Summary
Aqui, descrevemos a utilização do Grafix (Gradient Fixation), uma centrifugação de gradiente de glicerol na presença de um crosslinker, para identificar interações entre fatores de emenda que se ligam transitoriamente ao complexo de emendas.
Abstract
O emendamento pré-mRNA é um processo muito dinâmico que envolve muitos rearranjos moleculares dos subcoplexos de emenda durante a montagem, processamento de RNA e liberação dos componentes complexos. A centrifugação de gradiente de glicerol tem sido usada para a separação de complexos de proteínas ou RNP (RiboNucleoProtein) para estudos funcionais e estruturais. Aqui, descrevemos a utilização do Grafix (Gradient Fixation), que foi desenvolvido pela primeira vez para purificar e estabilizar complexos macromoleculares para microscopia crio-elétron de partículas únicas, para identificar interações entre fatores de emenda que se ligam transitoriamente ao complexo de emendas. Este método baseia-se na centrifugação das amostras em uma concentração crescente de um reagente de fixação para estabilizar complexos. Após a centrifugação de extratos totais de levedura carregados em gradientes de glicerol, as frações recuperadas são analisadas por mancha de ponto para a identificação dos sub complexidades e determinação da presença de fatores de emenda individuais.
Introduction
O splicing é um processo altamente dinâmico que requer a vinculação e liberação de uma infinidade de fatores de forma coordenada. Esses fatores de emenda incluem proteínas de ligação de RNA, ATPases, helicases, quinases de proteínas e fosfattases, ligaduras de ubiquitina, entre outros1,2,3; e para permitir que os rearranjos moleculares ocorram, alguns desses fatores se ligam muito transitoriamente aos subcoplexos de emenda, tornando muito desafiador o isolamento e identificação desses complexos intermediários RNP.
Aqui, utilizamos o método Grafix4,5 para estabilizar a interação do fator de emenda da levedura Cwc24 com o complexo deato B6 para permitir a identificação de outros fatores ligados concomitantemente a esse subcoplexo e determinar se a ligase ubiquitina Prp19 desempenha algum papel na vinculação ou liberação do complexo Cwc24 para o Complexo de Dezenove (NTC) e até o final de 5' do intron antes da ativação e a primeira reação de transesterificação leva lugar. A vantagem de expor as macromoléculas a uma concentração crescente do crosslinker ao longo do gradiente de glicerol é que ele evita inter-complexos crosslinks4,5, e, portanto, a formação de agregados.
Este método foi utilizado como complementação para a co-doença da proteína e ensaios puxados para baixo, que, apesar de permitir o isolamento de grandes complexos, pode não ser confiável para manter interações transitórias dentro de grandes complexos dinâmicos7,8. O uso de reagentes de fixação no gradiente de glicerol estabiliza a vinculação de tais fatores, permitindo a confirmação de interações de proteínas específicas com subcomplexos de emenda. Como o crosslinker escolhido era quimicamente irreversível, as proteínas presentes nas frações recuperadas foram analisadas por mancha de ponto após a centrifugação gradiente.
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Protocol
1. Preparação total do extrato de levedura
- Cresça as células de levedura expressando um dos fatores de emenda fundidos à tag TAP9 em 1 L YNB-glu (Base de Nitrogênio levedura suplementada com 2% m/v de glicose) com os aminoácidos apropriados ou bases nucleicas, neste caso, adenina (20 μg/mL), leucina (30 μg/mL), triptofano (30 μg/mL), até OD600 = 1,0.
- Colete as células da cultura 1 L por centrifugação em três garrafas centrífugas de centrífugas de 500 mL a 17.000 x g por 10 min a 4 °C e lave duas vezes com água estéril fria de 10 mL.
- Resuspenha as células de levedura coletadas em 1/10 do volume celular do tampão frio A (10 mmol L-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 mmol L-1 MgCl2, 50 mmol L-1 KCl, 5% v/v glicerol, 0,5 mmol L-1 DTT, Coquetel Inibidor de Protease sem EDTA).
- Congele pequenas gotas de suspensão celular em nitrogênio líquido. As pequenas gotas podem ser obtidas com a pipetação da solução celular resuspended e a queda de 50 μL diretamente em nitrogênio líquido.
ATENÇÃO: O nitrogênio líquido pode causar lesões em contato com a pele ou os olhos. Manuseie usando equipamentos de segurança apropriados.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. As gotas congeladas de suspensão celular podem ser armazenadas a -80 °C. - Prepare as células de levedura lysates moendo em um dispositivo Ball Mill através de seis ciclos a 20 Hz/s por 3 min.
NOTA: Após cada ciclo, mergulhe o recipiente que abriga as células congeladas em nitrogênio líquido para evitar o derretimento. O protocolo pode ser pausado aqui. Os extratos congelados podem ser armazenados a -80 °C. Extratos de emenda à levedura também podem ser preparados usando homogeneizadores para liseste de esferoplastos10, ou usando argamassa e pilão11,12. - Derreta o extrato colocando os tubos que os contêm na água à temperatura ambiente, tremendo ocasionalmente.
- Extratos de centrífuga a 45.000 x g por 1h a 4 °C.
- Quantifique o teor proteico do supernanato limpo pelo método BCA13.
- Prepare alíquotas dos extratos, congele-os rapidamente em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Preparação do gradiente de glicerol
- Prepare duas soluções de glicerol no Buffer A, uma contendo 10% v/v e outra contendo 30% v/v de glicerol.
- Adicione o glutaraldeído do agente de crosslinking a 0,1% v/v na solução de glicerol v/v de 30% v/v e misture para homogeneizar.
ATENÇÃO: Manuseie o glutaraldeído dentro do capô da fumaça usando equipamentos de segurança adequados. - Adicione 6 mL da solução de glicerol de 10% v/v no fundo do tubo centrífuga de 12 mL (14 x 89 mm).
- Adicione 6 mL da solução de glicerol de 30% v/v a frio complementada com glutaraldeído com uma seringa presa a uma agulha longa fornecida com o dispositivo Gradiente Mestre na parte inferior do tubo, logo abaixo da solução de glicerol v/v de 10%.
NOTA: Alternativamente, a solução de glicerol de 10% v/v pode ser cuidadosamente encarsa na parte superior da solução de glicerol/glutaraldeído de 30% v/v. - Use o dispositivo Gradiente Mestre para gerar um gradiente de densidade contínua.
NOTA: No dispositivo Gradiente Mestre, os tubos são colocados em um rack apropriado e girados brevemente, seguindo as recomendações do fabricante para determinar os parâmetros (tempo/ângulo/velocidade). Neste trabalho foram utilizados: 2:25 min/81.5°/11 rpm. - Adicione cuidadosamente 200 μL de uma almofada de 7% v/v glicerol/tampão A na parte superior pouco antes da adição dos extratos celulares.
NOTA: A concentração de glicerol da almofada deve ser inferior à solução menos concentrada de glicerol usada para criar o gradiente linear.
3. Extrai centrifugação
- Carregue aproximadamente 2 mg de proteína total no topo de cada 12 mL de gradiente linear de glicerol 10%-30% glutaraldeído com almofada.
- Coloque os tubos em um rotor pré-resfriado.
NOTA: Manuseie os tubos suavemente para evitar a mistura antes da ultracentrifugação. - Centrifugar a 194.000 x g para 16 h a 4 °C.
- Alíquota de 12 mL em 24 frações de 500 μL usando um EconoSystem adaptado ou por pipetação cuidadosa.
NOTA: Um EconoSystem adaptado consiste em uma bomba peristáltica, o detector UV e o coletor de frações conectado ao dispositivo perfurante do tubo. O perfil de sedimentação pode ser monitorado pela medição da absorvância a 280 nm. - Use uma solução de glicerol de 40% v/v através da bomba peristáltica para empurrar o glicerol de 10%-30% de gradiente do tubo para o coletor de frações.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Armazene as frações a -80 °C até o uso. - Carregue 50 μL de cada fração diretamente em membranas de nitrocelulose em um dispositivo de mancha de ponto ou entalhe. Detecte proteína por imunoblot usando anticorpo contra CBP (1:6.000, para detectar a porção CBP da tag TAP) e anti-coelho IgG conjugado com Peroxidase de Rabanete (1:15.000) como o anticorpo secundário.
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Representative Results
Para analisar o perfil de sedimentação do Cwc24-TAP e determinar se o método Grafix foi eficaz para estabilizar sua vinculação a subcomplexos de emenda, separamos extratos totais de leveduras de células expressando Cwc24-TAP através da centrifugação em gradientes de glicerol, na presença ou ausência de glutaraldeído como agente de ligação cruzada. Amostras de 24 frações de 500 μL foram então analisadas por mancha de slot com anticorpo contra a porção CBP da tag TAP. Os resultados mostram que, na ausência do crosslinker, o Cwc24 está concentrado entre as frações 5 e 13(Figura 1B),correspondentes a complexos de cerca de 80 a 200 MDa14. Na presença do crosslinker, no entanto, a posição de Cwc24 no gradiente é deslocada para frações na parte inferior do gradiente, correspondendo a complexos maiores(Figura 1). Esses resultados indicam que o glutaraldeído estabiliza a associação do Cwc24 com complexos de emenda.
Para estabelecer se os complexos que retêm o Cwc24 correspondem ao complexo Bact, que é formado pelos snRNPs U2, U5 e U6 e o complexo NTC, comparamos a sedimentação Cwc24 com as da subunidade U5 snRNP Prp8 e da subunidade NTC Prp19. As cepas de levedura que expressavam qualquer uma dessas proteínas fundidas à tag TAP foram submetidas à Grafix, seguido por mancha de ponto para a detecção das proteínas. Estas três subunidades de emendas apresentaram perfis semelhantes, sedimentando-se com complexos maiores na parte inferior do gradiente. O Cwc24 está concentrado nas mesmas frações, mas por associar-se transitoriamente com o emendatório, também está presente nas frações mais leves(Figura 2). A quantificação dos pontos mostra esses perfis (Figura 2B).
Curiosamente, as frações 11 e 12 são aquelas em que Prp8 e Prp19 começam a se concentrar, sugerindo que esta é a porção do gradiente onde o complexo bact começa a sedimentar. Para verificar se essas proteínas estão ligadas a complexos nessas frações, alíquotas das frações 11 e 12 foram submetidas à eletroforese em géis nativos e, posteriormente, à mancha ocidental. Sinais de Prp8 e Prp19 aparecem como manchas que mal entram em um gel de acrilamida de 8%, mostrando que, na verdade, fazem parte de grandes complexos(Figura 3). Cwc24 também está presente na fração 12, mas em concentração muito menor, consistente com sua ligação transitória ao complexo Bact. Esses resultados mostram que o glutaraldeído pode ser usado como um crosslinker para estabilizar a vinculação de fatores transitórios aos subcoplexos de emenda.
Figura 1: Grafix mantém Cwc24 associado a complexos maiores. O extrato total de leveduras das células expressas Cwc24-TAP foi separado por centrifugação em gradientes de glicerol, seja na ausência ou presença do glutaraldeído crosslinker. (A) Frações ímpares do gradiente foram submetidas à mancha de slot para a imunodetação de Cwc24-TAP com anticorpo contra a porção CBP da tag TAP. (B) Quantificação de Cwc24-TAP utilizando imagem J mostra a concentração da proteína através das frações do gradiente de glicerol. A presença ou ausência de glutaraldeído é indicada. O eixo Y mostra as quantidades relativas de Cwc24 através do gradiente, calculadas como a intensidade do sinal nas frações, em relação à primeira fração (Fn/F1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Sedimentação de fatores de emenda através de gradientes de glicerol/glutaraldeído. Extratos de células de levedura expressando Cwc24, Prp8 ou Prp19 fundidos à tag TAP foram carregados em gradientes de glicerol contendo glutaraldeído e centrífugas para a separação de complexos de emenda. (A) As amostras das vinte e quatro frações do gradiente foram analisadas por mancha de ponto e imunodetação das proteínas fundidas tap com anticorpo contra a porção CBP da tag TAP. (B) Quantificação das proteínas que utilizam a Imagem J mostra sua concentração nas frações inferiores do gradiente de glicerol/glutaraldeído. O eixo Y mostra as quantidades relativas das proteínas através do gradiente, calculadas como a intensidade do sinal nas frações, em relação à primeira fração mostrando um sinal acima do fundo (Fn/F1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Detecção de complexos de emenda por PAGE nativo e imunoblot. As alíquotas das frações 11 e 12 do gradiente mostradas na Figura 2 foram separadas por eletroforese em gel nativo de acrilamida de 8% e submetidas a imunobloto com anticorpo contra CBP. Proteínas não são detectadas como bandas porque os complexos são grandes demais para se separar em géis nativos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Interações proteína-proteína e ácidos ribonucleicos-proteínas podem ser estabilizadas usando agentes de crosslinking. É importante que o complexo resultante seja estável para suportar a ultracentrifugação no gradiente de glicerol. Além disso, as condições do buffer devem permitir a interação, mas ser rigorosas o suficiente para evitar ligações não específicas. Nos experimentos aqui mostrados, utilizamos uma solução tampão já estabelecida para reações in vitro de emenda15.
A velocidade e o tempo de centrifugação devem ser otimizados para os complexos analisados. Testamos diferentes condições de sedimentação, centrifugando amostras a 94.000 x g e 194.000 x g para 16 h a 4 °C, com resultados semelhantes. Esses controles são importantes para determinar as condições em que os complexos analisados não precipitam.
Também testamos diferentes métodos de manchas, pipetando diretamente na membrana, usando sistemas de manchas de fenda ou manchas de ponto, que mostraram que a mancha de ponto deu resultados mais reprodutíveis.
Uma grande limitação do uso do glutaraldeído como um crosslinker é que o crosslink não pode ser revertido. Portanto, as proteínas não podem ser analisadas por imunoblot após ODS-PAGE, mas apenas por géis nativos ou mancha de ponto. No entanto, agentes reversíveis de crosslinking, como o formaldeído, poderiam potencialmente também ser usados.
Anteriormente, utilizamos a co-imunoprecipitação de proteínas para identificar complexos de emenda, mas no caso de interações transitórias ou fracas7,o crosslink pode ajudar o isolamento de complexos intermediários para posterior determinação de seus componentes por espectrometria de massa. Embora nosso foco aqui tenha sido o emendamento, este método certamente pode ser usado para o isolamento de outros processos dinâmicos que incluem complexos intermediários com composições variadas.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da FAPESP (15/06477-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).
- Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
- Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
- Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
- Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
- Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
- Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
- Dunn, E. A., Rader, S. D. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Hertel, K. J. 1126, 123-135 (2014).
- Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
- Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
- Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J.
