Summary
כאן, אנו מתארים את הניצול של Grafix (קיבוע הדרגתי), צנטריפוגה הדרגתית גליצריול בנוכחות crosslinker, כדי לזהות אינטראקציות בין גורמי שיתוף שנקשרים באופן חולף לקומפלקס spliceosome.
Abstract
שיתוף טרום-mRNA הוא תהליך דינמי מאוד הכולל סידורים מולקולריים רבים של תת-קומפלקסים spliceosome במהלך הרכבה, עיבוד RNA, ושחרור של הרכיבים המורכבים. צנטריפוגציה הדרגתית גליצל שימשה להפרדת חלבונים או מתחמי RNP (RiboNucleoProtein) למחקרים פונקציונליים ומבניים. כאן, אנו מתארים את הניצול של Grafix (קיבוע הדרגתי), אשר פותח לראשונה כדי לטהר ולייצב מתחמים macromolecular עבור מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונים חלקיק יחיד, כדי לזהות אינטראקציות בין גורמי חוג שנקשרים ארעית למתחם spliceosome. שיטה זו מבוססת על צנטריפוגה של דגימות לריכוז הולך וגדל של ריאגנט קיבעון לייצוב מתחמים. לאחר צנטריפוגה של שמרים סה"כ תמציות טעון על שיפועים גליצריול, שברים התאושש מנותחים על ידי כתם נקודה לזיהוי של תת-מתחמים spliceosome וקביעה של נוכחות של גורמי splicing בודדים.
Introduction
שכפול הוא תהליך דינמי ביותר הדורש כריכה ושחרור של מספר רב של גורמים באופן מתואם. גורמי חוג אלה כוללים חלבונים מחייבים RNA, ATPases, helicases, קינאז חלבון ופוספטסות, רצועות בכל מקום, בין היתר1,2,3; ולאפשר את הסידורים המולקולריים להתקיים, חלק מהגורמים האלה נקשרים באופן ארעי מאוד לתת-קומפלקסים של spliceosome, מה שהופך את הבידוד והזיהוי של מתחמי ביניים אלה RNP מאתגרים מאוד.
כאן, השתמשנו בשיטת Grafix4,5 כדי לייצב את האינטראקציה של גורם חיבור שמרים Cwc24 עם קומפלקסB act 6 כדי לאפשר זיהוי של גורמים אחרים הקשורים במקביל לתת-קומפלקס זה ולקבוע אם ligase Ubiquitin Prp19 ממלא תפקיד כלשהו בכריכה או שחרור של Cwc24 למתחם תשע עשרה (NTC) ולסוף 5 ' של האינטרון לפני ההפעלה ותגובת הטרנססטרציה הראשונה לוקחת מקום. היתרון של חשיפת macromolecules לריכוז הולך וגדל של crosslinker לאורך שיפוע הגליצריול הוא שהוא נמנע בין מתחמים crosslinks4,5, ולכן, היווצרות של אגרגטים.
שיטה זו שימשה כהשלמה לקוימונופרציפיטציה של חלבון ובדיקות משיכה, שלמרות שאפשרו בידוד של מתחמים גדולים, לא יכול להיות אמין לשמירה על אינטראקציות חולפות בתוך מתחמים דינמיים גדולים7,8. השימוש ריאגנטים קיבעון בשיפוע הגליצריול מייצב את הכריכה של גורמים כאלה, ומאפשר אישור של אינטראקציות של חלבונים ספציפיים עם subcomplexes חוג. מכיוון שהקישור הנבחר היה בלתי הפיך מבחינה כימית, חלבונים שנמצאים בשברים שנמצאו נותחו על ידי כתם נקודה לאחר צנטריפוגת ההדרגה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תמצית שמרים
- לגדל את תאי שמרים המביעים את אחד הגורמים splicing התמזגו תג TAP9 ב 1 L YNB-דבק מדיה (שמרי חנקן בסיס בתוספת 2% מ '/v גלוקוז) עם חומצות אמינו מתאימות או בסיסים גרעיניים, במקרה זה, אדנין (20 מיקרוגרם / מ"ל), לאוצין (30 מיקרוגרם / מ"ל), טריפטופן (30 מיקרוגרם / מ"ל), עד OD600 = 1.0.
- לאסוף את התאים מתרבות 1 L על ידי צנטריפוגה בשלושה בקבוקי צנטריפוגה 500 מ"ל ב 17,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (60 °F) לשטוף פעמיים עם מים סטריליים 10 מ"ל.
- Resuspend תאי שמרים שנאספו ב 1/10 של נפח התא של חיץ קר A (10 mmol L-1 HEPES pH = 7.9, 1.5 mmol L-1 MgCl2, 50 mmol L-1 KCl, 5% v / v גליצל, 0.5 mmol L-1 DTT, קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA).
- להקפיא טיפות קטנות של השעיית תא בחנקן נוזלי. טיפות קטנות ניתן להשיג על ידי pipetting פתרון התא resuspended ושחרור 50 μL ישירות לתוך חנקן נוזלי.
אזהרה: חנקן נוזלי עלול לגרום לפציעות במגע עם העור או העיניים. יש לטפל בשימוש בציוד בטיחות מתאים.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. טיפות קפואות של השעיית התא ניתן לאחסן ב -80 °C (80 °F). - הכן תאי שמרים lysates על ידי שחיקה בהתקן כדור מיל דרך שישה מחזורים ב 20 הרץ / s במשך 3 דקות.
הערה: לאחר כל מחזור, לטבול את המיכל מחסה התאים הקפואים בחנקן נוזלי כדי למנוע נמס. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. ניתן לאחסן את התמציות הקפואות ב-80 מעלות צלזיוס. שמרים splicing תמציות יכול להיות מוכן גם באמצעות homogenizers ליסייט spheroplasts10, או באמצעות מרגמה ועלי11,12. - ממיסים את התמצית על ידי הצבת הצינורות המכילים אותם במים בטמפרטורת החדר, רועד מדי פעם.
- צנטריפוגות תמציות ב 45,000 x g עבור 1 שעות ב 4 °C (70 °F).
- לכמת את תכולת החלבון של supernatant פינה על ידי שיטת BCA13.
- הכן aliquots של תמציות, להקפיא אותם במהירות חנקן נוזלי ולאחסן ב -80 °C (80 °F).
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
2. הכנת הדרגתי גליצריול
- הכן שני פתרונות גליצריל במאגר A, אחד המכיל 10% v/v והשני המכיל 30% v / v גליסול.
- הוסף את סוכן הקישורים glutaraldehyde ל 0.1% v /v בפתרון 30% v / v גליצלול ומערבב הומוגניזציה.
אזהרה: יש לטפל בגלוטארלדהיד בתוך מכסה המנוע באמצעות ציוד בטיחות מתאים. - הוסף 6 מ"ל של פתרון גליסול 10% v / v קר בתחתית צינור צנטריפוגה 12 מ"ל (14 x 89 מ"מ).
- הוסף 6 מ"ל של פתרון גליצריל 30% v/v קר בתוספת גלוטרלדהיד עם מזרק המחובר למחט ארוכה המסופקת עם התקן מעבר צבע מאסטר בתחתית הצינור, ממש מתחת לפתרון 10% v / v גליצל.
הערה: לחלופין, פתרון 10% v /v גליצריל ניתן להקפיד בזהירות על החלק העליון של 30% v / v גליסטרול / glutaraldehyde פתרון. - השתמשו בהתקן 'תבנית מעבר צבע מאסטר' ליצירת מעבר צבע של צפיפות רציפה.
הערה: בהתקן מעבר צבע מאסטר, הצינורות ממוקמים בארון תקשורת מתאים ומסתובבים לזמן קצר, בעקבות המלצות היצרן לקביעת הפרמטרים (זמן/ זווית / מהירות). בעבודה זו השתמשנו: 2:25 דקות / 81.5 ° / 11 סל"ד. - בזהירות להוסיף 200 μL של 7% v / v גליצל / חוצץ כרית על החלק העליון ממש לפני התוספת של תמציות התא.
הערה: ריכוז הגליצרול של הכרית חייב להיות נמוך יותר מפתרון הגליצרול הפחות מרוכז המשמש ליצירת מעבר הצבע ליניארי.
3. צנטריפוגה תמציות
- טען כ 2 מ"ג של חלבון הכולל על גבי כל 12 מ"ל שיפוע גליסול ליניארי 10%-30% גלוטרלדהיד עם כרית.
- מניחים את הצינורות ברוטור דלי נדנדה מקורר מראש.
הערה: יש לטפל בצינורות בעדינות כדי להימנע מערבוב לפני אולטרה-צנטריפוגה. - צנטריפוגה ב 194,000 x g עבור 16 שעות ב 4 °C (70 °F).
- Aliquot כל צינור 12 מ"ל בעשרים וארבעה שברי μL באמצעות EconoSystem מותאם או על ידי צנרת בקפידה.
הערה: EconoSystem מותאם מורכב ממשאבה פרייסטלית, גלאי UV ואספן השבר המחובר למכשיר ניקוב הצינור. ניתן לעקוב אחר פרופיל המשפך על ידי מדידת הספיגה ב- 280 ננומטר. - השתמש בתמיסת 40% v/v glycerol דרך המשאבה peristaltic כדי לדחוף את הגליצריל 10%-30% הדרגתי מהצינור לאספן השברים.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. יש לאחסן את השברים ב- -80 °C (70 °F) עד לשימוש. - טען 50 μL של כל שבר ישירות על ממברנות ניטרוצלולוז על כתם נקודה או התקן כתם חריץ. לזהות חלבון על ידי אימונובלוט באמצעות נוגדן נגד CBP (1:6,000, כדי לזהות את החלק CBP של תג TAP) ו IgG אנטי ארנב מצומד עם פרשת Peroxidase (1:15,000) נוגדן משני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לנתח את פרופיל המשקעים של Cwc24-TAP ולקבוע אם שיטת Grafix הייתה יעילה לייצוב האיגוד שלה לשיתוף תת-קומפלקסים, הפרדנו בין תמציות שמרים כוללות של תאים המבטאים Cwc24-TAP באמצעות צנטריפוגציה על שיפועי גליצול, בנוכחות או היעדר גלוטרלדהיד כסוכן קישור צולב. דגימות של עשרים וארבעה שברי μL 500 נותחו לאחר מכן על ידי כתם חריץ עם נוגדן נגד חלק CBP של תג TAP. התוצאות מראות כי בהיעדר ההצלבה, Cwc24 מרוכז בין שברים 5 ל -13 (איור 1B),המקביל למתחמים של כ 80 עד 200 מד"א14. עם זאת, בנוכחות ה-crosslinker, המיקום של Cwc24 במעבר הצבע מועבר לשברים בתחתית מעבר הצבע, המתאימים למתחמים גדולים יותר (איור 1). תוצאות אלה מצביעות על כך glutaraldehyde מייצב את הקשר של Cwc24 עם מתחמי חיבור.
על מנת לקבוע אם המתחמים השומרים על Cwc24 תואמים למתחם Bact, אשר נוצר על ידי snRNPs U2, U5, ו- U6 ומתחם NTC, השווינו את משקעי Cwc24 לאלה של U5 snRNP subunit Prp8 ואת NTC subunit Prp19. זני שמרים המבטאים אחד החלבונים האלה מותכים לתג TAP היו נתונים לגראפיקס, ואחריו כתם נקודה לגילוי החלבונים. שלושת תתי-כיתות אלה הציגו פרופילים דומים, משקעים עם מתחמים גדולים יותר בתחתית השיפוע. Cwc24 מרוכז באותם שברים, אך מכיוון שהוא מקשר באופן ארעי עם החלקית, הוא קיים גם בשברים הקלים יותר (איור 2). כימות הנקודות מציג פרופילים אלה (איור 2B).
מעניין, שברים 11 ו -12 הם אלה שבהם Prp8 ו Prp19 מתחילים להתרכז, מה שמרמז שזה החלק של שיפוע שבו קומפלקס Bact מתחיל משקעים. כדי לוודא כי חלבונים אלה קשורים למתחמים בשברים אלה, aliquots של שברים 11 ו 12 היו נתונים אלקטרופורזה על ג'לים מקומיים ולאחר מכן כתם מערבי. אותות של Prp8 ו- Prp19 מופיעים כהכפשות שבקושי נכנסות לג'ל אקרילאמיד של 8%, מה שמראה שאכן הם חלק ממתחמים גדולים(איור 3). Cwc24 קיים גם בשבריר 12, אך בריכוז נמוך בהרבה, עולה בקנה אחד עם הכריכה החולפת שלו למתחם Bact. תוצאות אלה מראות כי glutaraldehyde יכול לשמש crosslinker כדי לייצב את הכריכה של גורמים ארעיים כדי splicing subcomplexes.
איור 1: גראפיקס מחזיקה ב-Cwc24 הקשורה למתחמים גדולים יותר. תמצית שמרים כוללת של תאים המבטאים Cwc24-TAP הופרדה על ידי צנטריפוגה על שיפועים גליסול, או בהיעדר או נוכחות של glutaraldehyde crosslinker. (A)שברים מוזרים של מעבר הצבע היו נתונים כתם חריץ עבור החיסון של Cwc24-TAP עם נוגדן נגד חלק CBP של תג TAP. (B)כימות Cwc24-TAP באמצעות תמונה J מראה את ריכוז החלבון דרך שברי מעבר הצבע הגליצריול. נוכחות או היעדר גלוטרלדהיד מצוין. ציר Y מציג את הכמויות היחסיות של Cwc24 דרך מעבר הצבע, המחושב כעוצמת האות בשברים, ביחס לשבר הראשון (Fn/F1). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: משקעים של גורמי חיתול באמצעות שיפועי גליצרי/גלוטרלדהיד. תמציות של תאי שמרים המבטאים Cwc24, Prp8 או Prp19 הותכו לתג TAP נטענו על שיפועי גליצרול המכילים גלוטרלדהיד וצנטריפוגה להפרדה של מתחמי חוג. (A)דגימות של עשרים וארבעה שברים של השיפוע נותחו על ידי כתם נקודה וחיסון של חלבונים מותכי TAP עם נוגדן נגד חלק CBP של תג TAP. (B)כימות החלבונים באמצעות תמונה J מראה את הריכוז שלהם בחלקים התחתונים של שיפוע הגליצריול/ גלוטרלדהיד. ציר ה- Y מציג את הכמויות היחסיות של החלבונים דרך מעבר הצבע, המחושב כעוצמת האות בשברים, ביחס לשבר הראשון המציג אות מעל הרקע (Fn/ F1). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זיהוי מתחמי שכפול לפי דף מקורי ואימונובלוט. עליקוטים של שברים 11 ו-12 מהשיפוע המוצג באיור 2 הופרדו על ידי אלקטרופורזה על ג'ל מקורי אקרילמיד 8% ונחשפו לאימונובלט עם נוגדן נגד CBP. חלבונים אינם מזוהים כמו להקות כי מתחמים גדולים מדי כדי להפריד על ג'לים מקומיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חלבון-חלבון וחומצות ריבונוקלאיות-חלבון אינטראקציות ניתן לייצב באמצעות חומרים crosslinking. חשוב כי המתחם המתקבל יציב לעמוד ultracentrifugation על מעבר צבע גליצריול. בנוסף, תנאי המאגר אמורים לאפשר את האינטראקציה, אך מחמירים מספיק כדי להימנע מאיגוד לא ספציפי. בניסויים המוצגים כאן, השתמשנו בפתרון חיץ שכבר הוקם עבור תגובות15.
המהירות וזמן של צנטריפוגה צריך להיות מותאם עבור המתחמים מנותחים. בדקנו תנאי משקעים שונים, דגימות צנטריפוגה ב 94,000 x g ו 194,000 x g עבור 16 שעות ב 4 °C (70 °F), עם תוצאות דומות. פקדים אלה חשובים כדי לקבוע את התנאים שבהם המתחמים המנותחים אינם מזרזים.
בדקנו גם שיטות כתם שונות, צינור ישירות על הממברנה, באמצעות חריץ כתם או מערכות כתם נקודה, אשר הראה כי כתם נקודה נתן תוצאות לשחזור יותר.
מגבלה מרכזית של שימוש glutaraldehyde כמו crosslinker היא כי הקישור לא ניתן להחזיר. לכן, חלבונים לא ניתן לנתח על ידי אימונובלוט לאחר SDS-PAGE, אבל רק על ידי ג'לים מקומיים או כתם נקודה. עם זאת, סוכני קישור צולב הפיך, כגון פורמלדהיד, עשוי לשמש גם.
השתמשנו בעבר בשיתוף אימונופרציפיטציה של חלבונים כדי לזהות מתחמי חוג, אך במקרה של אינטראקציות חולפות או חלשות7, crosslink עשוי לעזור לבידוד של מתחמי ביניים לקביעת מרכיביהם מאוחר יותר על ידי ספקטרומטריית מסה. למרות שההתמקדות שלנו כאן הייתה spliceosome, שיטה זו בהחלט יכולה לשמש לבידוד של תהליכים דינמיים אחרים הכוללים מתחמי ביניים עם קומפוזיציות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק FAPESP (15/06477-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).
- Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
- Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
- Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
- Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
- Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
- Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
- Dunn, E. A., Rader, S. D. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Hertel, K. J. 1126, 123-135 (2014).
- Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
- Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
- Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J.
