Summary
Здесь мы описываем использование Grafix (Gradient Fixation), центрифугирования градиента глицерина в присутствии сшивающего фактора, для выявления взаимодействий между факторами сплайсинга, которые временно связываются со сплайсеосомным комплексом.
Abstract
Сплайсинг премрнК является очень динамичным процессом, который включает в себя множество молекулярных перестроек подкомплексов сплайсеосом во время сборки, обработки РНК и высвобождения сложных компонентов. Градиентное центрифугирование глицерина было использовано для разделения белковых или RNP (RiboNucleoProtein) комплексов для функциональных и структурных исследований. Здесь мы описываем использование Grafix (Градиентная фиксация), который был впервые разработан для очистки и стабилизации макромолекулярных комплексов для криоэлектроно-микроскопии одиночных частиц, для выявления взаимодействий между факторами сплайсинга, которые временно связываются со сплайсеосомным комплексом. Этот метод основан на центрифугирование образцов в возрастающую концентрацию фиксирующим реагентом для стабилизации комплексов. После центрифугирования дрожжевых общих экстрактов, нагруженных на градиенты глицерина, восстановленные фракции анализируют точечным пятном для выявления подкомплексов сплайсеосом и определения наличия отдельных факторов сплайсинга.
Introduction
Сплайсинг является очень динамичным процессом, который требует скоординированного связывания и высвобождения множества факторов. Эти сплайсинговые факторы включают РНК-связывающие белки, АТФазы, геликазы, протеинкиназы и фосфатазы, убиквитиновые лигазы, среди прочих1,2,3; и чтобы обеспечить молекулярные перестройки, некоторые из этих факторов очень временно связываются с подкомплексами сплайсеосом, что делает выделение и идентификацию этих промежуточных комплексов RNP очень сложной.
Здесь мы использовали методGrafix 4,5 для стабилизации взаимодействия фактора сращивания дрожжей Cwc24 с комплексом 6акта B, чтобы позволитьидентифицировать другие факторы, связанные одновременно с этим подкомплексом, и определить, играет ли убиквитин-лигаза Prp19 какую-либо роль в связывании или высвобождении Cwc24 с комплексом Nineteen (NTC) и с 5' концом интрона до активации и первой реакции трансетерификации место. Преимущество воздействия макромолекул на возрастающую концентрацию сшивки вдоль градиента глицерина заключается в том, что оно позволяет избежать межкомплексных сшивок4,5,а значит, и образования агрегатов.
Этот метод был использован в качестве дополнения к белкам коиммунопреципитации и вытягивания анализов, которые, несмотря на возможность выделения крупных комплексов, могут быть ненадежными для поддержания переходных взаимодействий в больших динамических комплексах7,8. Применение реагентов фиксации в градиенте глицерина стабилизирует связывание таких факторов, позволяя подтвердить взаимодействие специфических белков со сплайсинговыми подкомплексами. Поскольку выбранный сшиватель был химически необратимым, белки, присутствующие в восстановленных фракциях, анализировали методом точечного пятна после градиентного центрифугирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Общий экстракт дрожжей
- Выращивают дрожжевые клетки, экспрессирующие один из сплайсинговых факторов, слитых с меткой TAP9 в 1 л YNB-клеевой среде (дрожжевая азотная основа, дополненная 2% м/об глюкозы) с соответствующими аминокислотами или нуклеиновыми основаниями, в данном случае аденин (20 мкг/мл), лейцин (30 мкг/мл), триптофан (30 мкг/мл), до ОД 600=1,0.
- Соберите клетки из культуры 1 л путем центрифугирования в трех бутылках центрифуги по 500 мл при 17 000 х г в течение 10 мин при 4 °C и дважды промыть 10 мл холодной стерильной водой.
- Повторно суспендировали собранные дрожжевые клетки в 1/10 клеточного объема холодного буфера А (10 ммольL-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 ммоль L-1 MgCl2, 50 ммоль L-1 KCl, 5% v/v глицерина, 0,5 ммоль L-1 DTT, коктейль ингибитора протеазы без ЭДТА).
- Заморозить небольшие капли клеточной суспензии в жидком азоте. Небольшие капли могут быть получены путем пипетирования повторно суспендированного клеточного раствора и капли 50 мкл непосредственно в жидкий азот.
ВНИМАНИЕ: Жидкий азот может вызвать травмы при контакте с кожей или глазами. Управление с использованием соответствующего защитного оборудования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Замороженные капли клеточной суспензии можно хранить при -80 °C. - Приготовьте лизаты дрожжевых клеток путем измельчения в шаровом устройстве через шесть циклов при частоте 20 Гц/с в течение 3 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: После каждого цикла погружайте контейнер с замороженными клетками в жидкий азот, чтобы избежать плавления. Здесь протокол можно приостановить. Замороженные экстракты могут храниться при -80 °C. Дрожжевые сращивающие экстракты также могут быть приготовлены с использованием гомогенизаторов для лизута сферопластов10или с использованием ступки ипестиков 11,12. - Расплавьте экстракт, поместив содержащие их трубки в воду комнатной температуры, периодически встряхивая.
- Центрифужные экстракты при 45 000 х г в течение 1 ч при 4 °C.
- Количественно оценить содержание белка в очищенном супернатанте методом13BCA.
- Приготовьте аликвоты экстрактов, быстро заморозьте их в жидком азоте и храните при -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.
2. Подготовка градиента глицерина
- Приготовьте два раствора глицерина в буфере А, один из которых содержит 10% v/v, а другой содержит 30% v/v глицерина.
- Добавляют сшивающий агент глутаровый альдегид до 0,1% v/v в 30% v/v растворе глицерина и смешивают для гомогенизации.
ВНИМАНИЕ: Обрабатывайте глутаровый альдегид внутри вытяжного капота, используя соответствующее защитное оборудование. - Добавьте 6 мл холодного 10% v/v раствора глицерина в нижнюю часть 12 мл центрифужной трубки (14 x 89 мм).
- Добавьте 6 мл холодного 30% v/v раствора глицерина, дополненного глутаральным альдегидом, шприцем, прикрепленным к длинной игле, снабженной устройством Gradient Master в нижней части трубки, чуть ниже 10% v/v раствора глицерина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, 10% v/v раствор глицерина может быть тщательно пипетирован поверх 30% v/v раствора глицерина/глутаральдегида. - Используйте устройство Gradient Master для создания непрерывного градиента плотности.
ПРИМЕЧАНИЕ: В устройстве Gradient Master трубки помещаются в соответствующую стойку и поворачиваются кратковременно, следуя рекомендациям завода-изготовителя по определению параметров (время/угол/скорость). В этой работе мы использовали: 2:25 мин/81,5°/11 об/мин. - Осторожно добавьте 200 мкл 7% v/v глицерина/буфера подушки A сверху непосредственно перед добавлением клеточных экстрактов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация глицерина в подушке должна быть ниже, чем в менее концентрированном растворе глицерина, используемом для создания линейного градиента.
3. Центрифугирование экстрактов
- Загрузите примерно 2 мг общего белка поверх каждого 12 мл линейного градиента глицерина 10%-30% глутарового альдегида с подушкой.
- Поместите трубы в предварительно охлажденный ротор с поворотным ковшом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно обрабатывайте трубки, чтобы избежать смешивания перед ультрацентрифугированием. - Центрифуга при 194 000 х г в течение 16 ч при 4 °C.
- Aliquot каждая трубка 12 мл в двадцати четырех фракциях 500 мкл с использованием адаптированной системы EconoSystem или путем тщательного пипетирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптированная система EconoSystem состоит из перистальтического насоса, УФ-детектора и дробного коллектора, подключенного к трубчато-перфораторному устройству. Профиль осаждения можно контролировать путем измерения поглощения при 280 нм. - Используйте 40% v/v раствор глицерина через перистальтический насос, чтобы протолкнуть 10-30% градиент глицерина из трубки в коллектор фракции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Хранить фракции при -80 °C до использования. - Загрузите 50 мкл каждой фракции непосредственно на нитроцеллюлозные мембраны на устройстве точечного пятна или щелевого пятна. Обнаруживать белок иммуноблотом с использованием антител против CBP (1: 6000, для обнаружения cbP-части метки TAP) и анти-кроликов IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (1: 15 000) в качестве вторичного антитела.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы проанализировать профиль седиментации Cwc24-TAP и определить, был ли метод Grafix эффективен для стабилизации его связывания со сплайсинг-подкомплексами, мы разделили общие дрожжевые экстракты клеток, экспрессирующих Cwc24-TAP, путем центрифугирования на градиентах глицерина, в присутствии или отсутствии глутарового альдегида в качестве сшивающего агента. Образцы двадцати четырех фракций 500 мкл затем анализировали путем прослойки с антителом против части CBP метки TAP. Результаты показывают, что при отсутствии сшивателя Cwc24 концентрируется между фракциями 5 и 13(фиг.1B),соответствующим комплексам примерно от 80 до 200МДа 14. Однако при наличии сшивки положение Cwc24 на градиенте смещается на дроби в нижней части градиента, соответствующие более крупным комплексам(рисунок 1). Эти результаты указывают на то, что глутаровый альдегид стабилизирует ассоциацию Cwc24 со сплайсинг-комплексами.
Чтобы установить, соответствуют ли комплексы, сохраняющие Cwc24, комплексу Bact, который образован snRNPs U2, U5 и U6 и комплексом NTC, мы сравнили осаждение Cwc24 с субъединицы U5 snRNP Prp8 и субъединицы NTC Prp19. Штаммы дрожжей, экспрессирующие любой из этих белков, слитых с меткой TAP, подвергались Grafix, с последующим точечным пятном для обнаружения белков. Эти три сплайсеосомные субъединицы показали сходные профили, осаждение с более крупными комплексами в нижней части градиента. Cwc24 сосредоточен в тех же фракциях, но поскольку он временно ассоциируется со сплайсеосомой, он также присутствует в более легких фракциях(рисунок 2). Количественная оценка точек показывает эти профили(рисунок 2B).
Интересно, что фракции 11 и 12 — это те, где Prp8 и Prp19 начинают концентрироваться, предполагая, что это та часть градиента, где комплекс Бакта начинает отлагаться. Чтобы установить, что эти белки связаны с комплексами в этих фракциях, аликвоты фракций 11 и 12 подвергали электрофорезу на нативных гелях и впоследствии вестерн-блотту. Сигналы Prp8 и Prp19 появляются в виде мазков, которые едва входят в 8% акриламидный гель, показывая, что они действительно являются частью крупных комплексов(рисунок 3). Cwc24 также присутствует во фракции 12, но в гораздо более низкой концентрации, что согласуется с его переходным связыванием с комплексом Bact. Эти результаты показывают, что глутаровый альдегид может быть использован в качестве сшивающего фактора для стабилизации связывания переходных факторов со сращивающими подкомплексами.
Рисунок 1: Grafix удерживает Cwc24, связанный с более крупными комплексами. Общий дрожжевой экстракт клеток, экспрессировающих Cwc24-TAP, отделяли центрифугированием на градиентах глицерина, либо в отсутствие, либо в присутствии сшивающего глутарового альдегида. (A) Нечетные фракции градиента подвергали прослойке для иммунодетекции Cwc24-TAP с антителом против части CBP метки TAP. (B) Количественная оценка Cwc24-TAP с использованием изображения J показывает концентрацию белка через фракции градиента глицерина. Указывается наличие или отсутствие глутарового альдегида. Ось Y показывает относительные величины Cwc24 через градиент, вычисляемые как интенсивность сигнала в дробях, относительно первой дроби (Fn/F1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Осаждение факторов сплайсинга через градиенты глицерина/глутаральдегида. Экстракты дрожжевых клеток, экспрессировающих Cwc24, Prp8 или Prp19, сплавленные с меткой TAP, загружали на градиенты глицерина, содержащие глутаровый альдегид, и центрифугировали для разделения комплексов сплайсинга. Образцыдвадцати четырех фракций градиента были проанализированы путем точечного промоктирования и иммунодетекции ТАП-сплавленных белков с антителами против cbP-части метки TAP. (B)Количественная оценка белков с использованием изображения J показывает их концентрацию в нижних фракциях градиента глицерина/глутаральдегида. Ось Y показывает относительные количества белков через градиент, рассчитанный как интенсивность сигнала во дробях, относительно первой дроби, показывающей сигнал выше фона (Fn/F1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Обнаружение сплайсинговых комплексов с помощью нативного PAGE и иммуноблота. Аликвоты фракций 11 и 12 градиента, показанного на фиг.2, разделяли электрофорезом на 8% акриламидном нативном геле и подвергали иммуноблоту с антителом против CBP. Белки не обнаруживаются в виде полос, потому что комплексы слишком велики, чтобы разделяться на нативных гелях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Взаимодействие белка с белком и рибонуклеиновой кислотой и белком может быть стабилизировано с помощью сшивающих агентов. Важно, чтобы полученный комплекс был стабилен, чтобы выдерживать ультрацентрифугирование на градиенте глицерина. Кроме того, условия буфера должны допускать взаимодействие, но быть достаточно строгими, чтобы избежать неспецифического связывания. В экспериментах, показанных здесь, мы использовали буферный раствор, уже установленный для реакций сплайсинга in vitro15.
Скорость и время центрифугирования должны быть оптимизированы для анализируемых комплексов. Мы протестировали различные условия осаждения, центрифугируя образцы при 94 000 х г и 194 000 х г в течение 16 ч при 4 °C, с аналогичными результатами. Эти средства контроля важны для определения условий, в которых анализируемые комплексы не выпадают в осадок.
Мы также протестировали различные методы блоттинга, пипетирование непосредственно на мембране, используя системы точечного блоттинга или точечного блоттинга, которые показали, что точечное пятно дает более воспроизводимые результаты.
Основным ограничением использования глутаральдегида в качестве сшивателя является то, что сшивка не может быть возвращена. Поэтому белки не могут быть проанализированы иммуноблотом после SDS-PAGE, а только нативными гелями или точечным пятном. Однако обратимые сшивающие агенты, такие как формальдегид, потенциально также могут быть использованы.
Ранее мы использовали коиммунопреципитацию белков для идентификации сплайсинговых комплексов, но в случае переходных или слабых взаимодействий7сшивание может помочь выделению промежуточных комплексов для последующего определения их компонентов масс-спектрометрией. Хотя наше внимание здесь было сосредоточено на сплайсеосоме, этот метод, безусловно, может быть использован для выделения других динамических процессов, которые включают промежуточные комплексы с различным составом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом FAPESP (15/06477-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).
- Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
- Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
- Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
- Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
- Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
- Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
- Dunn, E. A., Rader, S. D. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Hertel, K. J. 1126, 123-135 (2014).
- Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
- Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
- Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J.
