Summary
Wir beschreiben einen einmolekularen Ansatz für Antigen-Antikörper-Affinitätsmessungen mit Massenphotometrie (MP). Das MP-basierte Protokoll ist schnell, genau, verwendet eine sehr geringe Menge an Material und erfordert keine Proteinmodifikation.
Abstract
Messungen der Spezifität und Affinität von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen sind für medizinische und forschungsmedizinische Anwendungen von entscheidender Bedeutung. In diesem Protokoll beschreiben wir die Implementierung einer neuen Einzelmolekültechnik, der Massenphotometrie (MP), zu diesem Zweck. MP ist eine etiketten- und immobilisierungsfreie Technik, die molekulare Massen und Populationen von Antikörpern und Antigen-Antikörper-Komplexen auf einer Einmolekülebene erkennt und quantifiziert. MP analysiert die Antigen-Antikörper-Probe innerhalb von Minuten, um die Bindungsaffinität präzise zu bestimmen und gleichzeitig Informationen über die Stoichiometrie und den oligomeren Zustand der Proteine bereitzustellen. Dies ist eine einfache und einfache Technik, die nur Picomol-Mengen an Protein und keine teuren Verbrauchsmaterialien erfordert. Das gleiche Verfahren kann verwendet werden, um die Protein-Protein-Bindung für Proteine mit einer Molekularmasse von mehr als 50 kDa zu untersuchen. Bei multivalenten Proteinwechselwirkungen können die Affinitäten mehrerer Bindungsstellen in einer einzigen Messung ermittelt werden. Die einmolekulare Messart und die fehlende Etikettierung setzen jedoch einige experimentelle Einschränkungen mit sich. Diese Methode liefert die besten Ergebnisse, wenn sie auf Messungen von submikromolaren Wechselwirkungsaffinitäten, Antigenen mit einer Molekularmasse von 20 kDa oder größer und relativ reinen Proteinproben angewendet wird. Wir beschreiben auch das Verfahren zur Durchführung der erforderlichen Anpassungs- und Berechnungsschritte mit einer Basisdatenanalysesoftware.
Introduction
Antikörper sind zu allgegenwärtigen Werkzeugen der Molekularbiologie geworden und werden sowohl in medizinischen als auch in Forschungsanwendungen ausgiebig eingesetzt. In der Medizin sind sie in der Diagnostik von entscheidender Bedeutung, aber auch ihre therapeutischen Anwendungen werden erweitert und neue Antikörper-basierte Therapien werden ständig entwickelt1,2,3,4. Die wissenschaftlichen Anwendungen von Antikörpern umfassen viele unverzichtbare Labortechniken wie Immunfluoreszenz5, Immunpräzipitation6, Durchflusszytometrie7, ELISA und Western Blotting. Für jede dieser Anwendungen ist es von entscheidender Bedeutung, genaue Messungen der Bindungseigenschaften des Antikörpers, einschließlich Bindungsaffinität und Spezifität, zu erhalten.
Seit der Einführung des ersten kommerziellen Oberflächen-Plasmonresonanz-Instruments (SPR) im Jahr 1990 sind optische Biosensoren zum "Goldstandard" der Antikörpercharakterisierung geworden, aber auch andere Techniken, einschließlich ELISA, werden routinemäßig zur Messung von Antikörperaffinitäten8,9verwendet. Diese Methoden erfordern in der Regel eine Immobilisierung oder Kennzeichnung der analysierten Moleküle, was die Interaktion von Interesse potenziell beeinflussen kann. Sie sind auch relativ langsam und beinhalten mehrere Assay-Schritte, bevor die Ergebnisse für die Datenanalyse gesammelt werden können. Eine kürzlich entwickelte Einzelmolekülmethode, die Massenphotometrie (MP), erkennt Moleküle direkt in Lösung, wenn sie auf der Oberfläche des Mikroskopdeckelslanden 10,11. Die lichtstreuende optische Detektion, die MP verwendet, erfordert keine Proteinkennzeichnung oder -modifikation. Einzelne Proteinmoleküle werden vom interferometrischen Streumikroskop als dunkle Flecken im Bild aufgezeichnet (Abbildung 1D), und mehrere tausend Moleküle können während der einminütigen Datenerfassung12nachgewiesen werden. Das von jedem einzelnen Teilchen erzeugte Signal wird quantifiziert, und sein Kontrastwert (relative Dunkelheit) wird berechnet. Die interferometrischen Kontrastwerte sind proportional zu den Molekularmassen der Proteine, was die Identifizierung gebundener und freier Arten in der Antigen-Antikörper-Mischung ermöglicht. Gleichzeitig misst MP durch zählende molekulare Landeereignisse direkt die Artenpopulationen. Dies gibt MP-basierten Methoden eine einzigartige Fähigkeit, Affinitäten mehrerer Bindungssites unabhängig zu quantifizieren.
Die Bindung der Antigenmoleküle (Ag) an die beiden Bindungsstellen des intakten Antikörpers (Ab) kann wie folgt beschrieben werden:
mit den Gleichgewichtsassoziationskonstanten Ka1 und Ka2 definiert als:
wobei ci und fi die Konzentration und den Anteil der Komponente idarstellen. Die Gesamtantigenkonzentration (cAg)tot kann wie:
Da die Gesamtkonzentrationen des Antikörpers (cAb)tot und antigen (cAg)tot bekannt sind, kann diese Gleichung verwendet werden, um die experimentellen Bauteilfraktionen, die aus den MP-Messungen gewonnen wurden, direkt anzupassen und die Gleichgewichtsassoziationskonstanten Ka1 und Ka2 zu berechnen (siehe Ergänzende Informationen).
Die MP-Daten können auch verwendet werden, um die Kooperative zwischen den beiden Antikörperbindungsstellen11zu schätzen. Bei zwei Antikörperparatopen mit identischen mikroskopischen Bindungskonstanten sind die statistischen Faktoren, die den Prozess der Population des Ab- Ag und Ab Ag2-Komplexe diktieren, dass die scheinbaren makroskopischen Gleichgewichtskonstanten Ka1 und Ka2 nicht numerisch gleich sind und Ka1 = 4Ka2. Daher weisen die experimentellen Werte von Ka1 < 4Ka2 auf eine positive Kooperatoaktivität zwischen den beiden Antikörperbindungsstellen hin. Ebenso weist Ka1 > 4Ka2 auf negative Kooperatonität hin.
MP-Messungen der Antigen-Antikörper-Bindungsaffinität sind schnell und erfordern eine geringe Menge an Material. Die MP-Massenverteilungen, die für Gleichgewichtskonstantenberechnungen verwendet werden, liefern zusätzliche Informationen über die Probeneigenschaften und ermöglichen die Bewertung der Probenreinheit, Oligomerisierung und Aggregation in einem einzigen Experiment. Die gleiche Methode kann verwendet werden, um eine proteinreiche Protein-Protein-Bindung mit hoher Affinität zu messen, und MP ist besonders nützlich für Studien mit multivalenten Proteinwechselwirkungen. Multiproteinkomplexe haben in der Regel große molekulare Massen, optimal für die MP-Erkennung, und Einzelmoleküldaten können verwendet werden, um stoichiometrie zu messen und Affinitäten mehrerer Bindungsstellen gleichzeitig zu berechnen. Diese Informationen sind in der Regel schwierig, mit massenbasierten Methoden zu erhalten.
Ohne Modifikationen eignet sich das aktuelle Protokoll für Messungen von relativ hochaffinen submikromolaren Wechselwirkungen mit Antigenen einer Molekülmasse von 20 kDa oder größer. Für optimale Ergebnisse sollten Proteinvorräte von hoher Reinheit sein, aber es gibt keine spezifischen Pufferanforderungen. Durch die Verwendung von MP kann die Antigen-Antikörper-Bindung in weniger als fünf Minuten beurteilt werden. Die datenerfassung und -analyse, die für genaue Kd-Berechnungen erforderlich sind, kann innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden.
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Protocol
1. Bereiten Sie die Strömungskammern vor
- Reinigen Sie die Glasabdeckungen
- Mit Waschflaschen mit destilliertem Wasser, Ethanol und Isopropanol die 24 mm x 50 mm Abdeckungen in folgender Reihenfolge abspülen: Wasser, Ethanol, Wasser, Isopropanol, Wasser. Trocknen Sie die Abdeckungen mit einem Strom von sauberem Stickstoff. Es ist wichtig, die Abdeckungen von oben nach unten zu spülen, die untere Ecke mit Soft-Tipp-Zange zu halten. Trocknen Sie den Deckelinrutsch in die gleiche Richtung, um eine Kontamination durch die Zange zu vermeiden (Abbildung 2A).
- Spülen Sie die 24 mm x 24 mm Abdeckungen mit destilliertem Wasser, Ethanol und destilliertem Wasser ab. Trocknen Sie die Abdeckungen mit einem Strom von sauberem Stickstoff.
- Identifizieren Sie die Arbeitsseite des Deckels, legen Sie einen Tropfen destilliertes Wasser auf die Oberfläche des sauberen Deckelschlupfes und folgen Sie den Schritten 3.1–3.2 des Protokolls. Normalerweise hat nur eine Seite des 24 mm x 50 mm Coverslipdie die optische Qualität, die für MP-Messungen geeignet ist.
ANMERKUNG: Nach der Fokussierung sollten keine signifikanten Oberflächenunvollkommenheiten erkennbar sein, und der in der Datenerfassungssoftware angezeigte "Signal"-Wert sollte weniger als 0,05 % betragen (Abbildung 1A-C). Die Arbeitsseiten aller Abdeckungen im Karton sind in die gleiche Richtung ausgerichtet. Das gleiche Verfahren sollte verwendet werden, um die Effizienz der Abdeckungsrutschreinigung zu testen.
- Montieren Sie die Strömungskammer
- Positionieren Sie den 24 mm x 24 mm Abdeckzettel auf einem Stück Aluminiumfolie. Legen Sie Streifen aus doppelseitigem Klebeband auf den 24 mm x 24 mm Coverslip, wie in Abbildung 2B dargestellt, und schneiden Sie das Band entlang der Glaskante. Trennen Sie den Deckelvon von der Aluminiumfolie und befestigen Sie ihn an der Arbeitsseite des 24 mm x 50 mm Abdeckzettels(Abbildung 2C).
HINWEIS: Die Kanalgröße kann variieren, es wird jedoch eine Breite von 3 mm–5 mm empfohlen. Breitere Kanäle erfordern größere Sample-Volumes und sehr schmale Kanäle können schwierig zu laden sein. Normalerweise lassen sich auf dem 24 mm x 24 mm Abdecksch leicht zwei parallele Kanäle erstellen. Das Protokoll kann hier angehalten werden.
- Positionieren Sie den 24 mm x 24 mm Abdeckzettel auf einem Stück Aluminiumfolie. Legen Sie Streifen aus doppelseitigem Klebeband auf den 24 mm x 24 mm Coverslip, wie in Abbildung 2B dargestellt, und schneiden Sie das Band entlang der Glaskante. Trennen Sie den Deckelvon von der Aluminiumfolie und befestigen Sie ihn an der Arbeitsseite des 24 mm x 50 mm Abdeckzettels(Abbildung 2C).
2. Bereiten Sie die Antikörper-Antigen-Proben für die Affinitätsmessungen vor
- Filtern Sie mindestens 2 ml des PBS-Puffers mit 0,22 m Spritzenfiltern, um Staubpartikel oder Aggregate zu entfernen. Zentrifugieren Sie den Proteinbestand 10 Minuten lang mit der maximalen Geschwindigkeit der Tischzentrifuge (ca. 16.000 x g).
HINWEIS: PBS ist der empfohlene Puffer für dieses Protokoll, aber MP hat keine besonderen Pufferanforderungen, und andere biologische Puffer sind ebenfalls akzeptabel. Hohe Glycerinkonzentrationen (>10%) und sehr geringe Ionenstärken (Salzkonzentration <10 mM) können das Bild und die Datenqualität beeinflussen und werden nicht empfohlen. - Bestimmen Sie die tatsächlichen Konzentrationen der Antikörper- und Antigenvorräte, indem Sie ihre UV-Absorption von 280 nm messen.
- Berechnen Sie die Messkonzentrationen des Antigen-Antikörper-Gemischs. Wenn der geschätzte Wert der Antikörperbindungsaffinität nicht bekannt ist, planen Sie, eine Probe mit 30 nM Antigen und 20 nM Antikörperkonzentration vorzubereiten. Wenn die ungefähre Affinität bekannt ist, sollten das Antikörper-Antigen-Verhältnis und ihre Konzentrationen entsprechend den erwarteten Kd-Werten optimiert werden. Verwenden Sie die Gesamtantigenkonzentration in der Mischung in Höhe der Summe des erwarteten Kd und die Gesamtantikörperkonzentration in der folgenden Gleichung. Unter der Annahme von Kd1 = Kd2 für die beiden Paratope des Antikörpers führt dies zu vergleichbaren Konzentrationen des freien Antikörpers und der Antikörper-Antigen-Komplexe in der Probe.
Passen Sie die Antikörperkonzentration an, um die Gesamtproteinkonzentration in der Probe im Bereich von 10 nM und 50 nM zu halten. Die besten Ergebnisse werden mit Mischungen mit Antikörperkonzentrationen zwischen 5 nM und 25 nM erzielt.
HINWEIS: MP erkennt Proteine mit einer Molekularmasse von mehr als 40 kDa. Folglich können Probenkonzentrationen von Antigenen mit einer Molekularmasse von weniger als 40 kDa den typischen Grenzwert von 50 nM überschreiten. Bei Konzentrationen von mehr als 100 nM können jedoch auch niedrigmolekulare Antigene die Bildqualität und Genauigkeit der Kd-Bestimmung beeinflussen. - Bereiten Sie 50 l des Antikörper-Antigen-Gemischs in seiner endgültigen Messkonzentration in Schritt 2.3 vor.
HINWEIS: Für die Kd-Bestimmung wird nur eine Probe des Antigen-Antikörper-Gemischs benötigt. Die Vorbereitung mehrerer Proben mit unterschiedlichen Antigen-Antikörper-Verhältnissen kann jedoch dazu beitragen, die Probenkonzentration zu optimieren. Wenn Daten aus mehreren Proben gesammelt werden, können sie über eine globale Passform analysiert werden. - Inkubieren Sie das Antigen-Antikörper-Gemisch(n) ca. 10 min bei Raumtemperatur, damit die Bindungsreaktion ein chemisches Gleichgewicht erreicht. Vermeiden Sie unnötig lange Inkubationszeiten.
HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Bindungskinetik variieren. Um zu bestätigen, dass das chemische Gleichgewicht erreicht wurde, können Probenmessungen zu unterschiedlichen Inkubationszeiten wiederholt werden. Zeitinvariante Kd-Werte zeigen eine ausreichend lange Inkubation an. Eine längere Inkubation kann zu einer signifikanten Proteinadsorption an der Oberfläche der Kunststoff-Laborware und damit zu signifikanten Fehlern bei der Bestimmung der Proteinkonzentration führen. Aus diesem Grund wird Laborware mit geringer Haftung für die MP-Probenvorbereitungempfohlen 13.
3. Sammeln Sie die Massenphotometrie-Daten
- Tragen Sie einen Tropfen Mikroskop-Tauchöl auf das MP-Instrumentenobjektiv auf und legen Sie die montierte Durchflusskammer auf die Mikroskopbühne. Stellen Sie sicher, dass das Öl die Lücke zwischen dem Deckelund dem Ziel überspannt.
- Laden Sie die Durchflusskammer und fokussieren Sie das Massenphotometer.
- Legen Sie 10 l einer sauberen, gefilterten Pufferlösung an einem Ende des in Schritt 1 vorbereiteten Durchflusskammerkanals ab. Flüssigkeit gelangt durch Kapillarwirkung in den Kanal.
- Passen Sie die Z-Position der Bühne an, um das Mikroskop auf die Arbeitsfläche des 24 x 50 mm-Coverslips zu fokussieren.
- Verwenden Sie auf der Registerkarte Fokussteuerung der Datenerfassungssoftware die Tasten Up und Down, um die ersten Anpassungen vorzunehmen.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Schärfe, um die Schärfesignalanzeige anzuzeigen, und verwenden Sie die Schaltflächen für die Einstellung nach oben und unten, um den Schärfewert zu maximieren.
- Klicken Sie auf die Schaltflächen Fokus festlegen und Fokus sperren, um die Fokusverfolgungsfunktion zu aktivieren. Ein richtig fokussiertes Bild (Abbildung 1A,C) sollte den "Signal"-Wert unter 0,05% haben.
HINWEIS: Wenn der "Signal"-Wert bei maximaler Schärfeposition über 0,05 % liegt, kann dies auf Verunreinigungen auf der Glasoberfläche oder im Puffer hinweisen.
- Laden Sie mit dem gleichen Kanal 20 l der Antikörper-Antigen-Probe, indem Sie sie auf einer Seite des Kanals ablagern und die Flüssigkeit vom anderen Ende mit einem kleinen Stück Blotting-Papier btun (Abbildung 2D).
ANMERKUNG: Das Volumen eines 3–5 mm breiten Kanals beträgt ca. 10 l. Es wird empfohlen, das zusätzliche Probenvolumen vollständig zu ersetzen und eine Probenverdünnung zu vermeiden. - Nachdem Sie das Beispiel geladen haben, klicken Sie sofort auf die Schaltfläche Aufzeichnen, um die Datensammlung zu starten, und erfassen Sie ein 100 s Video (Abbildung 1D).
- Geben Sie am Ende der Datensammlung den Dateinamen ein, und klicken Sie auf OK, um die Datendatei zu speichern.
- Entsorgen Sie die Abdeckungen und wischen Sie das Öl von der Objektivlinse mit optischen Wattestäbchen mit Isopropanol.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
4. Analysieren Sie die MP-Daten
- Verarbeiten Sie die gesammelte Videodatei mit der MP-Datenverarbeitungssoftware, um die Landeereignisse zu identifizieren.
- Verwenden Sie die Menüoption Datei/Öffnen, um die Datei für die Analyse zu laden, und klicken Sie auf Analysieren.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Laden, um die Kalibrierungsfunktion zu laden und die analysierten Daten mit der Menüoption Datei/Ergebnisse speichern als zu speichern.
- Passen Sie die molekulare Massenverteilung mit Gaußschen Funktionen an, um relative Konzentrationen jeder Art in der Probe zu erhalten. Diese Analyse kann mit einer gemeinsamen wissenschaftlichen Graphiksoftware durchgeführt werden (siehe Tabelle der Materialien).
- Importieren Sie die Datei "eventsFitted.csv" in die Software und zeichnen Sie die molekulare Massenverteilung (Spalte M in der .csv Datei) mit der Funktion Plot/Statistik/Histogramm.
- Doppelklicken Sie auf das Histogramm, um das Fenster PlotEigenschaften zu öffnen. Deaktivieren Sie das automatische Binning und wählen Sie eine Behältergröße von 2,5 kDa aus. Klicken Sie auf die Schaltflächen Anwenden und Gehen, um die Bin-Center- und Counts-Daten zu erstellen.
- Wählen Sie die Spalten Bin-Zentren und -Zählungen aus, und verwenden Sie die Menüfunktion Analysis/Peaks und Baseline/Multiple Peak Fit, um das Histogramm mit Gaußschen Funktionen anzupassen. Doppelklicken Sie, um die ungefähren Spitzenpositionen im Verteilungsdiagramm anzugeben, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche NLFit öffnen.
- Überprüfen Sie die Kontrollkästchen Für die "xc"-Spitzenzentren und legen Sie deren Werte auf die erwarteten Molekularmassen des freien Antikörpers und der Einzel- und Doppelantigen-Antikörperkomplexe fest. Aktivieren Sie die Option Freigeben für die Breitenparameter. Klicken Sie auf die Schaltfläche Anpassen. Die angepassten Spitzenhöhenwerte der Gaußschen Komponenten stellen die relative Konzentration jeder Art in der Stichprobe11dar.
HINWEIS: Die Lagerplatzgröße kann angepasst werden, um die Auflösung des Massenverteilungsdiagramms zu optimieren. Die MP-Präzisionsgrenze beträgt ca. 1 kDa, und kleinere Behältergrößen können das Rauschen der Verteilung verstärken, ohne zusätzliche Informationen zu offenbaren. Sehr große Behältergrößen werden die feinen Details der Massenverteilungen verschleiern.
- Berechnen Sie den Konzentrationsanteil jeder Art mit der folgenden Gleichung:
wobei die werte hi und fi Spitzenhöhen und Konzentrationsfraktionen des freien Antikörpers bzw. des ein- bzw. doppelgebundenen Antikörpers in der Probe darstellen.
5. Berechnen sie Gleichgewichtskonstantenwerte
- Passen Sie die in Schritt 4.3 berechneten Konzentrationsfraktionen der Wechselwirkungsarten mit Eq. 1 und 2 mit einer geeigneten Analysesoftware an. Hier zeigen wir eine Methode zur Berechnung von Gleichgewichtskonstanten mit einem Tabellenkalkulationsprogramm14 (siehe Ergänzende Informationen).
- Öffnen Sie das Arbeitsblatt "Kd-Berechnung.xlsx". In diesem Arbeitsblatt können die in gelb hervorgehobenen Zellenwerte in den Zeilen 1 bis 10 geändert werden, um die Berechnung der Gleichgewichtskonstanten durchzuführen.
- Geben Sie die geschätzten Kd-Werte in nanomolaren Einheiten in die Zellen B1 und B2 in die Tabelle ein. Diese Startwerte werden im Fitting-Verfahren optimiert. Wenn die geschätzten Kd-Werte nicht bekannt sind, lassen Sie die Standardwerte in den Zellen B1 und B2 unverändert.
- Geben Sie die Werte von (cAb)tot und (cAg)tot in nanomolaren Einheiten in die Zellen D2 und E2 ein. Geben Sie die in Schritt 4.3 berechneten Bruchwerte in die Zellen F2, G2 und H2 ein. Wurden mehrere Proben mit unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen gemessen, so können zusätzliche Konzentrationswerte, die für diese Proben ermittelt wurden, in die Zeilen 2 bis 10 eingegeben werden.
- Wählen Sie die Menüfunktion Daten/Solver aus. Geben Sie "$B 15" in das Feld "Ziel festlegen" und "$B-1:$B-2" in das Feld "Durch Ändern von variablen Zellen:" ein. Wählen Sie das Min-Optionsfeld für die Option An: aus. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Nicht eingeschränkte Variablen nicht negativ machen, und aktivieren Sie GRG Nonlinear als Lösungsmethode. Klicken Sie auf die Schaltfläche Lösen. Die am besten passenden Kd1- undK-d2-Werte werden in Zelle B1 und B2 und die endgültige Summe der quadrierten Fehler in Zelle B15 angezeigt.
HINWEIS: Wenn die Solver-Funktion nicht aktiv ist, wählen Sie optionen im Menü Datei im Tabellenkalkulationsprogramm aus. Wählen Sie in der Kategorie Add-Ins das Solver-Add-In unter den Inaktiven Anwendungs-Add-Ins aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Gehen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Solver-Add-In, und klicken Sie auf OK.
Abbildung 1: Massenphotometriebilder. (A) Repräsentatives natives Ansichtsbild des Bildgebungspuffers, der auf einem sauberen Abdeckzettel und (B) auf einem Deckschzettel mit Oberflächenunvollkommenheiten gesammelt wurde. (C) Differentialratiometrisches Bild des Bildgebungspuffers und (D) des AHT HT-Lösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: MP-Durchflusskammervorbereitung und -beladung. (A) Coverslip Halteposition für den Reinigungsvorgang. (B) Ausrichtung des 24 x 24 mm Abdeckzettels (mittlere Schicht) und des doppelseitigen Bandes (obere Schicht) auf der Oberfläche der Aluminiumfolie (untere Schicht, nicht abgebildet). Blaue gestrichelte Linien zeigen die Position der Schnittlinien an. (C) Obere und seitliche Ansicht der montierten Durchflusskammer mit zwei Probenkanälen und einem Bild der montierten Durchflusskammer. (D) Verfahren zum Laden von Proben in einen zuvor mit Puffer gefüllten Durchflusskanal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Representative Results
Wir haben zuvor die Wechselwirkung von humanen α-Thrombin (HT) und Maus monoklonalen anti-humanen Thrombin-Antikörper (AHT) mit dem MP-basierten Assay11untersucht. Da die Molekularmasse des HT (37 kDa) unter der 40 kDa-Nachweisgrenze liegt, kann die maximale Probenkonzentration die Konzentrationsbeschränkung von 50 nM MP überschreiten, ohne die Auflösung von Massenverteilungen negativ zu beeinflussen. Das Experiment war als Titrationsserie mit dem AHT-Antikörper mit einer festen Konzentration von 25 nM und dem HT in Konzentrationen von 7,5 nM, 15 nM, 30 nM, 60 nM und 120 nM geplant. Abbildung 3 zeigt die molekularen Massenverteilungen der Antigen-Antikörper-Mischungen und der Antikörper-only-Probe. Hier analysieren wir die Daten mit der im Protokoll beschriebenen Methode. Eine wissenschaftliche Graphik-Software wurde verwendet, um die Massenverteilungen mit drei Gaußschen Komponenten, die die freie AHT, AHT. HT und AHT HT2. Die bekannten Molekularmassenwerte der drei Komponenten wurden festgelegt, und für die drei Arten wurde ein einziger Spitzenbreitenparameter angepasst. Die besten Spitzenhöhenparameter der Gaußschen Komponenten wurden mit Eq. 3 normalisiert, um Artenkonzentrationsfraktionen zu erhalten (Tabelle 1). Diese Werte wurden zusammen mit der Gesamtantikörper- und Antigenkonzentration für jede Probe in die "Kd-Berechnung.xlsx" eingegeben. Die globale Anpassung in der Tabelle ergibt Kd1 = 40 nM (68,3% Konfidenzintervall: 28 nM, 68 nM) und Kd2 = 28 nM (68,3% Konfidenzintervall: 17 nM, 45 nM). Die experimentellen Konzentrationsfraktionen und die Anpassungsergebnisse sind in Abbildung 4dargestellt. Die hier durch die Anpassung der integrierten Konzentrationsfraktionen ermittelten Dissoziationskonstantenwerte entsprechen denen, die zuvor durch direkt passende MP-Verteilungen und mit Dissoziationskonstantenwerten erzielt wurden, die durch die Isothermale Titrationskalorimetrie (ITC)11ermittelt wurden.
Abbildung 3: MP-Molekularmassenverteilungen des 25 nM AHT gemischt mit HT bei 0, 7,5, 15, 30, 60 und 120 nM (A-F). Schwarze Punkte zeigen die experimentellen MP-Daten mit 2,5 kDa-Behältergröße. Cyan-, grüne und blaue Linien stellen die am besten passenden Gaußschen Verteilungen der freien Antikörper, Einzelantikörper bzw. doppelt gebundenen Antikörperarten dar. Rote Linien zeigen die Summe der drei Gaußschen Komponenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Fraktionen des freien AHT (blau), AHT HT (rot) und AHT HT2(schwarz) als Funktion der HT-Konzentration. Punkte stellen experimentelle Werte dar, die aus dem Gaußschen Fitting der MP-Verteilungen gewonnen wurden. Durchgezogene Linien stellen die beste Passform mit Eq. 1 und Eq. 2 dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Technische Replikationen der AHT-Molekularmassenverteilungsmessungen. Plots zeigt die Reproduzierbarkeit der MP-Messungen und die Reinheit der Antikörperzubereitung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Ab conc (M) | Ag conc (M) | f_Ab | f_AbAg | f_AbAg2 |
| 2.50E-08 | 7.50E-09 | 0.88 | 0.10 | 0.02 |
| 2.50E-08 | 1.50E-08 | 0.81 | 0.15 | 0.04 |
| 2.50E-08 | 3.00E-08 | 0.72 | 0.21 | 0.07 |
| 2.50E-08 | 6.00E-08 | 0.27 | 0.37 | 0.35 |
| 2.50E-08 | 1.20E-07 | 0.05 | 0.23 | 0.72 |
Tabelle 1: Normalisierte Spitzenhöhen von Gaußschen Bauteilen, die durch Anbringen der MP-Verteilungen ermittelt werden (Abbildung 3).
Ergänzende Informationen: Implementierung des Verfahrens für die Anpassung der Gleichgewichtskonstanten in Excel- und Affinitätsberechnungsarbeitsblatt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Das hier beschriebene Mass Photometry-basierte Protokoll bietet eine schnelle und genaue Methode zur Messung von Antigen-Antikörper-Bindungsaffinitäten. Die MP-Analyse verwendet eine sehr geringe Menge an Material, und zusätzliche Informationen – einschließlich Stoichiometrie, Oligomerisierung und Reinheit – können anhand derselben Daten ausgewertet werden (Abbildung 5). Ohne Modifikationen ist diese Methode auf die Messungen von Dissoziationskonstanten im Bereich von ca. 5 nM bis 500 nM und für Ligandenmoleküle mit einer Molekularmasse von ca. 20 kDa oder größer anwendbar. Das gleiche Protokoll kann nicht nur zur Analyse der Antigen-Antikörper-Bindung verwendet werden, sondern auch zur Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungsaffinitäten, wenn die Molekularmasse von mindestens einem der Bindungspartner größer als 50 kDa ist. Da der MP-Nachweis unspezifisch ist, können MP-Messungen nicht an Proben durchgeführt werden, die eine hohe Konzentration von Trägerproteinen oder großen molekularen Massenunreinheiten enthalten.
SPR wird häufig für die Charakterisierung der Antigen-Antikörper-Bindung verwendet, und der direkte Vergleich beider Methoden kann bei der Assayauswahl helfen. Im Vergleich zu SPR ist der MP-Bindungstest schneller und erfordert keine Proteinimmobilisierung. Für ein typisches Bindungsexperiment benötigt der MP weniger Material als SPR. MP-Daten offenbaren die Stoichiometrie der Komplexe, die aus dem SPR10,11nicht ohne weiteres verfügbar ist. Kinetische Bindungsparameter können aus den MP-Daten13abgerufen werden, aber SPR misst die Bindungskinetik direkt und ist in der Lage, einen breiteren Bereich von Assoziations- und Dissoziationsraten zu messen. Die Assoziationskonstanten von zwei getrennten Bindungsstellen können nur dann aus den SPR-Daten abgerufen werden, wenn die Assoziations- und Dissoziationsraten beider Standorte hinreichend unterschiedlich sind. Andererseits kann der MP molekulare Komplexe mit mehreren Bindungsstellen10,11präzise charakterisieren. SPR ist in der Lage, Bindungsaffinität für kleine molekulare Massenliganden zu messen, und MP funktioniert am besten für Liganden mit einer Molekularmasse von etwa 20 kDa oder größer.
Das Sammeln von MP-Daten guter Qualität ist ein entscheidender Schritt, um genaue Ergebnisse aus diesem Protokoll zu erhalten. Verunreinigungen im Puffer oder auf der Oberfläche der Abdeckungen stören die MP-Datenerfassung. Unsachgemäße Fokussierung verzerrt das MP-Signal, was zu Fehlern bei molekularen Massenschätzungen und Gleichgewichtskonstantenberechnungen führt. Beide Faktoren sollten bei der Fehlerbehebung des Protokolls untersucht werden. Ein wichtiger Aspekt bei der Arbeit mit proteinarmen Lösungen ist, dass die Oberflächenadsorption zum Materialverlust und zu Veränderungen der Probenkonzentration führen kann. Die resultierenden Fehler können minimiert werden, indem Laborware mit geringer Adsorption verwendet und Oberflächenpassivierung angewendet wird. Um genaue Ergebnisse zu erhalten, ist es wichtig, dass alle Proteinverdünnungen und -mischungen ein chemisches Gleichgewicht erreichen, aber unnötig lange Inkubationszeiten sollten vermieden werden. Für jedes Proteinsystem wird empfohlen, die Raten der unspezifischen Proteinbindung an das Deckglas anhand der MP-Daten zu bewerten. Wenn für verschiedene Arten deutlich unterschiedliche Raten beobachtet werden, können MP-Daten leicht korrigiert werden, um mögliche Fehler in den Kd-Berechnungen 10,11zu vermeiden.
Bei der Planung der Probenvorbereitung sollten mehrere Faktoren berücksichtigt werden. Genaue Ergebnisse können durch Messung einer einzigen Probe erzielt werden, aber die Antigen- und Antikörperkonzentrationen müssen angepasst werden, um eine vergleichbare Konzentration der freien und gebundenen Arten zu erhalten. Die Analyse einer einzelnen Massenverteilung, die von einer der Reaktionsarten dominiert wird, kann akzeptable Kd-Werteschätzungen liefern, liefert aber in der Regel relativ große Anpassungsfehler11. Eine alternative Strategie beinhaltet eine globale Analyse von Titrationsdaten. Das mit diesem Protokoll gelieferte tabellenbasierte, softwarebasierte Fitting-Tool kann sowohl für die Anpassung einzelner Daten als auch für die globale Analyse verwendet werden. Wenn ein einzelnes Experiment oder Datensatz analysiert wird, können die Konfidenzintervalle der besten Anpassungsparameter mit der Fehlerprojektionsmethode geschätzt werden. Eine detaillierte Beschreibung des Berechnungsverfahrens für Konfidenzintervalle in der Tabellenkalkulationssoftware finden Sie an anderer Stelle14. Beim Entwerfen des Assays wird empfohlen, Replikationsexperimente zu planen. Wenn Daten aus Replikationsexperimenten analysiert werden, kann die Standardabweichung verwendet werden, um Fehler der Kd-Werte zu melden.
Das hier beschriebene Protokoll kann geändert werden, um seine Anwendbarkeit über die typischen Beschränkungen der molekularen Masse und Affinitätsreichweite hinaus zu erweitern. Der Bereich messbarer Affinitäten wird durch den proteingebundenen Konzentrationsbereich begrenzt, der von MP zugänglich ist, typischerweise von 10 nM bis 50 nM. Dieser Bereich kann erweitert und Proteinproben bei Konzentrationen unter 10 nM mit perfundierten Durchflusszellen und längeren Datenerfassungszeiten gemessen werden. Proteinproben in höheren Konzentrationen können möglicherweise mit passivierten Abdeckungen für die MP-Messungen gemessen werden. Bei Antigenen mit einer kleinen Molekülmasse werden der freie Antikörper und der Antigen-Antikörper-Komplex in den MP-Massenverteilungen ungelöst sein. Dies schließt die Verwendung der im Protokoll beschriebenen Gaußschen Spitzenanpassungsanalyse aus. In diesem Fall kann die Bindungsaffinität noch gemessen werden, indem der Antikörper mit dem Antigen tittiert und die MP-Verteilungen mittelartikuliert werden, um die durchschnittliche Molekularmasse aller Arten für jede Probe zu erhalten. Die Bindungsgleichung kann dann an diese Daten anpassen, um die Antigen-Antikörper-Bindungsaffinität11zu erhalten.
Wenn keine genauen Affinitätsinformationen erforderlich sind, kann das Protokoll vereinfacht und für ein schnelles Antikörper-Interaktionsscreening verwendet werden. In diesem Fall können die handelsüblichen Dichtungsbrunnen anstelle von Probenkanälen verwendet werden, um das Versuchsverfahren weiter zu vereinfachen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Keir Neuman für seine kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch das intramurale Programm des NHLBI, NIH unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AcquireMP | Refeyn | MP data collection software | |
| Anti-human thrombin | Haematologic Technologies | AHT-5020 | RRID: AB_2864302 |
| Cotton-tipped applicators | Thorlabs | CTA10 | cotton optical swabs for lens cleaning |
| Coverslips 24x24 mm | Globe Scientific | 1405-10 | |
| Coverslips 24x50 mm | Fisher Scientific | 12-544-EP | |
| DiscoverMP | Refeyn | MP data processing software | |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 78080-CF | soft-tipped forceps for coverslips handling |
| Human α-thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
| Immersion oil | Thorlabs | MOIL-30 | |
| Isopropanol | Alfa Aesar | 36644 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | spreadsheet | |
| OneMP | Refeyn | Mass Photometry instrument | |
| Origin | OriginLab | scientific graphing software | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | 10x stock |
| Syringe filter | Millipore | SLGSR33SS | buffer and sample filtering |
References
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