoder i stedet for en sensitiv nordlig blotanalyse. Vi beskriver en enkel, pålitelig og ekstremt følsom nordlig metode som er ideell for kvantifisering av miRNA-nivåer med svært høy følsomhet, bokstavelig talt fra ethvert plantevev. I tillegg kan denne metoden brukes til å bekrefte størrelsen, stabiliteten og overfloden av miRNAer og deres forløpere.
Introduction
Den nylige oppdagelsen av små regulatoriske RNA-er, microRNAs, har ledet forskning i å forstå dem og deres rolle i planter og dyr1. Lange forløpere av miRNAs behandles i 21 til 24 nt modne miRNAs av HYL1 og spesifikke terninger-lignende proteiner2,3. En 22 nt miRNA kan starte kaskade deaktivering ved å generere sekundære siRNAs4. Studier har vist rollen som miRNAs og sekundære siRNAs i utvikling, celle skjebne og stress svar5,6.
Northern hybridization er en eksperimentell metode rutinemessig ansatt for å oppdage spesifikke RNA molekyler. Denne metoden tilpasser bruken ved påvisning av ca. 19 -24 nt lange små RNA-er fra et utvalg av totalt RNA7. I denne demonstrasjonen illustrerer vi bruken av denne teknikken for deteksjon og kvantifisering av miRNAer. Denne metoden bruker merking av sonder ved hjelp av radioisotoper; MiRNA-nivåene i prøven kan derfor oppdages med økt følsomhet. I motsetning til PCR-baserte metoder sikrer denne metoden kvantifisering av uttrykk samt størrelsesbestemmelse av miRNAer. I denne protokollen viser vi viktige trinn som forbedrer miRNA-deteksjon. Vi har endret trinn i blotting og hybridisering for å oppnå høyoppløselig signaldeteksjon av miRNAer. Denne teknikken kan også brukes til påvisning av andre endogene små RNA-er som siRNA-er, tasi-sekundære RNA-er og snoRNAer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av en 15% denaturing polyakrylamid gel
- Vei og tilsett 4,8 g urea, tilsett 3,75 ml 40 % akrylamid: bisakrylamid (19:1) oppløsning og 1 ml 10x TBE pH 8.2 i et sterilt 50 ml rør.
- Løs opp urea ved hjelp av et vannbad satt til 60 °C i en klar oppløsning.
- Sminke volumet til 10 ml ved hjelp av nyautoklavt sterilt vann og avkjøl gelblandingen til romtemperatur.
- Forbered frisk 10% (w / v) ammonium persulfat løsning.
2. Montering av glassplater og elektroforeseenhet
- Vask alt apparatet som kreves for gelelektroforese og elektroblotting med vaskemiddel. Skrubb dem forsiktig med en myk svamp for å fjerne gjenværende buffer og akrylamid, skyll med vann og la dem tørke.
- Monter begge glassplatene sammen og plasser dem godt på svampen. Bruk en 1 mm tykk plate for dette oppsettet. Pass på at platene er på samme nivå for å unngå lekkasje.
- Til 10 ml gelblanding legger du til 8 μL TEMED og 80 μL nylaget 10 % (w/v) ammoniumpersulfatoppløsning.
- Uten forsinkelse, bland forsiktig og hell dette mellom de monterte glassplatene. Plasser kammen forsiktig. Unngå å generere luftbobler i dette trinnet.
- La gelen polymerisere i ca. 45 min.
- Vask den polymeriserte gelen med sterilt vann før du plasserer inne i gel-running setup.
- Monter platene inne i løpekassetten og fjern kammen forsiktig.
- Hell nylaget steril 1x TBE, pH 8.2 inn i tanken.
- Vask brønnene forsiktig ved å pipe bufferen for å fjerne saltkrystaller. Dette trinnet hjelper RNA-prøven til å kjøre jevnt over gelen.
- Utfør en pre-run på 80 V i 30 min.
3. Klargjøring av lasting fargestoff og prøver
- For 10 ml gellastefarget, vei 5 mg bromofenol blå, 5 mg xylencyanol, tilsett 10 ml deionisert formamid forsiktig og bland dem godt.
- Aliquot 10 μg totalt RNA til et sterilt 1,5 ml rør og tørk prøvene ved hjelp av en speedvac. Ikke tørk prøvene for mye.
- Resuspend RNA-prøvene i 8 μL lasting.
- Varm prøvene ved 98 °C i 2 min, avkjøl i 1 min ved RT, vortex og spinn prøvene, i 3 ganger. Dette trinnet er viktig for riktig resuspension, og i sin tur hjelper dette i lik lasting av prøvene.
4. Gel elektroforese
- Stopp forløpet og vask brønnene før prøvebelastning.
- Varm prøvene ved 98 °C i 1 min og legg prøvene varme inn i brønnen ved hjelp av kapillærspisser. Sett spissen til bunnen av brønnen, slik at prøven opptar ett tynt lag i brønnen.
- Fullstendig lasting av alle prøvene. Inkluder for å laste RNA tiår markør.
- Kjør gelen på 80 V til bromophenol blå fargestoff går nesten helt. Bromophenol blå går på 10 bp i en 15% denaturing akrylamid gel.
5. Forberedelse til elektroblotting
- Klipp N+nylonmembranen til dimensjonene på glassplaten og merk membranen øverst til høyre med en HB-blyant.
- Plasser membranen forsiktig på overflaten av sterilt vann, vendt mot den merkede siden mot vannoverflaten. Forkørk membranen i 15 min.
- Klipp 4 stykker blotting papir I til dimensjonene av fiber pad.
- Forbered gelsandwichen for å plassere den grå siden av kassetten ned i et rent brett.
- Fukt fiberputen og plasser den over kassetten. Fjern luftbobler.
- Pre-våt ett stykke blotting papir i 1x TBE og plasser over fiberputen. Fjern luftbobler ved å rulle en plastpipette over papiret. Legg et annet stykke pre-våt blotting papir og fjern luftbobler.
- Fjern gelen forsiktig fra løpekassetten og plasser den over sandwichoppsettet, slik at den første lastede RNA-prøven er mot høyre.
- Dypp forsiktig den forlagte membranen i 1x TBE og plasser den over gelen, vendt mot den merkede siden ned. Rull ut for å fjerne luftboblene.
- Dypp et stykke blottingpapir, legg det over membranen og fjern luftboblene. Dypp et annet stykke blotting papir, legg det over sandwich oppsett og fjern luftbobler.
- Fullfør smørbrødet ved å plassere en pre-våt fiberpute over oppsettet og lukk kassetten godt.
- Plasser transblåstekassetten i modulen og fyll 1x TBE, pH 8.2 opp til blottingmerket.
- Overfør ved 10 V, over natten ved 4 °C.
- Etter overføring, plasser den fuktige membranen på et papirark og kryss-koble RNA til membranen ved bestråling med 254-nm UV-lys (120.000 μjoules / cm²). Den krysskoblede blot kanskje lagret ved 4 °C for ytterligere hybridisering.
6. Utarbeidelse av radiomerket sonde
- Design en sonde som er helt komplementær til den lille RNA som skal oppdages.
- Slutt etikett sonden ved hjelp av ƳP32ATP (hentet fra BRIT) ved sin 5 'ende ved å kombinere komponentene i henhold til oppskriften som følger i tabell 1.
- Inkuber ovennevnte reaksjonsblanding ved 37 °C i 30 min.
- Separat umerket ƳP32ATP fra sonde ved hjelp av en Sephadex G-25-kolonne i henhold til produsentens protokoll.
7. Hybridisering av flekken
- Plasser den krysskoblede flekken, RNA-siden vendt mot toppen inne i en hybridiseringsflaske.
- Bland kraftig den ultrafølsomme hybridiseringsbufferen, tilsett 10 ml av den og inkuber blot inne i en hybridiseringsovn som vedlikeholdes ved 35 °C, med rotasjon.
- Utfør pre-hybridisering i 20 min.
- Fjern flasken fra ovnen og legg den merkede sonden forsiktig inn i hybridiseringsbufferen.
- Hybridiser flekken ved 35 °C, med rotasjon i 12 timer.
- Etter hybridisering nøye overføre hybridisering løsning i 15 ml rør. Denne oppløsningen kan oppbevares ved 4 °C til den tas i bruk igjen.
- Utfør en rask vask av blot i 2 min for å fjerne overflødig hybridiseringsløsning ved å legge til 2x SSC-buffer pluss 0,5% SDS. Kast oppløsningen.
- Inkuber blot med 2x SSC buffer pluss 0,5% SDS for 35 °C, med rotasjon i 30 min.
- Vask blot igjen med 0,5x SSC buffer pluss 0,5% SDS for 35 °C, med rotasjon i 30 min.
- Plasser flekken i et hybridiseringsdeksel, fjern overflødig buffer og forsegle den.
- Utsett den for en strålingsfri fosfor imager skjerm over natten inne i en kassett.
- Oppdag hybridiseringssignalet ved hjelp av biomolekylær imager og analyser resultatene ved hjelp av egnet programvare.
- Striper blot ved å inkubere den ved 80 °C, med rotasjon i 30 min med 0,5 X SSC-buffer pluss 0,1 % SDS og 0,1 X SSC-buffer pluss 0,1 % SDS i 30 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne demonstrasjonen har vi oppdaget og kvantifisert uttrykket av miR397 i forskjellige vev av indica ris var whiteponni (Figur 1). miR397 er en 22 nt miRNA og bevart miRNA. Uttrykket miR397 kan oppdages i alle testede prøver. I henhold til neste generasjons sekvenseringsdata har prøve 1 (frøplantevev) miR397 på 5 leser per million (turtall). Vi oppdaget signalet komfortabelt, noe som indikerer at metoden er svært følsom og kan brukes til å oppdage selv svært lave rikelig miRNAer. I dette eksperimentet har vi brukt miR168 og U6 som lastekontroller.
I denne blot (figur 1),styrken av signaler ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ. Uttrykket miR397 er høyest i vegetativ bladhylse.
Figur 1: Deteksjon og kvantifisering av uttrykk for miR397 i forskjellige vev av risprøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Buffer og løsning | Oppskrift | Kommentarer |
| 10 X TBE (andre) | 0.89M Tris buffer | pH skal settes til 8,2 ved hjelp av eddiksyre |
| 0.89M Borsyre | ||
| 30m EDTA (andre) | ||
| Gel blanding | 15% akrylamid-bisakrylamid sol, 19:1 | Gelblanding bør ikke inneholde ureakrystaller |
| 8M urea | ||
| 1x TBE (andre) | ||
| Fargestoff for gel lasting | 0,05 %(w/v) bromophenol blå | Forsiktighet bør utvises under håndtering av deionisert formamid |
| 0,05 %(w/v) Xylene xyanol | ||
| 100 % deionisert- formamid | ||
| Merking av sonde | PNK buffer (10X, 2 μL) | Denne blandingen inneholder radioaktive molekyler, dette trinnet må utføres av opplært personel inne i et radioaktivt laboratorium |
| PNK-enzym (1 μL) | ||
| Oligo (100 μM, 0,1 μL) | ||
| ƳP32 ATP (4 μL) | ||
| Vaskebuffer - I | 2x SSC (andre) | |
| 0,5 % (m/v) SDS | ||
| Vaskebuffer - II | 0,5x SSC (andre) | |
| 0,5 % (m/v) SDS | ||
| Stripping Buffer - I | 0,5x SSC (andre) | |
| 0,1 % (m/v) SDS | ||
| Stripping Buffer - II | 0.1X SSC (andre) | |
| 0,1 % (m/v) SDS |
Tabell 1: Tabell over oppskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden kan brukes mye til deteksjon og kvantifisering av små RNA-er, inkludert mindre rikelig miRNAer. Protokollen beskriver hovedsakelig trinnene for å denaturere den totale RNA i en lasting buffer, størrelse separasjon av gel elektroforese, overføring av RNA til en membran, kryss-koble RNA på membran og hybridisere ved hjelp av ønskede radiomerkede oligo prober.
Det kritiske trinnet for ethvert blottingeksperiment er bruk av RNA av god kvalitet for prøveforberedelse. Før du laster gelene, må man sørge for at prøvene er friflytende og ikke holder seg til lastetipsene. Vær forsiktig når du laster prøven, spissen skal settes inn like over bunnen av brønnen slik at prøven opptar ett tynt lag i brønnen. Temperaturen på hybridiseringsovnen må opprettholdes ved 35 °C for påvisning av miRNAer som er ekstremt mindre rikelig. For gjentatt hybridisering av blot, oppbevar membranen ved 4 °C ved å holde den fuktig i 2x SSC.
Denne metoden kan brukes til å oppdage små RNA-er fra vev som er rike på polysakkarider og polyfenoler8. I denne protokollen gir bruk av vakuumtørking for å konsentrere RNA-prøver bedre stabilitet og mindre tap av prøve sammenlignet med andre eldre metoder9. Annen modifikasjon i metoden inkluderer spredning av membranen i vann før dypping i 1x TBE under elektrooverføring. Dette forbedrer effektiviteten av RNA-overføring, noe som gir bedre oppløsning av blot.
En stor begrensning av metoden er bruk av radioisotoper, som trenger trent personell og et radioisotoplaboratorium for å utføre hybridiseringseksperimentene. Denne metoden her gir detaljert informasjon om alle trinnene som er involvert i RNA blot analyse for påvisning av miRNAs. Denne protokollen sikrer også størrelsen på den lille RNA bortsett fra signaldeteksjon10. Teknikken gir et robust verktøy for molekylærbiologer for å estimere overflod av ulike små RNA-er som miRNAs, sekundære siRNAs og snoRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner tilgangen til strålingslab levert av vertsinstituttet og BRIT for radioisotop. PVS-laboratoriet støttes av National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research and grants (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) fra Institutt for bioteknologi, Regjeringen i India. MP anerkjenner DBT-Research Associateship, DBT, regjeringen i India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D.
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V.
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
