Summary
Hier beschrijven we het gebruik van Grafix (Gradient Fixation), een glycerol gradiënt centrifugatie in de aanwezigheid van een crosslinker, om interacties te identificeren tussen splicingfactoren die tijdelijk binden aan het spliceosoomcomplex.
Abstract
Pre-mRNA splicing is een zeer dynamisch proces dat veel moleculaire herschikkingen van de spliceosoomsubcomplexen omvat tijdens assemblage, RNA-verwerking en afgifte van de complexe componenten. Glycerol gradiënt centrifugatie is gebruikt voor de scheiding van eiwit of RNP (RiboNucleoProtein) complexen voor functionele en structurele studies. Hier beschrijven we het gebruik van Grafix (Gradient Fixation), dat voor het eerst werd ontwikkeld om macromoleculaire complexen te zuiveren en te stabiliseren voor cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje, om interacties te identificeren tussen splicingfactoren die tijdelijk binden aan het spliceosoomcomplex. Deze methode is gebaseerd op het centrifugeren van monsters in een toenemende concentratie van een fixatiereagens om complexen te stabiliseren. Na centrifugering van gisttotaalextracten geladen op glycerolgradiënten, worden teruggewonnen fracties geanalyseerd door dot blot voor de identificatie van de spliceosoomsubcomplexen en bepaling van de aanwezigheid van individuele splicingfactoren.
Introduction
Splicing is een zeer dynamisch proces dat vereist dat een veelheid aan factoren op een gecoördineerde manier wordt gebonden en vrijgegeven. Deze splicingfactoren omvatten RNA-bindende eiwitten, ATPasen, helicases, eiwitkinasen en fosfatasen, ubiquitine-ligases, onder andere1,2,3; en om de moleculaire herschikkingen mogelijk te maken, binden sommige van deze factoren zeer tijdelijk aan de spliceosoomsubcomplexen, waardoor de isolatie en identificatie van deze RNP-intermediaire complexen zeer uitdagend is.
Hier gebruikten we de Grafix-methode4,5 om de interactie van de gistsplitsingsfactor Cwc24 met hetB-actcomplex 6 te stabiliseren om de identificatie van andere factoren die gelijktijdig aan dat subcomplex gebonden zijn mogelijk te maken en te bepalen of het ubiquitineligase Prp19 een rol speelt bij de binding of afgifte van Cwc24 aan het Nineteen (NTC) -complex en aan het 5'-uiteinde van het intron voordat activering en de eerste transesterificatiereactie plaatsvindt plaats. Het voordeel van het blootstellen van de macromoleculen aan een toenemende concentratie van de crosslinker langs de glycerolgradiënt is dat het inter-complexen crosslinks4,5en dus de vorming van aggregaten vermijdt.
Deze methode werd gebruikt als aanvulling op eiwitcoimmunoprecipitatie en pull-down assays, die, ondanks het feit dat ze de isolatie van grote complexen mogelijk maken, mogelijk niet betrouwbaar zijn voor het handhaven van voorbijgaande interacties binnen grote dynamische complexen7,8. Het gebruik van fixatiereagentia in de glycerolgradiënt stabiliseert de binding van dergelijke factoren, waardoor de bevestiging van interacties van specifieke eiwitten met splicing subcomplexen mogelijk is. Omdat de gekozen crosslinker chemisch onomkeerbaar was, werden eiwitten die aanwezig waren in de teruggewonnen fracties geanalyseerd door dot blot na de gradiëntcentrifugatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gist totaalextractpreparaat
- Kweek de gistcellen die een van de splicingfactoren tot expressie brengen die zijn gefuseerd met het TAP-label9 in 1 L YNB-glu media (Giststikstofbasis aangevuld met 2% m / v glucose) met de juiste aminozuren of nucleïnebasen, in dit geval adenine (20 μg / ml), leucine (30 μg / ml), tryptofaan (30 μg / ml), tot OD600 = 1,0.
- Verzamel de cellen uit de 1 L-cultuur door ze in drie centrifugeflessen van 500 ml te centrifugeren bij 17.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en was tweemaal met koud steriel water van 10 ml.
- Resuspend de verzamelde gistcellen in 1/10 van het celvolume van koude buffer A (10 mmol L-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 mmol L-1 MgCl2, 50 mmol L-1 KCl, 5% v/v glycerol, 0,5 mmol L-1 DTT, EDTA-vrije proteaseremmer Cocktail).
- Vries kleine druppels celsuspensie in vloeibare stikstof. De kleine druppels kunnen worden verkregen door de geresuspendeerde celoplossing te pipetteren en 50 μL rechtstreeks in vloeibare stikstof te laten vallen.
LET OP: Vloeibare stikstof kan verwondingen veroorzaken bij contact met de huid of ogen. Hanteer met behulp van geschikte veiligheidsuitrusting.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De bevroren druppels celsuspensie kunnen worden bewaard bij -80 °C. - Bereid gistcellen lysaten door gedurende 3 minuten in een Ball Mill-apparaat gedurende zes cycli bij 20 Hz / s te malen.
OPMERKING: Dompel na elke cyclus de container met de bevroren cellen onder in vloeibare stikstof om smelten te voorkomen. Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De bevroren extracten kunnen bewaard worden bij -80 °C. Gist splicing extracten kunnen ook worden bereid met behulp van homogenisatoren om sferoplasten10te lyseren, of met behulp van mortel en stamper11,12. - Smelt het extract door de buisjes met ze in water op kamertemperatuur te leggen en af en toe te schudden.
- Centrifuge-extracten bij 45.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C.
- Kwantificeer het eiwitgehalte van het geklaarde supernatant volgens de BCA-methode13.
- Bereid aliquots van de extracten, vries ze snel in vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
2. Glycerol gradiënt voorbereiding
- Bereid twee glyceroloplossingen in buffer A, één met 10% v/v en één met 30% v/v glycerol.
- Voeg het crosslinkingmiddel glutaaraldehyde toe aan 0,1% v/v in de 30% v/v glyceroloplossing en meng om te homogeniseren.
LET OP: Behandel glutaaraldehyde in de zuurkast met behulp van de juiste veiligheidsuitrusting. - Voeg 6 ml van de koude 10% v/v glyceroloplossing toe aan de onderkant van de centrifugebuis van 12 ml (14 x 89 mm).
- Voeg 6 ml van de koude 30% v/v glyceroloplossing aangevuld met glutaaraldehyde toe met een spuit bevestigd aan een lange naald die is geleverd met het Gradient Master-apparaat aan de onderkant van de buis, net onder de 10% v/v glyceroloplossing.
OPMERKING: Als alternatief kan de 10% v/v glyceroloplossing zorgvuldig worden gepipeerd op de bovenkant van de 30% v/v glycerol/glutaaraldehyde-oplossing. - Gebruik het Gradient Master-apparaat om een continu dichtheidsgradiënt te genereren.
OPMERKING: In het Gradient Master-apparaat worden de buizen in een geschikt rack geplaatst en kort gedraaid, volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor het bepalen van de parameters (tijd / hoek / snelheid). In dit werk gebruikten we: 2:25 min/81,5°/11 rpm. - Voeg voorzichtig 200 μL van een 7% v/v glycerol/buffer A kussen toe aan de bovenkant vlak voor de toevoeging van de celextracten.
OPMERKING: De glycerolconcentratie van het kussen moet lager zijn dan de minder geconcentreerde glyceroloplossing die wordt gebruikt om de lineaire gradiënt te creëren.
3. Extracten centrifugatie
- Laad ongeveer 2 mg totaal eiwit op de bovenkant van elke 12 ml lineaire glycerolgradiënt 10% -30% glutaaraldehyde met kussen.
- Plaats de buizen in een voorgekoelde zwenkbakrotor.
OPMERKING: Behandel de buizen voorzichtig om mengen vóór ultracentrifugatie te voorkomen. - Centrifugeer bij 194.000 x g gedurende 16 uur bij 4 °C.
- Aliquot elke buis van 12 ml in vierentwintig fracties van 500 μL met behulp van een aangepast EconoSysteem of door zorgvuldig pipetteren.
OPMERKING: Een aangepast EconoSysteem bestaat uit een peristaltische pomp, de UV-detector en de fractiecollector die is aangesloten op de buisperforeerinrichting. Het sedimentatieprofiel kan worden gemonitord door de absorptie bij 280 nm te meten. - Gebruik een 40% v/v glyceroloplossing door de peristaltische pomp om de glycerol 10%-30% gradiënt van de buis naar de fractiecollector te duwen.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Bewaar de fracties bij -80 °C tot gebruik. - Laad 50 μL van elke fractie rechtstreeks op nitrocellulosemembranen op een dot blot of slot blot-apparaat. Detecteer eiwit door immunoblot met behulp van antilichaam tegen CBP (1:6.000, om het CBP-gedeelte van de TAP-tag te detecteren) en anti-konijn IgG geconjugeerd met Mierikswortelperoxidase (1:15.000) als secundair antilichaam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om het sedimentatieprofiel van Cwc24-TAP te analyseren en te bepalen of de Grafix-methode effectief was om de binding aan splicing-subcomplexen te stabiliseren, scheidden we totale gistextracten van cellen die Cwc24-TAP tot expressie brengen door middel van centrifugering op glycerolgradiënten, in de aan- of afwezigheid van glutaaraldehyde als een crosslinking agent. Monsters van vierentwintig 500 μL-fracties werden vervolgens geanalyseerd door slotvlek met antilichaam tegen het CBP-gedeelte van de TAP-tag. De resultaten tonen aan dat bij afwezigheid van de crosslinker, Cwc24 geconcentreerd is tussen fracties 5 en 13 (figuur 1B), overeenkomend met complexen van ongeveer 80 tot 200 MDa14. In aanwezigheid van de crosslinker wordt de positie van Cwc24 op de gradiënt echter verschoven naar breuken aan de onderkant van de gradiënt, overeenkomend met grotere complexen (Figuur 1). Deze resultaten geven aan dat glutaaraldehyde de associatie van Cwc24 met splicingcomplexen stabiliseert.
Om vast te stellen of de complexen die Cwc24 behouden overeenkomen met het Bact-complex, dat wordt gevormd door snRNPs U2, U5 en U6 en het NTC-complex, vergeleken we Cwc24-sedimentatie met die van de U5 snRNP-subeenheid Prp8 en de NTC-subeenheid Prp19. Giststammen die een van deze eiwitten tot expressie brengen die zijn gefuseerd met de TAP-tag, werden onderworpen aan Grafix, gevolgd door dot blot voor de detectie van de eiwitten. Deze drie spliceosoomsubeenheden vertoonden vergelijkbare profielen, sedimenterend met grotere complexen aan de onderkant van de gradiënt. Cwc24 is geconcentreerd in dezelfde fracties, maar omdat het zich tijdelijk associeert met het spliceosoom, is het ook aanwezig in de lichtere fracties (figuur 2). Kwantificering van de stippen toont deze profielen (Figuur 2B).
Interessant is dat fracties 11 en 12 die zijn waar Prp8 en Prp19 zich beginnen te concentreren, wat suggereert dat dit het deel van de gradiënt is waar bactcomplex begint te sedimenteren. Om vast te stellen dat deze eiwitten gebonden zijn aan complexen in deze fracties, werden aliquots van fracties 11 en 12 onderworpen aan elektroforese op inheemse gels en vervolgens aan western blot. Signalen van Prp8 en Prp19 verschijnen als uitstrijkjes die nauwelijks in een 8% acrylamidegel komen, waaruit blijkt dat ze inderdaad deel uitmaken van grote complexen(figuur 3). Cwc24 is ook aanwezig in fractie 12, maar in een veel lagere concentratie, consistent met de voorbijgaande binding aan het Bact-complex. Deze resultaten tonen aan dat glutaaraldehyde kan worden gebruikt als een crosslinker om de binding van voorbijgaande factoren aan splicerende subcomplexen te stabiliseren.
Figuur 1: Grafix houdt Cwc24 geassocieerd met grotere complexen. Totaal gistextract van cellen die Cwc24-TAP tot expressie brengen, werd gescheiden door centrifugering op glycerolgradiënten, hetzij in afwezigheid of aanwezigheid van de crosslinker glutaaraldehyde. AOneven fracties van de gradiënt werden onderworpen aan slotvlek voor de immunodesectie van Cwc24-TAP met antilichaam tegen het CBP-gedeelte van de TAP-tag. BKwantificering van Cwc24-TAP met behulp van afbeelding J toont de concentratie van het eiwit door de fracties van de glycerolgradiënt. Aan- of afwezigheid van glutaaraldehyde is geïndiceerd. Y-as toont de relatieve hoeveelheden Cwc24 door de gradiënt, berekend als de intensiteit van het signaal in de fracties, ten opzichte van de eerste fractie (Fn/ F1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Sedimentatie van splicingfactoren door glycerol/glutaaraldehydegradiënten. Extracten van gistcellen die Cwc24, Prp8 of Prp19 tot expressie brengen, gefuseerd met de TAP-tag, werden geladen op glycerolgradiënten die glutaaraldehyde bevatten en gecentrifugeerd voor de scheiding van splicingcomplexen. A)Monsters van de vierentwintig fracties van de gradiënt werden geanalyseerd door dot blot en immunodetection van de TAP-gefuseerde eiwitten met antilichaam tegen het CBP-gedeelte van de TAP-tag. B) Kwantificering van de eiwitten met behulp van afbeelding J toont hun concentratie in de onderste fracties van de glycerol/glutaaraldehydegradiënt. Y-as toont de relatieve hoeveelheden van de eiwitten door de gradiënt, berekend als de intensiteit van het signaal in de fracties, ten opzichte van de eerste fractie die een signaal boven de achtergrond vertoont (Fn/ F1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Detectie van splicingcomplexen door native PAGE en immunoblot. Aliquots van fracties 11 en 12 van de gradiënt in figuur 2 werden gescheiden door elektroforese op 8% acrylamide inheemse gel en onderworpen aan immunoblot met antilichaam tegen CBP. Eiwitten worden niet gedetecteerd als banden omdat complexen te groot zijn om te scheiden op inheemse gels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eiwit-eiwit en ribonucleïnezuur-eiwit interacties kunnen worden gestabiliseerd met behulp van crosslinking middelen. Het is belangrijk dat het resulterende complex stabiel is om ultracentrifugatie op glycerolgradiënt te weerstaan. Bovendien moeten de buffervoorwaarden de interactie mogelijk maken, maar streng genoeg zijn om niet-specifieke binding te voorkomen. In de hier getoonde experimenten gebruikten we een bufferoplossing die al was vastgesteld voor in vitro splicingreacties15.
De snelheid en tijd van centrifugeren moeten worden geoptimaliseerd voor de complexen die worden geanalyseerd. We hebben verschillende sedimentatieomstandigheden getest, waarbij monsters werden gecentrifugeerd bij 94.000 x g en 194.000 x g gedurende 16 uur bij 4 °C, met vergelijkbare resultaten. Deze controles zijn belangrijk om de omstandigheden te bepalen waarin de complexen die worden geanalyseerd niet neerslaan.
We hebben ook verschillende blot-methoden getest, waarbij we direct op het membraan pipetten, met behulp van slot blot- of dot blot-systemen, waaruit bleek dat dot blot meer reproduceerbare resultaten gaf.
Een belangrijke beperking van het gebruik van glutaaraldehyde als crosslinker is dat de crosslink niet kan worden teruggedraaid. Daarom kunnen eiwitten niet worden geanalyseerd door immunoblot na SDS-PAGE, maar alleen door native gels of dot blot. Reversibele crosslinkingmiddelen, zoals formaldehyde, kunnen echter mogelijk ook worden gebruikt.
We hebben eerder co-immunoprecipitatie van eiwitten gebruikt om splicingcomplexen te identificeren, maar in het geval van voorbijgaande of zwakke interacties7kan crosslink de isolatie van tussenliggende complexen helpen voor latere bepaling van hun componenten door massaspectrometrie. Hoewel onze focus hier het spliceosoom was, kan deze methode zeker worden gebruikt voor de isolatie van andere dynamische processen die tussenliggende complexen met verschillende samenstellingen omvatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een FAPESP-subsidie (15/06477-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).
- Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
- Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
- Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
- Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
- Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
- Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
- Dunn, E. A., Rader, S. D. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Hertel, K. J. 1126, 123-135 (2014).
- Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
- Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
- Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J.
