Summary
Vi presenterer en genetisk modifisert-fri (GM-fri) metode for å skaffe celler med en nevronal fenotype fra omprogrammerte perifere blodlegemer. Aktivering av en signalvei knyttet til nytt humant GPI-tilknyttet protein avslører en effektiv GM-fri metode for å skaffe menneskelige pluripotente stamceller.
Abstract
Mange menneskelige nevrologiske lidelser er forårsaket av degenerasjon av nevroner og glialceller i hjernen. På grunn av begrensninger i farmakologiske og andre terapeutiske strategier, er det for tiden ingen kur tilgjengelig for den skadede eller syke hjernen. Celleerstatning fremstår som en lovende terapeutisk strategi for nevrodegenerative forhold. Til denne dag har nevrale stamceller (NSC) blitt vellykket generert fra fostervev, humane embryonale celler (ES) eller induserte pluripotente stamceller (iPSC). En prosess med dedifferensiering ble initiert ved aktivering av det nye menneskelige GPI-tilknyttede glykoproteinet, noe som fører til generering av pluripotente stamceller. Disse blodavledede pluripotente stamcellene (BD-PSCer) skiller in vitro inn i celler med en nevral fenotype som vist ved brightfield og immunfluorescence mikroskopi. Ultrastrukturell analyse av disse cellene ved hjelp av elektronmikroskopi bekrefter deres primitive struktur samt nevronallignende morfologi og subcellulære egenskaper.
Introduction
Utvikling av grunnleggende og prekliniske stamcelleforskningsmetoder oppmuntrer til klinisk anvendelse av stamcellebaserte terapier for nevrologiske sykdommer. Slik potensiell terapi avhenger kritisk av metoden for generering av menneskelige nevrale celler som fører til funksjonell utvinning1.
Nevrale stamceller (NSC) fornyer seg selv og differensierer seg til nye nevroner gjennom livet i en prosess som kalles voksen neurogenese. Bare svært begrensede hjerneområder har NSC-er som er kompetente til å generere nyfødte nevroner i voksen alder. Slike NSC-er kan gi opphav til modne nevroner, som er involvert i læring og hukommelse, og dermed erstatte tapte eller skadede nevroner. Dessverre er disse NSC-ene til stede i begrensede mengder, og denne begrensede nevrogenesen reduseres raskt under ungdomsutvikling2. Derfor må andre kilder til nevrale celler vurderes i et celleterapimål.
Degenerative nevrologiske sykdommer er vanskelige å kurere ved hjelp av standard farmakologiske tilnærminger. Nye terapeutiske strategier for å omfavne mange uforgjengelige nevrologiske lidelser er basert på celleerstatningsterapier av sykt og skadet vev. NSC-transplantasjon kan erstatte skadede celler og gi gunstige effekter. Andre kilder til nevral celleerstatning inkluderer humane embryonale stamceller (ESC), som er avledet fra den indre cellemassen til pattedyr blastocysts3, samt iPSCs4, som har omfattende selvfornyelseskapasitet som ESC og er i stand til å skille seg ut i ulike celleavstamninger. NSC-er kan også genereres ved direkte omprogrammering fra menneskelige fibroblaster som unngår pluripotent tilstand5.
Celleerstatningsterapi er fortsatt et utfordrende problem. Selv om ESC, foster eller iPS kan være en kilde for generering av nevronceller for behandling av mange uhelbredelige nevrologiske sykdommer, er autolog voksen SCs celleerstatning av skadet vev et bedre alternativ som omgår immunologiske, etiske og sikkerhetsmessige bekymringer.
Aktivering av humant GPI-koblet protein ved antistoff-krysskobling via fosforylering av PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN initierer en dedifferensiasjon av blodforfederceller og generering av blodavledede pluripotente stamceller (BD-PSCer)6. Disse cellene skiller in vitro mot nevronceller som bekreftet ved hjelp av brightfield, immunfluorescens og transmisjonselektronmikroskopi (TEM) analyse.
I dette arbeidet beskriver vi den GM-frie generasjonen av BD-PSCer og deres vellykkede re-differensiering i celler med nevronal fenotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiske godkjenninger ble oppnådd ved gjennomføring av forsøkene.
1. Isolering av humane perifere mononukleære celler i blodet (PBMNCs)
- Forsikre deg om at alle givere signerte informert samtykke før blodet trakk seg tilbake i samsvar med institusjonelle retningslinjer.
- Ta 30 ml blod fra friske donorer av opplært medisinsk personell i henhold til standardprotokollen.
- Isoler PBMNCer ved hjelp av tetthetsgraderingsmedier. Bruk 10 ml medier med 25 ml 1:1 blod fortynnet med fosfatbuffer saltvann (PBS), og sentrifuger ved 300 x g i 30 minutter.
- Isoler det interfasede laget mellom plasmaet og tetthetsgradientmediet ved pipettering. Vask de isolerte cellene med 5 ml steril PBS og sentrifuge ved 300 x g i 10 min. Gjenta to ganger.
- Tell antall celler etter standardmetoder ved hjelp av et tellekammer.
2. Aktivering av humant GPI-forankret glykoprotein ved antistoffkrysskobling på overflaten av PBMNCs
- Plasser de 6 x 106 mononukleære cellene (MNC) i 15 ml rør og utfør antistoffkrysskobling ved å inkubere cellene med humant GPI-koblet membranproteinspesifikt antistoff (30 μg/ml) i 30 minutter i PBS med 1 % bovint serumalbumin (BSA) ved 37 °C.
- Erstatt inkubasjonsmediet med Iscoves modifiserte Dulbeccos medium supplert med 10% foster bovint serum (FBS).
- Vokse celler i 15 ml polystyrenrør, legg rørene i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i 8-10 dager (uten risting). På D5 legger du til ytterligere 1-2 ml av Iscoves medium supplert med 10% FBS til hvert 15 ml rør.
3. Sortering av nylig genererte dedifferensierte celler
- Tell celler med en automatisert celleteller (18 μL celleoppheng + 2 μL fluorescensfarge) eller i et tellekammer.
- Sentrifuge dyrket celle suspensjon (5-7 x 106) ved 300 x g i 10 min og aspirere den resulterende supernatant med en steril Pasteur pipette.
- Re-suspendere cellepellet i 90 μL av forkjølt PBS pH 7,2, 0,5% BSA og 2 mM EDTA.
- Tilsett CD45-positive magnetiske perler i nanostørrelse (80 μL) i celleopphenget og inkuber på is i 15 minutter.
- Vask cellene ved å tilsette 2 ml PBS-buffer og sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter.
- Deaktiver cellene på nytt i 500 μL PBS-buffer.
- Vask kolonnen med 500 μL forhåndskjølt PBS-buffer og plasser den i magnetfeltet.
- Plasser cellefjæringen på kolonnen og vask den med 500 μL PBS-buffer (to ganger) og sentrifugestrømmen som inneholder CD45 negative celler. Samle dem i Iscoves medium supplert med 1% BSA.
- Tell cellene i tellekammeret.
4. Forberede cellekulturretter for nevronal differensiering av nylig genererte stamceller
- Belegge kulturfartøyene med poly-L-ornitin og laminin for voksende nevronceller.
- Legg glassdekslene i 4-brønnsplater og belegge det med 1:5 fortynnet poly-L-ornitin (0,1 mg/ml i ddH2O) i ddH2O. Plasser dekslene i en 37 °C inkubator i 1 t. Vask deretter med ddH2O.
- Tines langsomt laminin (0,5-2,0 mg/ml) og legges til toppen av dekslene. Inkuber den ved 37 °C i 2 timer.
- Forbered nevral induksjonsmedium N2 bestående av 49 ml D-MEM/F12, 500 μL N2-tilskudd, 400 μL ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), grunnleggende FGF-oppløsning ved 20 ng/ml endelig konsentrasjon (fremstilt fra 100 μg/ml lagerløsning) og heparin ved 2 ng/ml endelig konsentrasjon.
- Fjern overflødig laminin ved pipettering og legg nevronal medium N2 til kulturretter.
5. Culturing av nevronale dedifferensierte blodlegemer
- Kultur BD-avledede CD45-negative celler på laminin/ornitinbelagte glassdeksler i 2 dager i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i N2-medium for å initiere en nevronal differensiering av nylig BD-genererte celler.
- Kulturceller videre i nevronal differensieringsmedium bestående av 48 ml nevrobasalt medium, 500 μL L-glutamin, 1 ml B27 Supplement, 500 μL NEAA, 50 μL rekombinant human glial-avledet nevrotrofisk faktor (GDNF) ved 5 μg/250 μL i PBS/0,1% BSA, og 50 μL rekombinant menneskelig hjerne avledet nevrotrofisk faktor (BDNF) ved 5 μg/200 μL i PBS/0,1% BSA og 50 μL askorbinsyreoppløsning 2,9 g/50 ml i PBS. Plasser plater i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
6. Immunfluorescence mikroskopi analyse av blodavledede nevrale celler
- Kultur cellene som beskrevet ovenfor i 16 dager og fjern media.
- Inkuber med forvarmet fiksering som består av 75 ml sterilt vann, 4 g paraformaldehyd. Tilsett 10 N NaOH etter behov og rør til oppløsningen er klar. Tilsett deretter 10 ml 10x PBS, 0,5 ml MgCl2, 2 ml 0,5 M EGTA og 4 g sukrose. Titrate til pH 7.4 med 6 N HCl, og bringe til 100 ml sterilt vann i 15 min, ifølge Marchenko et al.7.
- Kast fikseringsmiddelet og vask cellene 3 ganger i 5 minutter hver gang. Tilsett umiddelbart en nylaget 0,3% Triton X-løsning og permeabiliser cellene i 5 min. Vask 3 ganger med PBS og legg til en blokkeringsløsning laget av PBS og 5% BSA.
- Blokker cellene ved romtemperatur på en vippeplate i 1 time.
- Forbered passende fortynning av antistoffer i 1% BSA / PBS og inkuber cellene med antistofffortynning på vippeplate i 1,5 timer ved romtemperatur. Vask cellene 3 ganger med PBS i 5 minutter hver, inkuber cellene med DAPI og monter dekslene med monteringsmedier for visualisering på et mikroskop.
MERK: Direkte merkede antistoffer som brukes i dette eksperimentet, er oppført i Materialliste.
7. Transmisjonselektronmikroskopianalyse av nylig genererte celler
- Frø cellene for TEM i 8-brønns kammer lysbilder.
- Fest cellene i 3,5% glutaraldehyd i 1 time ved 37 °C, post-fix i 2% OsO4 i en ekstra time ved romtemperatur og flekk i 2% uranylacetat i mørket ved 4 °C i 2 t 30 min.
- Til slutt skyll cellene i destillert vann, dehydrer det i etanol og legg inn i epoksyharpiks over natten. Neste dag overføres prøvene til en 70 °C ovn i 72 timer for harpiksherding.
- Koble de innebygde cellekulturene fra kammersklie og lim til araldite blokker.
- Klipp serielle halvtynne seksjoner (1,5 μm) med en maskin, monter på glasssklier og flekk lett med 1% toluidinblå.
- Lim utvalgte halvtynne seksjoner til araldite blokker og løsne dem fra glasset lysbilde ved gjentatt frysing (i flytende nitrogen) og tining.
- Forbered ultratynne seksjoner (0,06-0,08 μm) med en maskin og ytterligere kontrast med blysitrat.
- Få mikrografer ved hjelp av elektronskanningsmikroskop med digitalt kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene gir bevis på at denne nye GM-frie metoden er i stand til å reversere blodforfederceller til sin mest primitive tilstand uten å handle direkte på det menneskelige genom.
Vi har tidligere vist at GPI-koblet proteinspesifikk antistoff krysskobling initierer via PLCγ / IP3K / Akt / mTOR / PTEN-oppregulering av svært konserverte utviklingsrelevante gener som WNT, NOTCH og C-Kit, og dermed starter en prosess med dedifferensiering som fører til det første trinnet til generasjon HSC og en andre og siste til en generasjon BD-PSCs6,8.
Aktiverte MNC-kulturer ble utsatt for immunomagnetisk sortering ved hjelp av CD45 mikrober. Eldre blodceller som ikke kan omprogrammeres med denne metoden (f.eks. CD45 positive celler) ble beholdt på kolonnen, mens den negative fraksjonen som inneholder omprogrammerte celler (CD45 negative celler) ble brukt til generering av ulike nevronale avstamningsceller.
Vi studerte først de morfologiske aspektene ved perifere BD-dedifferensierte celler ved hjelp av lys og TEM. Som vist i figur 1genererer spesifikk GPI-forankret glykoprotein antistoff krysskobling av humane MNCer en stadig voksende ny populasjon av celler (Figur 1A). Vi analyserte disse cellene ved hjelp av TEM. BD-dedifferensierte celler er små i størrelse og viser egenskapene til umodne agranulære celler, med gradvis mindre organeller og store kjerner med kondensert kromatin, lik ESC (Figur 1B). Ikke-behandlede kulturer viste en trend mot en gradvis forsvinning.
BD-CD45 negative celler ble utsatt for nevronal differensiering i to trinn. Vi initierte differensiering mot nevronale avgrensninger ved å så CD45 negative celler på poly-L-ornitin / lamininbelagte kulturplater i 2 dager i N2-medium etter kultur i nevronal differensieringsmedium. Brightfield-bilder ble anskaffet på henholdsvis dag 4, 8, 10, 14 og 30 ved oppstart av nevronal differensiering av BD-genererte stamceller.
Så tidlig som 4 dager etter å ha startet målrettet differensiering av nylig genererte celler, kunne de første nevronallignende cellene med lange forgreningsstrukturer oppdages. Vi observerer de morfologiske endringene fra D2 til D30 med en mer kompleks struktur, inkludert konsekvenser, noe som innebærer en aktiv prosess mot differensiering til nevronale avgrensninger gjennom hele kulturperioden (figur 2). For å bekrefte de nevronale egenskapene til re-differensierte celler etter å ha dyrket dem i nevronmediet i 16 dager, ble celler festet i henhold til en tidligere protokoll7, og immunocytokjemi (ICC) ble utført ved hjelp av antistoffdeteksjon for nestin, glial fibrillary acidic protein (GFAP), mikrotubule-assosiert protein 2 (MAP2) og nevronspesifikk klasse III beta-tubulin (Tuj1).
GFAP er proteinet som utgjør en del av cytoskjelett i astrocytter som representerer den viktigste mellomliggende filamentet av modne astrocytter. Som vist i figur 3, gjenkjenner antistoffet mot GFAP disse strukturene i de nylig genererte nevroncellene, og bekrefter at BD-PSCer er i stand til re-differensiering mot menneskelige astrocytter9.
MAP2 er et cytoskjelettprotein som binder seg til tubuli og stabiliserer mikrotubuler. Det uttrykkes i axoner, dendritter og cellelegemer, og dette uttrykket er vevs- og utviklingsspesifikk. Immunfluorescensmikroskopiresultatene bekrefter uttrykket av dette proteinet i re-differensierte celler10.
Tuj1 er typisk nevroncellemarkør. Dens funksjon er å stabilisere mikrotubili i nevronal cellelegeme og aksoner. Det er også involvert i axonal transport11. Nylig re-differensierte celler bekreftet tydelig uttrykket av dette proteinet ved D16 ved å starte nevronal differensiering under tilstanden som er beskrevet her.
Nestin ble først karakterisert i NSC og representerer et nevroepitel stamcelleprotein, som tilhører mellomliggende filament (IF) protein12 som skiller nevronale stamceller fra mer differensierte nevronceller. Disse IF-proteinene uttrykkes hovedsakelig i nerveceller der de er involvert i den radiale veksten av axonen, men de er også til stede i en rekke ekstra vev. Nestin som en markør for overveiende NSC-er er svakt uttrykt i cellene som allerede er på vei til å skille seg ut i spesifikke nevronale avgrensninger, da det er tilfelle med BD-re-differensierte celler ved D16.
Figur 1: Generering av dedifferensierte (pluripotente) stamceller. (A) Ficoll-isolerte mononukleære celler ble dyrket i Iscoves medium supplert med 10% FBS. Mikrografer av aktiverte dyrkede celler ble tatt på henholdsvis dag 1, 5 og 10. Ikke-aktiverte MNCer ble studert som en kontroll. Skalalinje: 50 μm. (B) TEM-analyse av nylig genererte celler gjennom kulturtid viser at organeller av modne celler (D1) gradvis forsvinner (D8), noe som fører til generering av helt avdifferensierte celler som ligner ESC. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Neuro re-differensiering av BD-PSCer. (A) BD-dedifferensierte celler ble plassert i ornitin/lamininbelagte kulturretter og dyrket i 30 dager som beskrevet i protokollen. Mikrografer tas på henholdsvis dag 4, 8, 10, 14 og 30, etter å ha vokst i nevronale differensieringsforhold. De fleste cellene i kulturen endret sin morfologi fra små sfæriske former til større, langstrakte former og i noen tilfeller forgrenede celler. Skalastang: 100 μm. (B) BD-dedifferensierte celler ble dyrket i 16 dager i nevronmedie, festet i glutaraldehyd og EM-analyse utført som beskrevet i protokollseksjonen. Cellelegemet og prosessene i disse cellene viste en høyere kompleksitet enn for undifferentiated celle når det gjelder organeller og cytoskeleton som presenterer en høy tetthet av stablet sisterne av grov endoplasmisk retikulum og rikelig bunter av aktinfilamenter (a, b). I motsetning til ikke-likegyldige BD-celler, celler vokser i differensieringsmedier ofte etablerte celle-til-celle-kontakter. Noen av disse spesialiserte kontaktene involverte cellulær kropp (c), mens andre involverte cellulære prosesser på nevrittlignende måte (d). Skalastenger: (a) 20 μm; (b-d), 500 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Immunofenotyping av nylig genererte nevronceller. BD-dedifferensierte celler ble dyrket som beskrevet i protokollen i 16 dager, og immunocytokjemianalyse ble utført ved hjelp av antistoffer mot nevronmarkører nestin, GFAP, MAP2 og Tuj1. Vist er brightfield mikrografer av re-differensierte celler ledsaget av immunfluorescence bilder med DAPI som kjernefysisk farging, samt farging med relevante antistoffer. Avbildet er feltene som viser en bestemt befolkning som uttrykker en av de spesifikke nevronale markørene som er karakteristiske for bestemte linjer. Skala bar: 100 μm. Kontrollen er presentert i supplerende figur 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: BD-dedifferensierte celler kontroll. BD-avledede undifferentiatedcells ble dyrket i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium supplert med 10% FBS i 16 dager som beskrevet i protokollen og farget med antistoff mot nestin GFAP, Tuj1 og MAP2. DAPI ble brukt til kjernefysisk farging. Skalalinje: 100 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ikke-GM-metoden for omprogrammering av menneskelige celler beskrevet i dette arbeidet er basert på membran-til-kjerneaktivering av signalmaskiner bak GPI-tilknyttede humane membranglykoprotein som initierer prosessen med dedifferensiasjon som fører til ex vivo-generasjonen og utvidelse av selvfornyende PSCer hentet fra ikke-manipulert menneskelig perifert blod. Disse cellene når de dyrkes i passende medier, er i stand til å differensiere seg til celler som tilhører forskjellige bakterielag6.
Dataene som presenteres i dette arbeidet viser at GM-frie genererte BD-PSCs celler når de dyrkes i et nevronalt differensieringsmedier, fikk en helt annen fenotype, med langstrakte former, høyere utvikling av organellene og etablerte mer komplekse interaksjoner mellom celler. Videre innebærer re-differensiering ved hjelp av tilstand beskrevet her, nevronal differensiering mot ulike nevronale avgrensninger.
For å oppnå det optimale antallet og den beste kvaliteten på omprogrammerte celler for bruk i re-differensieringsstudier, kan ferske MNC-preparater være fordelaktige sammenlignet med frosne MNC-preparater. Metoden for immunomagnetisk sortering som skilte BD-PSCer fra terminalt differensierte celler som ikke kan omprogrammeres ved denne metoden, kan være ufullstendig og kreve at prosedyren gjentas, noe som er svært stressende for celler og resulterer i deres for tidlige dødsfall.
Det kritiske trinnet i protokollen er knyttet til antall og kvalitet på MNCer som kan oppnås ved hjelp av metoden som er beskrevet. Modifikasjon av nevrale differensieringsmedier samt kulturtid kan forbedre differensieringspotensialet til BD-PSCer, og dermed føre til generering av spesifikke typer nevronceller.
En begrensning av denne metoden er den ikke-teratogene naturen til disse omprogrammerte cellene, da det ikke er mulig å generere cellelinjene med denne metoden. Når de avdifferensierte cellene har nådd sluttfasen, blir de for det meste passivitet, og en ny del av MNCene må dedifferensieres igjen for å få et høyere antall BD-PSCer.
Omprogrammering beskrevet her er avhengig av antistoff krysskobling aktivering på overflaten av blod forfedre celler. Dette paradigmet gir mange potensielle fordeler med hensyn til klinisk sikkerhet sammenlignet med GM-metoder. Målet om å oppnå autologe stamceller for generering av nevrale vev(er) kan oppnås ved minimalt ex vivo-manipulasjon; derfor sterkt antyder at denne celleterapien kan være en lovende kandidat for effektiv og sikker klinisk tilnærming i nevrologi.
Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom og cerebral iskemi er blant sykdommene med den høyeste sosiale og økonomiske byrden for samfunnet i Europa og over hele verden. Byrden av nevrodegenerative lidelser forventes å øke med den aldrende befolkningen, bli et viktig sosioøkonomisk problem og skape et desperat behov for svar på problemet. Den presenterte metoden åpner en ny mulighet for ikke-invasive terapeutiske strategier ved å bruke en enkel og kostnadseffektiv prosedyre for å generere egnede autologe stamcellepopulasjoner som holder et håp for kur av for tiden intractable nevrologiske sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Den tilsvarende forfatteren erklærer at hun er en patentinnehaver relatert til Novel Human GPI-tilknyttede Protein, samt at hun var med på å grunnlegge og jobber for ACA CELL Biotech. De andre forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dedikert til minnet om Dr. Rainer Saffrich.
Forfatterne er spesielt takknemlige for José Manuel García-Verdugo og Vicente Herranz-Pérez for å utføre EM-eksperimenter og analyse ved Laboratoriet for komparativ nevrobiologi, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, University of Valencia, CIBERNED, Valencia, Spania, som ble støttet av forskningsmidler fra Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. Resten av dette arbeidet ble støttet av ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
- Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
- Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
- Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
