Summary
Apresentamos um método geneticamente livre de modificações (livre de GM) para obter células com um fenótipo neuronal de células sanguíneas periféricas reprogramadas. A ativação de uma via de sinalização ligada à nova proteína ligada ao GPI humano revela um método eficiente livre de GM para a obtenção de células-tronco pluripotentes humanas.
Abstract
Muitas doenças neurológicas humanas são causadas pela degeneração de neurônios e células gliais no cérebro. Devido a limitações em estratégias farmacológicas e outras terapêuticas, atualmente não há cura disponível para o cérebro ferido ou doente. A substituição celular aparece como uma estratégia terapêutica promissora para condições neurodegenerativas. Até hoje, as células-tronco neurais (NSCs) foram geradas com sucesso a partir de tecidos fetais, células embrionárias humanas (ES) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC). Um processo de desdiferente foi iniciado pela ativação da nova glicoproteína ligada ao GPI humano, que leva à geração de células-tronco pluripotentes. Essas células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs) diferenciam in vitro em células com um fenótipo neural, como mostrado por microscopia de campo brilhante e imunofluorescência. A análise ultraestrutural dessas células por meio da microscopia eletrônica confirma sua estrutura primitiva, bem como morfologia neuronal e características subcelulares.
Introduction
O desenvolvimento de métodos básicos e pré-clínicos de pesquisa de células-tronco incentiva a aplicação clínica de terapias baseadas em células-tronco para doenças neurológicas. Tal terapia potencial depende criticamente do método de geração de células neurais humanas que leve à recuperação funcional1.
As células-tronco neurais (NSCs) se auto-renovam e se diferenciam em novos neurônios ao longo da vida em um processo chamado neurogênese adulta. Apenas áreas cerebrais muito restritas abrigam NSCs competentes para gerar neurônios recém-nascidos na idade adulta. Tais NSCs podem dar origem a neurônios maduros, que estão envolvidos no aprendizado e na memória, substituindo assim neurônios perdidos ou danificados. Infelizmente, essas NSCs estão presentes em quantidades restritas e essa neurogênese limitada diminui rapidamente durante o desenvolvimento juvenil2. Portanto, outras fontes de células neurais devem ser consideradas em um objetivo de terapia celular.
Doenças neurológicas degenerativas são difíceis de curar usando abordagens farmacológicas padrão. Novas estratégias terapêuticas para abraçar muitas doenças neurológicas imensuráveis são baseadas em terapias de substituição celular de tecido doente e ferido. O transplante de NSC pode substituir células danificadas e fornecer efeitos benéficos. Outras fontes para a substituição de células neurais incluem células-tronco embrionárias humanas (ESC), que são derivadas da massa celular interna dos blastocistos3,bem como iPSCs4,que têm ampla capacidade de auto-renovação como eSCs e são capazes de se diferenciar em várias linhagens celulares. Os NSCs também podem ser gerados pela reprogramação direta de fibroblastos humanos evitando o estado pluripotente5.
A terapia de reposição celular ainda é uma questão desafiadora. Embora a ESC, fetal ou iPS possa ser uma fonte para a geração de células neuronais para o tratamento de muitas doenças neurológicas incuráveis, a substituição celular de SCs adultos autólogos de tecidos danificados é uma alternativa melhor que contorna preocupações imunológicas, éticas e de segurança.
Ativação da proteína ligada ao GPI humano por ligação de anticorpos via fosforilação de PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN inicia uma dediferenciação de células progenitoras sanguíneas e geração de células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs)6. Essas células se diferenciam in vitro em relação às células neuronais, como confirmado por meio de análise de campo brilhante, imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão (TEM).
Neste trabalho descrevemos a geração livre de BD-PSCs e sua diferenciação bem sucedida em células com fenótipo neuronal.
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Protocol
As aprovações éticas foram obtidas na realização dos experimentos.
1. Isolamento das células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMNCs)
- Certifique-se de que todos os doadores assinaram consentimento informado antes da retirada de sangue em conformidade com as diretrizes institucionais.
- Tome 30 mL de sangue de doadores saudáveis por pessoal médico treinado de acordo com o protocolo padrão.
- Isole pbmncs por mídia gradiente de densidade. Use 10 mL de mídia com 25 mL de 1:1 sangue diluído com soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) e centrífuga a 300 x g por 30 min.
- Isole a camada interfase entre o plasma e a mídia gradiente de densidade por pipetação. Lave as células isoladas com 5 mL de PBS estéril e centrífuga a 300 x g por 10 minutos. Repita duas vezes.
- Conte o número de células por métodos padrão usando uma câmara de contagem.
2. Ativação da glicoproteína ancorada em GPI humano por anticorpos interligados na superfície dos PBMNCs
- Coloque as células mononucleares 6 x10 6 (MNCs) em tubos de 15 mL e realize a interligação de anticorpos incubando as células com anticorpo específico de proteína de membrana ligada ao GPI humano (30 μg/mL) por 30 minutos em PBS com 1% de albumina de soro bovino (BSA) a 37 °C.
- Substitua o meio de incubação pelo meio modificado de Dulbecco da Iscove, suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS).
- Cultivar células em tubos de poliestireno de 15 mL, colocar os tubos em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por 8-10 dias (sem tremer). Em D5, adicione um adicional de 1-2 mL do meio da Iscove complementado com 10% de FBS a cada tubo de 15 mL.
3. Classificação de células dediferentes recém-geradas
- Conte células com um contador celular automatizado (suspensão celular de 18 μL + corante de fluorescência de 2 μL) ou em uma câmara de contagem.
- Suspensão de célula cultivada centrífuga (5-7 x 106) a 300 x g por 10 min e aspirar o supernante resultante com uma pipeta Pasteur estéril.
- Suspenda a pelota celular em 90 μL de PBS pH pré-resfriado 7,2, 0,5% BSA e 2 mM EDTA.
- Adicione contas magnéticas de nano-tamanho positivo CD45 (80 μL) à suspensão celular e incubar no gelo por 15 minutos.
- Lave as células adicionando 2 mL de tampão PBS e centrífuga a 300 x g por 10 min.
- Suspenda as células em 500 μL de buffer PBS.
- Lave a coluna com 500 μL de tampão PBS pré-resfriado e coloque-a no campo magnético.
- Coloque a suspensão celular na coluna e lave-a com 500 μL de tampão PBS (duas vezes) e o fluxo de centrífuga contendo células CD45 negativas. Recolhê-los no meio de Iscove complementado com 1% de BSA.
- Conte as células na câmara de contagem.
4. Preparar pratos de cultura celular para diferenciação neuronal de células-tronco recém-geradas
- Cubra os vasos de cultura com poli-L-ornithine e laminina para o crescimento de células neuronais.
- Coloque as tampas de vidro em placas de 4 poços e cubra-as com 1:5 poli-L-ornithine diluída (0,1 mg/mL em ddH2O) em ddH2O. Coloque as tampas em uma incubadora de 37 °C por 1 h. Em seguida, lave com ddH2O.
- Descongele lentamente laminina (0,5-2,0 mg/mL) e adicione ao topo das tampas. Incubar a 37 °C por 2 h.
- Prepare o meio de indução neural N2 composto por 49 mL de D-MEM/F12, 500 μL de suplemento N2, 400 μL de aminoácidos não essenciais (NEAA), solução básica de FGF a 20 ng/mL de concentração final (preparada a partir de 100 μg/mL solução de estoque) e heparina em 2 ng/mL de concentração final.
- Remova o excesso de laminina por pipetação e adicione n2 médio neuronal aos pratos de cultura.
5. Cultivo de células sanguíneas dediferentes neuronais
- Cultura CD45 células negativas derivadas de BD em tampas de vidro revestidas de laminina/ornitina por 2 dias em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 no meio N2 para iniciar uma diferenciação neuronal de células recém-geradas por BD.
- Células de cultura ainda em meio de diferenciação neuronal consistindo de 48 mL de meio neurobásal, 500 μL de L-glutamina, 1 mL de Suplemento B27, 500 μL de NEAA, 50 μL de fator neurotrófico recombinante derivado do glial humano (GDNF) a 5 μg/250 μL em PBS/0,1% BSA, e 50 μL de cérebro humano recombinante fator neurotrófico derivado (BDNF) a 5 μg/200 μL em PBS/0,1% BSA e 50 μL de solução de ácido ascórbico 2,9 g/50 mL em PBS. Coloque as placas em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
6. Análise de microscopia de imunofluorescência de células neurais derivadas do sangue
- Cultue as células como descrito acima por 16 dias e remova a mídia.
- Incubar com fixação pré-aquecida composta por 75 mL de água estéril, 4 g de paraformaldeído. Adicione 10 N NaOH conforme necessário e mexa até que a solução se limpe. Em seguida, adicione 10 mL de PBS 10x, 0,5 mL de MgCl2, 2 mL de 0,5 M EGTA e 4 g de sacarose. Titrate para pH 7.4 com 6 N HCl, e leve a 100 mL de água estéril por 15 min, de acordo com Marchenko et al.7.
- Descarte o fixador e lave as células 3 vezes por 5 minutos cada vez. Adicione imediatamente uma solução Triton X de 0,3% recém-feita e permeabilize as células por 5 minutos. Lave 3 vezes com PBS e adicione uma solução de bloqueio feita pela PBS e 5% BSA.
- Bloqueie as células à temperatura ambiente em uma placa de roqueiro por 1 hora.
- Prepare a diluição apropriada dos anticorpos em 1% BSA/PBS e incuba as células com diluições de anticorpos na placa de roqueiro por 1,5 h à temperatura ambiente. Lave as células 3 vezes com PBS por 5 minutos cada, incuba as células com DAPI e monte as tampas com mídia de montagem para visualização em um microscópio.
NOTA: Os anticorpos diretamente rotulados utilizados neste experimento estão listados na Tabela de Materiais.
7. Análise de microscopia eletrônica de transmissão de células recém-geradas
- Seme as células para TEM em lâminas de câmara de 8 poços.
- Fixar as células em 3,5% glutaraldeído por 1 h a 37 °C, pós-fixação em 2% OsO4 por uma hora adicional à temperatura ambiente e manchar em acetato de uranyl de 2% no escuro a 4 °C por 2 h 30 min.
- Finalmente, enxágüe as células em água destilada, desidrate-a em etanol e incorpore resina epóxi durante a noite. No dia seguinte, transfira as amostras para um forno de 70 °C por 72 h para endurecimento de resina.
- Retire as culturas celulares incorporadas do deslizamento de câmara e cola para blocos de araldito.
- Corte seções semifinais em série (1,5 μm) com uma máquina, monte em lâminas de vidro e manche levemente com 1% de azul toluidina.
- Cole seções semifinas selecionadas para blocos de araldito e desvinculá-las do deslizamento de vidro por congelamento repetido (em nitrogênio líquido) e descongelamento.
- Prepare seções ultrathinas (0,06-0,08 μm) com uma máquina e contraste ainda maior com citrato de chumbo.
- Obtenha micrografias usando microscópio de varredura eletrônica com câmera digital.
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Representative Results
Os resultados fornecem evidências de que este novo método livre de GM é capaz de reverter células progenitoras de sangue para seu estado mais primitivo sem agir diretamente sobre o genoma humano.
Já mostramos anteriormente que o crosslinking de anticorpos específicos ligados ao GPI inicia-se via PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulation de genes altamente conservados de desenvolvimento relevantes como WNT, NOTCH e C-Kit, iniciando assim um processo de desdiferenteização que leva ao primeiro passo para a geração de HSCs e um segundo e final para uma geração de BD-PSCs6,8.
Culturas MNC ativadas foram submetidas à classificação imunomagnética usando microesferas CD45. Células sanguíneas maduras que não podem ser reprogramadas com este método (por exemplo, células positivas CD45) foram mantidas na coluna, enquanto a fração negativa contendo células reprogramadas (células negativas CD45) foi utilizada para a geração de várias células de linhagem neuronal.
Estudamos pela primeira vez os aspectos morfológicos das células periféricas de dediferentes de BD por meio da luz e do TEM. Como mostrado na Figura 1, o anticorpo glicoproteína ancorado em GPI específico de interligação de MNCs humanos gera uma nova população crescente de células(Figura 1A). Analisamos essas células por meio de TEM. As células dediferentes de BD são pequenas em tamanho e mostram as características de células agranulares imaturas, com gradualmente menos organelas e grandes núcleos com cromatina condensada, semelhante às ESCs(Figura 1B). Culturas não tratadas mostraram tendência para um desaparecimento gradual.
As células negativas BD-CD45 foram submetidas à diferenciação neuronal em duas etapas. Iniciamos a diferenciação para as linhagens neuronais, semeando as células negativas CD45 em placas de cultura revestidas de poli-L-ornithine/laminina por 2 dias em n2 médio seguindo cultura em meio de diferenciação neuronal. As imagens de Brightfield foram adquiridas nos dias 4, 8, 10, 14 e 30, respectivamente, após a flexão neuronal das células-tronco geradas pelo BD.
Logo após 4 dias após o início da diferenciação direcionada das células recém-geradas, as primeiras células neuronais com estruturas de ramificação longas poderiam ser detectadas. Observamos as mudanças morfológicas de D2 para D30 com uma estrutura mais complexa, incluindo ramificação, implicando um processo ativo de diferenciação para linhagens neuronais ao longo do período de tempo de cultura(Figura 2). Para confirmar as características neuronais das células reeferentes após a cultivo em meio neuronal por 16 dias, as células foram fixadas de acordo com um protocolo anterior7, e a imunocitoquímica (ICC) foi realizada usando detecção de anticorpos para nestin, proteína ácida fibrilara glial (GFAP), proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2) e beta-tubulina de classe III específica de neurônios (Tuj1).
GFAP é a proteína que constitui uma porção de citoesqueleto em astrócitos representando o principal filamento intermediário de astrócitos maduros. Como mostrado na Figura 3,o anticorpo para GFAP reconhece essas estruturas nas células neuronais recém-geradas, confirmando que os BD-PSCs são capazes de se diferenciar em relação aos astrócitos humanos9.
MAP2 é uma proteína citoesqueleto que se liga a tubuli e estabiliza microtúbulos. É expressa dentro de axônios, dendritos e corpos celulares e essa expressão é tecidual e específica do desenvolvimento. Os resultados da microscopia de imunofluorescência confirmam a expressão dessa proteína em células reeferidas10.
Tuj1 é um típico marcador de célula neuronal. Sua função é estabilizar a microtubili no corpo celular neuronal e nos axônios. Também está implicado no transporte axonal11. Células recém-diferenciadas confirmaram claramente a expressão dessa proteína em D16 ao iniciar a diferenciação neuronal sob a condição descrita aqui.
Nestin foi caracterizado pela primeira vez em NSCs e representa uma proteína neuro epitelial de células-tronco, que pertence à proteína de filamento intermediário (IF)12 células progenitoras neuronais distintas de células neuronais mais diferenciadas. Essas proteínas IF são expressas principalmente em células nervosas onde estão envolvidas no crescimento radial do axônio, mas também estão presentes em uma série de tecidos adicionais. Nestin como um marcador de NSCs predominantemente é fracamente expresso nas células já no caminho para se diferenciar em linhagens neuronais específicas, pois é o caso de células BD-re-diferenciadas em D16.
Figura 1: Geração de células-tronco dediferentes (pluripotentes). (A) As células mononucleares isoladas de Ficoll foram cultivadas no meio de Iscove suplementado com 10% de FBS. Os micrografos de células cultivadas ativadas foram feitos nos dias 1, 5 e 10, respectivamente. Os MNCs não ativados foram estudados como controle. Barra de escala: 50 μm. (B) Análise TEM de células recém-geradas ao longo do tempo de cultura mostra que organelas de células maduras (D1) desaparecem gradualmente (D8), levando à geração de células completamente dediferentes semelhantes a ESCs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Re-diferenciação neuro de BD-PSCs. (A) Células dediferentes de BD foram colocadas em pratos de cultura revestidas de ornitina/laminina e cultivadas por 30 dias, conforme descrito no protocolo. Os micrografos são feitos nos dias 4, 8, 10, 14 e 30, respectivamente, após crescerem em condições de diferenciação neuronal. A maioria das células da cultura mudou sua morfologia de pequenas formas esféricas para formas maiores e alongadas e, em alguns casos, células ramificadas. Barra de escala: 100 μm. (B) As células dediferenciadas BD foram cultivadas por 16 dias em meio neuronal, fixadas em glutaraldeído e análise EM realizadas conforme descrito na seção de protocolo. O corpo celular e os processos dessas células mostraram maior complexidade do que os de células indiferenciadas em termos de organelas e citoesqueletos apresentando uma alta densidade de cisternae empilhada de tiquelum endoplasmático áspero e feixes abundantes de filamentos de actina (a, b). Ao contrário das células BD indiferenciadas, as células que crescem em mídia de diferenciação frequentemente estabelecem contatos célula-célula. Alguns desses contatos especializados envolveram corpo celular (c), enquanto outros envolveram processos celulares de forma neurita (d). Barras de escala: (a) 20 μm; (b-d), 500 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imunofenoftipagem de células neuronais recém-geradas. As células dediferentes foram cultivadas como descrito no protocolo por 16 dias e a análise imunocitoquímica foi realizada utilizando anticorpos para marcadores neuronais nestin, GFAP, MAP2 e Tuj1. São mostrados micrografos de campo brilhante de células re-diferenciadas acompanhadas de imagens de imunofluorescência com DAPI como coloração nuclear, bem como manchas com anticorpos relevantes. São retratados os campos que mostram uma determinada população que expressa um dos marcadores neuronais específicos característicos de linhas específicas. Barra de escala: 100 μm. O controle é apresentado na Figura Suplementar 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Controle de células dediferentes bD. Células nãodiferentes derivadas do BD foram cultivadas no meio modificado de Dulbecco de Iscove complementado com 10% de FBS por 16 dias, conforme descrito no protocolo e manchado com anticorpos para nestin GFAP, Tuj1 e MAP2. Dapi foi usado para coloração nuclear. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
O método não-GM de reprogramação de células humanas descrito neste trabalho baseia-se na ativação da membrana ao núcleo de máquinas de sinalização por trás da glicoproteína de membrana humana ligada ao GPI que inicia o processo de desdiferenciação levando à geração ex vivo e à expansão de PSCs auto-renovados obtidos a partir de sangue periférico humano não manipulado. Essas células quando cultivadas em meios apropriados são capazes de se diferenciar em células pertencentes a diferentes camadas germinativas6.
Os dados apresentados neste trabalho mostram que as células BD-PSCs geradas sem GM quando cultivadas em uma mídia de diferenciação neuronal adquiriram um fenótipo completamente diferente, com formas alongadas, maior desenvolvimento de suas organelas e interações mais complexas entre as células. Além disso, a reeferição utilizando a condição descrita aqui implica diferenciação neuronal em relação a várias linhagens neuronais.
Para obter o número ideal e a melhor qualidade das células reprogramadas para seu uso em estudos de re-diferenciação, preparações frescas de MNC podem ser vantajosas quando comparadas com as preparações de MNC congeladas. O método de triagem imunomagnética que separou os BD-PSCs de células terminais diferenciadas que não podem ser reprogramadas por este método pode ser incompleto exigindo que o procedimento seja repetido, o que é muito estressante para as células e resulta em suas mortes prematuras.
O passo crítico dentro do protocolo diz respeito ao número e qualidade dos MNCs que poderiam ser obtidos pelo método descrito. A modificação da mídia de diferenciação neural, bem como o tempo de cultura, podem melhorar o potencial de diferenciação dos BD-PSCs, levando assim à geração de tipos específicos de células neuronais.
Uma limitação desse método é a natureza não teratogênica dessas células reprogramadas, pois não é possível gerar as linhas celulares com este método. Uma vez que as células dediferentes tenham chegado ao estágio final, a da pluripotência, elas se tornam principalmente quiescentes e uma nova porção de MNCs deve ser dediferenciada novamente para obter um número maior de BD-PSCs.
A reprogramação descrita aqui depende da ativação de crosslinking de anticorpos na superfície das células progenitoras sanguíneas. Esse paradigma proporciona inúmeras vantagens potenciais em relação à segurança clínica quando comparado aos métodos GM. O objetivo de alcançar células-tronco autólogas para geração de tecidos neurais pode ser alcançado pela manipulação minimamente ex vivo; portanto, sugerindo fortemente que esta terapia celular poderia ser um candidato promissor para uma abordagem clínica eficiente e segura na neurologia.
Doença de Parkinson, Doença de Alzheimer e isquemia cerebral estão entre as doenças com maior carga social e econômica para a sociedade na Europa e no mundo. Espera-se que a carga de distúrbios neurodegenerativos aumente com o envelhecimento da população, tornando-se um importante problema socioeconômico e criando uma necessidade desesperada de uma resposta ao problema. O método apresentado abre um novo caminho para estratégias terapêuticas não invasivas, utilizando um procedimento simples e econômico para a geração de populações de células-tronco autólogas adequadas que têm esperança para a cura de doenças neurológicas atualmente intratáveis.
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Disclosures
A autora correspondente declara que é detentora de patentes relacionadas à Nova Proteína Ligada ao GPI Humano, bem como co-fundou e trabalha para a ACA CELL Biotech. Os outros autores declaram que não têm conflito de interesses.
Acknowledgments
Dedicado à memória do Dr. Rainer Saffrich.
Os autores são especialmente gratos a José Manuel García-Verdugo e Vicente Herranz-Pérez por realizarem experimentos e análises em EM no Laboratório de Neurobiologia Comparada, Instituto Cavanilles de Biodiversidade e Biologia Evolutiva, Universidade de Valência, CIBERNED, Valência, Espanha, que foi apoiado por financiamento de pesquisa do Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. O resto deste trabalho foi apoiado pela ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Alemanha.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
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