Summary
Aqui apresentamos um protocolo para visualizar a correlação espacial do peptídeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP)-fibras nervosas imunoreativas e vasos sanguíneos na duracolia craniana usando imunofluorescência e histoquímica fluorescente com CGRP e fábulina, respectivamente. Além disso, a origem dessas fibras nervosas foi retrógrada traçada com um rastreador neural fluorescente.
Abstract
O objetivo deste estudo foi examinar a distribuição e a origem do peptídeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP)-fibras sensoriais imunoreativas do duracococa craniano utilizando imunofluorescência, reconstrução tridimensional (3D) e técnica de rastreamento retrógrado. Aqui, as fibras nervosas e vasos sanguíneos foram manchados usando imunofluorescência e técnicas histoquímicas com CGRP e fábula fluorescente, respectivamente. A correlação espacial das fibras nervosas e vasos nervosos transmotivos cgrp-immuoreactive dural e vasos sanguíneos foram demonstradas pela reconstrução 3D. Enquanto isso, a origem das fibras nervosas imunoreativas CGRP foram detectadas pela técnica de rastreamento neural com fluorogold (FG) da área ao redor da artéria meningeal média (MMA) na duracaca craniana mater à gânglio triginal (TG) e gânglios de raiz dorsal cervical (C) (DRGs). Além disso, as características químicas dos neurônios rotulados por FG nos TG e DRGs também foram examinadas juntamente com CGRP utilizando imunofluorescências duplas. Aproveitando a amostra transparente de montagem integral e a reconstrução 3D, mostrou-se que as fibras nervosas imunoreativas CGRP e as artérias rotuladas por fálico funcionam juntas ou formando separadamente uma rede neurovascular dural em uma visão 3D, enquanto os neurônios rotulados por FG foram encontrados nos ramos oftálmico, maxilar e mandibular de TG, bem como os IPS C2-3 ao lado da aplicação do rastreador em que alguns dos neurônios rotulados por FG apresentavam expressão CGRP-imunoreactive. Com essas abordagens, demonstramos as características distributivas das fibras nervosas cgrp-imunoreativas ao redor dos vasos sanguíneos na dura-duracaca craniana, bem como a origem dessas fibras nervosas de TG e DRGs. Do ponto de vista da metodologia, pode fornecer uma referência valiosa para a compreensão da complicada estrutura neurovascular da dura mater craniana sob a condição fisiológica ou patológica.
Introduction
A dura-máter craniana é a camada mais externa de meninges para proteger o cérebro e contém vasos sanguíneos abundantes e diferentes tipos de fibras nervosas1,2. Muitos estudos têm demonstrado que a dura-dura-maternidade craniana sensibilizada pode ser o fator-chave que leva à ocorrência de dores de cabeça, envolvendo a vasodilatação anormal e a inervação3,4,5. Assim, o conhecimento da estrutura neurovascular na dura-escola craniana é importante para a compreensão da patogênese das dores de cabeça, especialmente para a enxaqueca.
Embora a innervação dura tenha sido previamente estudada com a imunohistoquímica convencional, a correlação espacial das fibras nervosas e vasos sanguíneos na duracolia craniana foram menos estudadas6,7,8,9. Para revelar a estrutura neurovascular dural com mais detalhes, peptídeos relacionados a genes de calcitonina (CGRP) e faloideína foram selecionados como marcadores para, respectivamente, coloração das fibras nervosas durais e vasos sanguíneos na dura-dura craniana de todo o monte com imunofluorescência e histoquímica fluorescente10. Pode ser uma escolha ideal para obter uma visão tridimensional (3D) da estrutura neurovascular. Além disso, fluorogold (FG) foi aplicada na área em torno da artéria meningeal média (MMA) na dura-dura craniana para determinar a origem das fibras nervosas imunorreativas CGRP, e rastreada à gânglio trigeminal (TG) e gânglios de raiz dorsal (DRGs) cervicais (DRGs), enquanto os neurônios rotulados pelo FG foram examinados juntamente com CGRP usando imunofluorescência.
O objetivo deste estudo foi fornecer uma ferramenta eficaz para a investigação da estrutura neurovascular na dura mater craniana para a inervação CGRP-imunoreactive e sua origem. Aproveitando a dura-dura-montagem transparente e combinando a imunofluorescência, o rastreamento retrógrado, as técnicas confocal e a reconstrução 3D, esperamos apresentar uma nova visão 3D da estrutura neurovascular na dura-duracaca craniana. Essas abordagens metodológicas podem ser ainda mais servidas para explorar a patogênese de diferentes dores de cabeça.
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Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Acupuntura e Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (número de referência D2018-09-29-1). Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Foram utilizados neste estudo 12 ratos machos adultos Sprague-Dawley (peso 220 ± 20 g). Os animais [número de licença SCXK (JING) 2017-0005] foram fornecidos pelos Institutos Nacionais de Controle de Alimentos e Drogas.
1. Innervation of rat cranial dura mater
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Perfusões
- Injetar intraperitoneally uma overdose de solução de tribromoetanol (250 mg/kg) no rato para induzir eutanásia.
- Uma vez que a respiração pare, a perfuse transcardial com 100 mL de soro fisiológico normal de 0,9%, seguida por 250-300 mL de 4% de paraformaldeído em 0,1 M tampão fosfato (PB, pH 7.4).
- Após a perfusão, remova a pele da cabeça e abra o crânio para expor o lado dura e dorsal do cérebro. Em seguida, disseca a dura-máter craniana ao longo do tronco cerebral à lâmpada olfativa no padrão de montagem total(Figura 1). Realize a pós-fixação em 4% paraformaldeído por 2h e, em seguida, crioproteto em 25% de sacarose em 0,1 M PB por mais de 24h a 4 °C.
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Imunohistoquímica de fluorescência para rotulagem de CGRP e fálico
NOTA: Uma combinação de coloração fluorescente de CGRP e fábula foi aplicada para revelar a correlação espacial das fibras nervosas durais e vasos sanguíneos na dura-dura do rato no padrão de montagem total.- Enxágüe a dura-m de 0,1 M PB por cerca de 1 min.
- Incubar o dura mater em uma solução de bloqueio contendo 3% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 em 0,1 M PB por 30 min.
- Transfira o dura mater para o anticorpo anti-CGRP do mouse (1:1000) em 0,1 M PB contendo 1% de soro normal de burro e 0,5% Triton X-100 durante a noite a 4 °C11.
- Lave a dura mater três vezes em 0,1 M PB no dia seguinte.
- Incubar o dura mater em uma solução mista de anticorpo médio Alexa Fluor 488 (1:500) e falo 568 (1:1000) em 0,1 M PB contendo 1% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 por 1,5 h em temperatura ambiente (26 °C).
- Lave a dura mater três vezes em 0,1 M PB.
- Apare as bordas e monte-as em slides de microscópio (ver Tabela de Materiais).
- Coloque as tampas com 50% de glicerina antes da observação.
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Observação e gravação
- Observe as amostras fluorescentes sob um microscópio fluorescente ou um sistema de imagem confocal.
- Pegue as imagens de toda a dura-montagem por um microscópio fluorescente equipado com uma câmera digital (4x, NA: 0.13), e use um tempo de exposição de 500 ms. Os mosaicos de imagem do dura mater foram completados com um software de microscópio fluorescente (ver Tabela de Materiais).
- Faça imagens das fibras nervosas imunoreativas CGRP e vasos sanguíneos rotulados com falioidina na dura mater usando um microscópio confocal. Os comprimentos de onda de excitação e emissão foram de 488 nm (verde) e 594 nm (vermelho). O pinhole confocal é de 110 (20x) e 105 μm (40x). A resolução da captura de imagem é de 640 x 640 pixels.
- Capture 20 imagens em quadros de 2 μm de cada seção de 40 μm de espessura e realize uma integração de imagem em foco único com um sistema de software associado ao processamento de imagens confocal para análise 3D da seguinte forma: Defina o Plano Focal iniciar | Set End focal plane | Definir o tamanho do passo | Escolha | padrão de profundidade | de captura de imagens Série Z.
- Use um software de edição de fotos para ajustar o brilho e o contraste das imagens para otimizar a visualização. Preste atenção para não remover nenhum dado das imagens.
2. Estudo de rastreamento retrógrado com FG
- Procedimentos cirúrgicos
- Determine a área de coordenação de interesse em rato cranial dura mater.
- Prepare uma micro-seringa de 10 μL e teste-a com parafina líquida.
- Anestesiar os ratos com solução de tribromoetanol (150 mg/kg) via injeção intraperitoneal. Verifique a profundidade na anestesia pela falta de resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo.
- Raspe a cabeça do rato com uma navalha elétrica.
- Coloque as barras de ouvido cegas no rato e coloque-o no dispositivo estereotaxico. Em seguida, coloque o porta-boca e aplique pomada oftálmica nos olhos.
- Limpe o local cirúrgico da pele da cabeça usando 10% de iodo povidone seguido de 75% de etanol.
- Faça uma incisão ao longo da linha média do couro cabeludo.
- Remova sem rodeios e tecidos musculares do crânio usando aplicadores estéreis com ponta de algodão(Figura 1A).
- Faça um pequeno furo (~5-7 mm) usando uma broca de rebarba com um bit de ponta redonda (#106) nos ossos parietal esquerdo e temporal acima do MMA12, e certifique-se de que a dura-moria craniana foi mantida intacta(Figura 1B).
- Construa um banco ao redor do orifício com cimento silicato dental para limitar a propagação do rastreador(Figura 1C).
- Adicione 2 μL de 2% FG no orifício ao redor do MMA com uma micro-seringa de 10 μL(Figura 1D).
- Cubra o buraco com um pequeno pedaço de esponja hemostática.
- Coloque um pedaço de filme de parafina no buraco e sele as bordas com cera óssea para evitar o vazamento de rastreador e para evitar contaminar os tecidos circundantes.
- Sutura a ferida com fio estéril.
- Mantenha os ratos em uma área quente até que eles se recuperem completamente.
- Devolva os ratos de volta às suas gaiolas e adicione um antibiótico e analgésico na água potável.
- Perfusões e seções
- Após 7 dias de sobrevivência, perfundir esses ratos como mencionado acima nos procedimentos da seção 1.1.
- Disseca os DRGs TG e C1-4, depois pós-fixe e crioproteta-los como mencionado acima na seção 1.1.3 (Figura 1F).
- Corte os TG e DRGs na espessura de 30 μm em um sistema de microtome criostat na direção sagital e montado em lâminas de vidro revestidas de silano.
- Imunofluorescências duplas para rotulagem FG e CGRP nos TG e DRGs
NOTA: Embora a rotulagem FG possa ser observada diretamente com iluminação UV sob lâmpada de mercúrio sem coloração adicional13,14,15,16, os neurônios rotulados com FG foram examinados posteriormente em TG e DRGs cervicais utilizando imunofluorescências duplas com FG e CGRP para revelar as origens das fibras nervosas dural CGRP-imunoreactive nos TG e DRGs.- Circule as seções com a caneta histoquímica.
- Incubar as seções por 30 min em uma solução de bloqueio contendo 3% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 em 0,1 M PB.
- Transfira as amostras para a solução de coelhinho anti-fluorogold (1:1000) e anticorpo anti-CGRP do rato (1:1000) em 0,1 M PB contendo 1% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 durante a noite a 4 °C.
- Lave as seções três vezes em 0,1 M PB no dia seguinte.
- Incubar em uma solução mista de anti-coelho de burro Alexa Fluor 594 (1:500) e anti-mouse de burro Alexa Fluor 488 (1:500) anticorpo secundário em 0,1 M PB contendo 1% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 por 1,5 h em temperatura ambiente.
- Lave e aplique tampas nas seções como os procedimentos nas etapas 1.2.6 e 1.2.8.
- Observação e gravação
- Tire imagens dos neurônios rotulados por FG em TG e DRGs sob iluminação UV por microscópio fluorescente equipado com uma câmera digital.
- Capture imagens dos neurônios rotulados FG e CGRP em TG e DRGs sob um microscópio fluorescente equipado com uma câmera digital.
- Use o software de edição para ajustar o brilho e o contraste das imagens e adicionar rótulos nas imagens.
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Representative Results
Estrutura neurovascular da dura mater craniana
Após a coloração histoquímica imunofluorescente e fluorescente com CGRP e faloidina, as fibras nervosas imunoreativas CGRP e as artérias dural e tecidos conjuntivos foram claramente demonstradas em toda a duraza mater de todo o monte em um padrão 3D(Figura 2C, D,E,F). Mostrou-se que tanto as fibras nervosas espessas quanto as finas CGRP-imunoreactive funcionam em paralelo às artérias durais, ao redor da parede vascular, ou entre os vasos sanguíneos(Figura 2D, E,F). Tirando vantagens da reconstrução 3D, a morfologia das artérias durais e a correlação espacial das fibras nervosas e arteriolas dural CGRP-imunoreactive poderiam ser claramente demonstradas de diferentes perspectivas.
Neurônios retrógrados nos TG e DRGs
Sete dias após a aplicação de FG na região do MMA na dura-dura do rato(Figura 3A),os neurônios rotulados por FG foram detectados em TG e DRGs cervicais no lado ipsilateral da aplicação do rastreador, que foi observado diretamente sob a iluminação UV da microscopia fluorescente (Figura 3B,C). Neurônios rotulados por FG foram encontrados em todos os três ramos de TG com maior concentração nas divisões oftálmica (V1) e maxilar (V2), e com menos na divisão mandibular (V3)(Figura 3B). Enquanto isso, alguns dos neurônios rotulados por FG também foram observados nos DRGs C2-3(Figura 3C).
Além disso, também foram realizadas imunofluorescências duplas com FG e CGRP nas seções de TG e DRGs cervicais. De acordo com o diâmetro dos neurônios imunoretivos CGRP em TG e DRGs, a maioria deles foi encontrada principalmente nos neurônios sensoriais de pequeno e médio diâmetro (<50 μm). Alguns desses tipos de neurônios imunoretivos CGRP também foram rotulados com FG nos DRGs TG e C2-3, indicando que as fibras nervosas imunorreativas CGRP na dura-seca craniana se originaram dessas subpopulação de neurônios sensoriais nos TG e DRGs(Figura 4).
Figura 1: Fotografias das principais visões experimentais do presente estudo. (A) Uma incisão ao longo da linha média do couro cabeludo. (B) Um buraco acima da dura-máter craniana mostrando a artéria meningeal média (MMA). (C) Um pequeno banco ao redor do orifício circulou com cimento de silicato dental para a aplicação de rastreador na duracaria craniana. (D) Aplicação de fluorogold (FG) no orifício com micro-seringa. (E) A dura-montagem transparente dura mater. (F) A visão externa do gânglio trigêmeo (TG). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Correlação entre peptídeos relacionados ao gene de calcitonina (CGRP)-fibras nervosas imunoreativas e fáquias (Pha) rotuladas arterioles no conjunto cranial dura mater. (A) A dura-montagem transparente dura mater. (B) A dura-montagem inteira foi achatada e montada no slide. (C) Distribuição de fibras nervosas imunorreativas CGRP e vasos sanguíneos rotulados com Pha ao longo da artéria meningeal média (MMA). (D,E) As fotos ampliadas das mesmas áreas de d e e no painel C. (F) As imagens ampliadas e ajustadas do painel E com o quadro em um padrão 3D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Distribuição de neurônios rotulados fluorogold (FG) no gânglio trigêmeo (TG) e gânglio raiz dorsal (C) sob iluminação UV. (A) A região de dura mater com aplicação FG. (B) Distribuição de neurônios rotulados por FG nos ramos oftálmico (V1), maxilar (V2) e mandibular (V3) do TG. (C) Distribuição de neurônios rotulados por FG distribuídos no C2 DRG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: As fotografias representativas que mostram os neurônios sensoriais rotulados em gânglio trigêmeo (TG) e gânglio raiz dorsal cervical (DRG) utilizando imunofluorescências duplas com fluorogold (FG) e peptídeo relacionado ao gene calcitonina (CGRP). CGRP, e tanto FG quanto CGRP foram demonstrados em vermelho, verde e amarelo, respectivamente em TG (A) e DRG (B). (A1-B1), (A2-B2): Os painéis A e B foram apresentados separadamente com rotulagem FG (A1, B1) e cgrp-labeling (A2, B2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, demonstramos com sucesso a distribuição e a origem das fibras nervosas imunoreativas CGRP no dura-pena craniano usando imunofluorescência, reconstrução 3D e abordagens de rastreamento neural com anticorpo CGRP e rastreador neural FG, fornecendo as evidências histológicas e químicas para entender melhor a rede neurovascular dural.
Como era conhecido, o CGRP desempenha um papel crítico na patogênese da enxaqueca4,17. Mostrou-se que o aumento do CGRP pode levar à vasodilatação e inflamação neurogênica para causar a sensibilização periférica e central ao longo da via trigêmea4,18. As fibras nervosas imunoreativas CGRP pertencem aos axônios sensoriais peptidericos nãoomiados responsáveis pelo transporte de sinais nociceptivos19. Sendo consistente com estudos anteriores, aqui, demonstramos claramente a distribuição das fibras nervosas imunoreativas CGRP na duraza craniana e traçamos sua origem a partir de neurônios sensoriais de pequeno e médio diâmetro nos TG e DRGs. Essas estruturas celulares podem ser as fontes para sintetizar e liberar CGRP. Por outro lado, a falooidina é uma sonda específica para atoína filamentosa (F-actin) que é abundante nas células musculares e endoteliais lisas. Como candidato adequado, a falooidina foi utilizada para rotular as estruturas vasculares e tecidos conjuntivos10,20,21. Nosso estudo recente mostrou que, em contraste com a actina muscular lisa alfa e CD31, a faloidina é mais confiável e sensível para coloração de artérias dural, e é o ideal para combinar com CGRP para demonstrar a rede neurovascular craniana em detalhes, que foi publicada em10,21.
A técnica de rastreamento do trato neural é uma ferramenta importante para investigar a origem neural e o término. No presente estudo, a FG foi utilizada para rastreamento retrógrado da origem das fibras nervosas imunoreativas CGRP no dura-pena craniano. Uma vez que a dura-dura-escola craniana é uma membrana fina, o rastreador não pode ser aplicado convenientemente pelo caminho da injeção. Em vez disso, fg foi diretamente adicionado à região em torno do MMA na duracolia craniana de acordo com o método que havia sido introduzido anteriormente22,23, mas deve-se tomar cuidado para manter o dura mater intacto. Além disso, o esforço foi feito para evitar o vazamento de FG para os tecidos adjacentes. Como a rotulagem FG pode ser observada diretamente sob a iluminação UV da lâmpada de mercúrio24, por esta abordagem, verificamos o local da aplicação FG; verificou-se que, além da propagação neural, a FG era limitada na região circulada com cimento silicato dental sem contaminar os tecidos circundantes. A outra vantagem é que os neurônios rotulados por FG também podem ser manchados na cor esperada usando imunofluorescência com anticorpo FG, tornando-o mais conveniente para ser usado em conjunto com outros biomarcadores14,15,16. Através deste estudo, comprovamos que a FG não se encaixa apenas no rastreamento retrógrado da inervação dural, mas também é um candidato adequado para combinar com CGRP para determinar as características químicas dos neurônios rotulados por FG.
Deve-se notar aqui que os métodos atuais são preferencialmente utilizados para animais jovens. Na fase inicial do rato, a dura-escola craniana é mais transparente no estilo de montaria. Essa característica torna mais conveniente visualizar a estrutura neurovascular da dura gêmea craniana em um padrão 3D sem tratamento mais transparente.
Em resumo, o presente estudo fornece uma abordagem valiosa para explorar efetivamente a inervação da dura-duracação craniana dos neurônios sensoriais nos DRGs TG e cervical, especialmente o subtipo de neurônios sensoriais de pequeno e médio diâmetro com expressão CGRP-imunoreactive. Do ponto de vista da metodologia, pode fornecer uma referência valiosa para investigar melhor os outros tipos de fibras nervosas na dura-máter craniana, bem como suas origens.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo projeto do Programa Nacional de P&D da China (Project Code nº 2019YFC1709103; nº 2018YFC1707804) e Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Código de Projeto nº 81774211; nº 81774432; nº 81801561).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
References
- Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
- Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
- Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
- Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, Suppl 1 4-16 (2018).
- Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, Pt 3 779-794 (2014).
- Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
- Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
- Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
- Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
- Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
- Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
- Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
- Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
- Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
- Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
- Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
- Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neuroscience. 129, 431-437 (2004).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
