Observation microscopique de la dynamique des lymphocytes dans les patchs de Rat Peyer

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode précise pour recueillir les lymphocytes thoraciques de conduit et observer la migration des lymphocytes intestin-tropiques dans les corrections de Rat Peyer pendant 3 heures utilisant la photographie de time-lapse. Cette technique peut clarifier comment la dynamique des lymphocytes sont affectés dans des conditions inflammatoires.

Résumé

Les lymphocytes naïfs recirculent du sang aux tissus lymphoïdes dans un état physiologique et il est généralement reconnu comme un phénomène important dans l’immunité intestinale. Le stroma des organes lymphoïdes secondaires, tels que les patchs de Peyer (PPs) ou les ganglions lymphatiques mésentériques, sont l’endroit où les lymphocytes naïfs détectent les antigènes. Les lymphocytes naïfs circulent dans le sang pour atteindre les venules endothéliales élevées, le portail d’entrée dans les PPP. On estime que certains immunomodulateurs influencent la migration des lymphocytes, mais l’évaluation précise de la dynamique de microcirculation est très difficile, et l’établissement d’une méthode pour observer la migration des lymphocytes in vivo peut contribuer à la clarification des mécanismes précis. Nous avons affiné la méthode de collecte des lymphocytes du conduit lymphatique et d’observation de la dynamique détaillée des lymphocytes intestino-tropiques chez les rats. Nous avons choisi la microscopie confoccale de balayage de laser pour observer des PP de rat in vivo et l’avons enregistrée utilisant la photographie de time-lapse. Nous pouvons maintenant obtenir des images claires qui peuvent contribuer à l’analyse de la dynamique des lymphocytes.

Introduction

Les patchs de Peyer (PPs) se composent de centaines de follicules lymphoïdes dans la propria lamina de l’intestin grêle. Les PPP sont divisés en follicules, la région interfollicular, et les centres germinaux situés dans la partie inférieure des follicules, où les lymphocytes sont stimulés par la présentation d’antigène. Il n’y a pas de vaisseaux lymphatiques afferents, et les antigènes envahissent le propria lamina du lumen intestinal par l’intermédiaire de la couche épithéliale de cellules. La région épithéliale couvrant les follicules lymphoïdes est appelée épithélium associé au follicule, dans lequel les cellules M intercalées spécialisées absorptionnt des antigèn....

Protocole

Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité de recherche animale du National Defense Medical College (no 16058). Les animaux ont été maintenus sur chow standard de laboratoire (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japon). Les animaux de laboratoire ont été traités conformément aux directives des National Institutes of Health.

1. Collecte et séparation des lymphocytes

REMARQUE : Comme les lymphocytes doivent être frais et ne peuvent pas être stockés, ils doivent être prélevés sur des rats pour chaque expérience. En outre, les lymphocytes intestino-tropiques doivent être prélevés directement dans le conduit thoracique o....

Résultats

Collecte des lymphocytes de la lymphe
Pour préparer le rat à la cannulation thoracique du conduit, faites une incision dans le conduit thoracique tendu, comme le montre la figure 1, puis maintenez le rat dans la cage d’un Bollman, comme le montre la figure 2.

Lorsque les lymphocytes sont bien collectés, nous pouvons obtenir environ 20 mL/6 h de liquide lymphatique contenant environ 10^{lymphocytes 7}~10

Discussion

Ici nous avons décrit un protocole pour recueillir les lymphocytes intestin-tropiques naïfs et observer leur migration dans des PP de rat. Ces procédures peuvent révéler comment les lymphocytes se déplacent dans la microvasculature des PPP et rendre possible de comparer visuellement leur dynamique dans un état normal ou médicamenteux. L’observation directe de ces dynamiques a beaucoup de mérite pour obtenir un indice de modification immunologique par certains médicaments, bien que la période d’observation soit limitée à .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
A1R+	Nikon		Microscopie comfocale à balayage laser
Carboxyfluorescéine diacétate ester succinimidylique	Thermo Fisher Scientific	C1157
Hoechest 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Isoflurane	Wako Pure Chemical Industries	099-06571
RPMI 1640 moyen	GIBCO	11875093
Texas Red&ndash ; dextran	Thermo Fisher Scientific	D1863