Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Évaluation de la dispersion du biofilm dans les plaies murines

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62136
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,2,3
1Department of Surgery, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Immunology and Molecular Microbiology, Texas Tech University Health Sciences Center, 3TTUHSC Surgery Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Ici, nous décrivons des méthodes ex vivo et in vivo pour évaluer la dispersion bactérienne d’une infection de blessure chez la souris. Ce protocole peut être utilisé pour tester l’efficacité des thérapies topiques antimicrobiennes et anti-biofilm, ou pour évaluer la capacité de dispersion de différentes souches ou espèces bactériennes.

Abstract

Les infections liées au biofilm sont impliquées dans un large éventail de maladies chroniques telles que les ulcères du pied diabétique non cicatrisants, la sinusite chronique, l’otite moyenne récurrente et bien d’autres. Les cellules microbiennes de ces infections sont protégées par une substance polymère extracellulaire (EPS), qui peut empêcher les antibiotiques et les cellules immunitaires hôtes d’éliminer l’infection. Pour surmonter cet obstacle, les chercheurs ont commencé à développer des agents de dispersion en tant que thérapies potentielles. Ces agents ciblent divers composants dans l’EPS du biofilm, affaiblissant la structure et initiant la dispersion des bactéries, ce qui peut théoriquement améliorer la puissance antibiotique et la clairance immunitaire. Pour déterminer l’efficacité des agents de dispersion pour les infections des plaies, nous avons développé des protocoles qui mesurent la dispersion du biofilm ex vivo et in vivo. Nous employons un modèle chirurgical d’excision de souris qui a été bien-décrit pour créer des infections chroniques biofilm-associées de blessure. Pour surveiller la dispersion in vivo,nous infectons les plaies avec des souches bactériennes qui expriment la luciférase. Une fois que les infections matures se sont établies, nous irrigueons les plaies avec une solution contenant des enzymes qui dégradent les composants de l’EPS du biofilm. Nous surveillons ensuite l’emplacement et l’intensité du signal luminescent dans les organes filtrants et filtrants pour fournir des informations sur le niveau de dispersion atteint. Pour l’analyse ex vivo de la dispersion du biofilm, le tissu de la plaie infectée est immergé dans une solution enzymatique dégradant le biofilm, après quoi la charge bactérienne restant dans le tissu, par rapport à la charge bactérienne en solution, est évaluée. Les deux protocoles ont des forces et des faiblesses et peuvent être optimisés pour aider à déterminer avec précision l’efficacité des traitements de dispersion.

Introduction

L’augmentation de la résistance aux antibiotiques dans le monde entier conduit à un manque d’options antibiotiques pour traiter une variété d’infections bactériennes1. En plus de la résistance aux antibiotiques, les bactéries peuvent gagner en tolérance aux antibiotiques en adoptant un mode de vie associé au biofilm2. Un biofilm est une communauté de micro-organismes qui sont protégés par une matrice de polysaccharides, d’ADN extracellulaire, de lipides et de protéines3,collectivement appelée substance polymère extracellulaire (EPS). Alors que la crise de la résistance aux antibiotiques se poursuit, de nouvelles stratégies qui prolongent l’utilisation des antibiotiques ou renforcent leur efficacité font cruellement défaut. Les agents anti-biofilm sont une solution prometteuse4.

Parmi les différentes stratégies anti-biofilm qui ont été proposées, l’utilisation d’agents de dispersion, qui ciblent différents composants de l’EPS du biofilm, est à la pointe du développement thérapeutique5. Les hydrolases glycosides (GH) sont l’une de ces classes d’agents de dispersion. GH sont une grande classe d’enzymes qui catalysent le clivage de différentes liaisons dans les polysaccharides qui fournissent l’intégrité structurelle à l’EPS. Notre groupe, ainsi que d’autres, ont montré que gh peut dégrader efficacement les biofilms, induire la dispersion et améliorer l’efficacité antibiotique pour un certain nombre d’espèces bactériennes différentes, à la fois in vitro et in vivo6,7,8,9,10,11.

Compte fait l’intérêt croissant pour la dispersion du biofilm, il est important de mettre au point des méthodes efficaces pour évaluer l’efficacité de la dispersion. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour le traitement des infections des plaies associées au biofilm avec un agent de dispersion chez la souris, et l’évaluation de l’efficacité de la dispersion, in vivo et ex vivo. L’objectif global est de fournir des méthodes efficaces qui peuvent être utilisées avec des modèles précliniques pour mesurer la dispersion du biofilm de manière efficace et efficiente.

Un modèle murin d’infection chirurgicale d’excision a été employé dans ces études pour établir une infection biofilm-associée. Nous avons utilisé ce modèle pendant plus de 15 ans et publié nos observationsabondamment 7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. En général, il s’agit d’un modèle d’infection non létale où les bactéries restent localisées au lit de la plaie et sont associées au biofilm (bactéries observées dans des agrégats entourés d’EPS), mettant en place une infection chronique qui dure jusqu’à 3 semaines. Cependant, si les souris sont immunodéprimées (avec le diabète de type 1 par exemple), elles peuvent devenir plus susceptibles de développer une infection systémique mortelle dans ce modèle.

Dans ce rapport, nous fournissons des protocoles pour évaluer la dispersion des bactéries d’une blessure, in vivo et ex vivo. Les deux protocoles peuvent être utilisés pour examiner l’efficacité d’un agent de dispersion et ont leurs propres forces et faiblesses. Par exemple, l’évaluation de la dispersion in vivo peut fournir des renseignements importants et en temps réel sur la propagation des bactéries à d’autres parties du corps après la dispersion et sur la façon dont l’hôte réagit. D’autre part, l’évaluation de la dispersion ex vivo peut être plus souhaitable pour le dépistage de plusieurs agents, doses ou formulations, car le tissu peut être divisé en plusieurs sections qui peuvent être testées séparément, réduisant ainsi le nombre de souris requis. Lors de l’évaluation de plusieurs agents, nous mesurons généralement la dispersion d’abord in vitro comme décrit précédemment 6,9,22. Nous testons ensuite les tests ex vivo les plus efficaces et réservons les tests in vivo pour un nombre limité d’agents très prometteurs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ce protocole animal a été examiné et approuvé par le Institutional Animal Care and Use Committee du Texas Tech University Health Sciences Center (numéro de protocole 07044). Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health.

1. Préparation des bactéries pour les infections de souris

REMARQUE: Ici, nous décrivons infecter les souris uniquement avec Pseudomonas aeruginosa. Cependant, d’autres espèces bactériennes peuvent être utilisées pour causer une infection. Les souches et matériaux bactériens sont détaillés dans la table des matériaux.

  1. Utiliser la souche pa1 de type sauvage pseudomonas aeruginosa portant le plasmide de luminescence pQF50-lux23 pour ces expériences comme décrit précédemment7.
  2. Cultiver des souches de P. aeruginosa dans des fioles d’Erlenmeyer déconcertées, en secouant à 200 tr/min, dans un bouillon Luria-Bertani (LB) à 37 °C pendant 16 à 20 h. Ajouter une concentration finale de 100 μg/mL d’ampicilline à la culture nocturne de PAO1(pQF50-lux) pour le maintien du plasmide.
  3. Sous-culture P. aeruginosa en ajoutant 100 μL de la culture de nuit à une fiole d’Erlenmeyer contenant 10 mL de bouillon LB avec une concentration finale de 100 μg/mL d’ampicilline. Puis cultiver pendant 2-2,5 h à 37 °C avec des secousses, jusqu’à une DOde 600 nm de 0,4, puis diluer en série (1:10) trois fois pour une dose infectieuse d’environ 104 cellules.

2. Préparation de l’enzyme de dispersion du biofilm

REMARQUE: Pour cette étude, nous utilisons une solution à 10% d’amylase et de cellulase à parts égales (5% de chacune), qui sera appelée « GH », pour le traitement de dispersion.

  1. Utilisez une solution de GH à 10% (p / v) d’amylase (de Bacillus subtilis)et de cellulase fongique (d’Aspergillus niger)diluée dans 1x tampon phosphate salin (PBS). Utilisez pbs comme traitement de contrôle du véhicule.
  2. Réchauffer tous les traitements à 37 °C pendant 30 min pour l’activation enzymatique.

3. Animaux de laboratoire et configuration préopératoire

  1. Souris domestiques, 5 compagnons de litière par cage, dans des conditions contrôlées par l’environnement, avec des cycles lumière /obscurité de 12 h et un accès approprié à la nourriture et à l’eau.
  2. De préférence, utilisez des souris Webster suisses femelles, âgées de 8 à 10 semaines.
  3. Peser les souris pour déterminer la quantité appropriée d’anesthésie à administrer.
  4. Administrer l’anesthésie par l’injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de kétamine 10 mg/kg de xylazine.
  5. Appliquez soigneusement de la crème pour les yeux (p. ex. Refresh P.M.) sur l’œil à l’aide d’un coton-tige pour réduire la sécheresse.
  6. Surveiller les paramètres physiologiques, y compris la fréquence respiratoire, la coloration de la peau et la température corporelle, tout au long de la chirurgie.

4. Chirurgie d’excision dorsale pleine épaisseur

  1. Évaluer le plan chirurgical de l’anesthésie par pincement des pincements aux pincements et surveillance de la fréquence respiratoire et de l’effort. Rasez la surface dorsale et appliquez une crème dépilatoire pendant 10 min (ou selon les instructions du produit), après quoi retirez doucement, en vous assurant que la peau était sèche.
  2. Pour la gestion de douleur, administrer 0,05 ml de lidocaïne par voie sous-cutanée dans le secteur à exciser, et injecter 0,02 ml de buprénorphine par voie sous-cutanée dans le broussaille du cou. Attendez 10 min pour vous assurer que la gestion de la douleur a été atteinte.
  3. Avant l’excision, désinfectez la surface dorsale à l’aide d’un écouvillon d’alcool et dessinez un cercle de 1,5 cm de diamètre vers la partie postérieure du dos. Maintenir un champ chirurgical stérile tout au long de la procédure et utilisé des instruments autoclavés et des gants stériles. Pour limiter la contamination, effectuez la chirurgie par un brûleur Bunsen allumé et utilisez des outils propres pour chaque animal.
  4. Administrer une plaie cutanée excisionnelle de pleine épaisseur au niveau du muscle panniculus avec des ciseaux chirurgicaux.
  5. Après l’excision, couvrir immédiatement les plaies avec un pansement en polyuréthane semi-perméable.
  6. Injecter environ 104 UFC de bactéries dans 100 μL de PBS sous le pansement, sur le lit de la plaie, pour établir une infection.
    REMARQUE: Les plaies peuvent également être infectées par plusieurs espèces de bactéries et /ou de champignons simultanément, ou en plaçant des biofilms pré-formés12,ou même des tissus de débridement extraits de patients19,sur le lit de la plaie.
  7. Après l’infection, placez les souris en cage avec des coussins chauffants et surveillez jusqu’à ce qu’elles retrouvent leur réflexe de redressement.
    REMARQUE: Assurez-vous que les souris n’ont pas froid car cela peut entraîner la mort.
  8. Établir des infections de plaie pour 48 h.
  9. Inspectez quotidiennement les pansements adhésifs pour les déchirures et les zones de non-adhérence et remplacez-les au besoin.

5. Traitement de dispersion in vivo

REMARQUE: Ici, nous décrivons l’administration des agents de dispersion en appliquant une série de 3 solutions topiques d’irrigation des plaies (Figure 1). Cependant, le protocole peut être adapté à d’autres types d’accouchement tels que l’application de gels, de crèmes ou de pansements.

  1. Placez les souris sous anesthésie isoflurane (à 3% et 1 L par minute d’oxygène) pendant l’administration des traitements.
  2. Préparer trois seringues de 1 mL, avec des aiguilles de 25 G, contenant 200 μL de traitement pour chaque souris.
  3. Injecter 200 μL de solution enzymatique ou de contrôle PBS sur la plaie en soulevant et en pinçant soigneusement la peau avec une pince, légèrement au-dessus de la plaie vers la tête de l’animal. Percez soigneusement la seringue à travers la peau soulevée et injectez lentement la solution entre le pansement et le lit de la plaie. Le pansement utilisé dans cette étude adhère souvent à la fois au lit de la plaie et au tissu environnant.
    1. Pour vous assurer que tout le lit de la plaie est recouvert d’une solution, soulevez doucement le pansement avec une pince, en l’éloignant du lit de la plaie, tout en injectant lentement la solution.
  4. Après le traitement, replacez les souris dans leurs cages pendant 30 min.
  5. Après 30 minutes d’exposition au traitement, ré-anesthésiez les souris avec de l’isoflurane et aspirez la solution avec une seringue, en vous assurant de percer dans la même zone qu’auparavant.
    REMARQUE: Cette solution aspirée contient des cellules bactériennes dispersées, qui peuvent être conservées pour diverses analyses en aval.
  6. Administrer les deuxième et troisième traitements d’irrigation comme le premier, en utilisant une nouvelle seringue à chaque fois.

6. Imagerie et analyse de la dispersion in vivo

REMARQUE: Si une souche luminescente de bactéries est utilisée pour initier l’infection, un système d’imagerie in vivo (IVIS) peut être utilisé pour visualiser la dispersion du lit de la plaie.

  1. Imager les souris immédiatement avant et après le traitement et à 10 et 20 h après le traitement(figure 2 et figure supplémentaire 1).
  2. Effectuer l’imagerie pendant que les souris sont sous anesthésie en les plaçant individuellement dans l’IVIS et en les imageant chacune pendant 5 s à une longueur d’onde de 560 nm. Enregistrez les images pour une analyse plus approfondie.
    REMARQUE: La longueur d’onde et le temps d’exposition optimaux dépendront du rapporteur utilisé et de l’instrument IVIS et du logiciel d’imagerie.
  3. Pour l’analyse, ouvrez les images dans le logiciel IVIS et sélectionnez la zone à analyser dans la palette d’outils.
  4. Pour tenir compte de l’arrière-plan, placez un cercle sur l’arrière-plan d’une photo, puis placez le même cercle de taille sur le lit de la plaie pour chaque souris.
  5. Pour télécharger des valeurs de mesure, sélectionnez Afficher -> mesures de la région d’intérêt (ROI) et téléchargez la table des mesures dans une feuille de calcul. Soustrayez la lecture du cercle de fond de chacune des mesures du lit de plaie pour calculer la luminescence pour chaque échantillon. Calculer le pourcentage de luminescence modifiée par :
    ROI pré-traitement-ROI post-traitement / ROI pré-traitement) x 100.
    REMARQUE: Les souris témoins et traitées doivent être analysées simultanément pour normaliser les variables qui peuvent affecter l’acquisition ou l’éclat de l’image.

7. Évaluation de la dispersion par détermination de l’UFC

  1. Euthanasier sans cruauté des souris par injection intrapéritonéale de 0,2 mL de sodium pentobarbital (p. ex. Fatal Plus) sous anesthésie avec 100 mg/kg de kétamine 10 mg/kg de xylazine.
  2. Récoltez le tissu du lit de la plaie en enlevant d’abord doucement le pansement avec une pince stérile, puis coupez autour du périmètre du lit de la plaie avec des ciseaux chirurgicaux stériles. Soulevez doucement une extrémité du lit de plaie avec une pince tout en utilisant des ciseaux pour couper / taquiner l’échantillon loin de la couche musculaire.
  3. Placer le tissu du lit de la plaie dans un tube d’homogénéisation de 2 mL pré-marqué et pré-pesé contenant 1 mL de PBS. Peser à nouveau les tubes après avoir inséré les échantillons, puis inverser doucement 3 à 5 fois pour rincer toute bactérie dispersée ou faiblement adhérente et éliminer le PBS. Ajouter 1 mL de PBS frais.
  4. Afin de récolter la rate, placez les souris dans une position anatomique en décubitus dorsal et fixez-les en épinglant leurs extrémités à une surface de dissection. Faire tremper la zone à disséquer avec de l’éthanol à 70% afin de désinfecter la zone et d’empêcher la fourrure de contaminer l’échantillon.
  5. Faites soigneusement une petite incision perpendiculaire à la ligne médiane avec des ciseaux chirurgicaux dans le derme du bas-ventre, en vous assurant de tirer la peau vers le haut et loin des organes internes. Continuer l’incision intérieurement, le long de la ligne médiane, jusqu’à ce que le sternum soit atteint. Une fois que la cavité péritonéale a été exposée et que les organes internes étaient visibles, séparez doucement la rate du tissu conjonctif et placez-la dans un tube d’homogénéisation séparé.
  6. Peser la rate et rincer avec du PBS, comme décrit pour le tissu du lit de la plaie.
    REMARQUE: D’autres organes d’intérêt peuvent être récoltés de la même manière.
    1. Lors de l’incision initiale, veillez à éviter de perforer les intestins ou d’autres organes.
  7. Homogénéiser les échantillons dans des tubes de laminoir à billes préremplis de 2 mL à l’aide d’un homogénéisateur de paillasse à 5 m/s pendant 60 s, deux fois.
  8. Pour dénombrer l’UFC, diluer en série les échantillons et la plaque ponctuelle sur une gélose sélective. Pour la dilution en série, pipeter 100 μL de l’échantillon dans 900 μL de PBS dans un tube de 1,5 mL, un vortex et répéter 5 fois. Pipetter 10 μL de chaque dilution sur une plaque de gélose comme le montre la figure 3.
    NOTA : Si une quantification plus précise de l’UFC est nécessaire, étaler 100 μL de chaque dilution de l’échantillon sur des plaques de gélose distinctes.

8. Évaluation ex vivo de la dispersion ( Figure4)

  1. Enroulé les souris et infecter avec environ 104 PAO1 comme décrit ci-dessus, puis euthanasier 48 h après l’infection.
  2. Retirez soigneusement le pansement avec une pince, en utilisant une technique stérile et sans perturber le lit de la plaie.
  3. Utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles pour couper le périmètre du lit de la plaie loin de la peau non infectée en utilisant une pince pour soulever une extrémité du lit de la plaie et des ciseaux pour exciser le tissu de la plaie infectée de la couche musculaire en dessous et des tissus non infectés environnants. Diviser les échantillons de lit de plaie en parties égales ou utiliser entier.
  4. Placer le tissu de la plaie dans des tubes homogénéisants vides et pré-pesés de 2 mL de la fabrique de perles. Pesez ensuite à nouveau les tubes après avoir ajouté l’échantillon. Calculer le poids de l’échantillon en :
    poids après l’ajout de l’échantillon - poids avant l’ajout de l’échantillon.
  5. Ajouter 1 mL de PBS et inverser doucement le tube 3 à 5 fois pour rincer l’échantillon et éliminer toutes les cellules planctoniques. Retirez et jetez le PBS.
  6. Ajouter 1 mL de traitement GH (ou PBS comme témoin négatif) à l’échantillon et incuber pendant 2 h à 37 °C en secouant à 80 tr/min.
  7. Retirer la solution de dispersion du biofilm et la placer dans un tube séparé de 1,5 mL. Celui-ci contient les cellules dispersées.
  8. Ajouter 1 mL de PBS à l’échantillon de tissu restant et inverser doucement 3 à 5 fois pour rincer les cellules dispersées restantes. Retirez et jetez le PBS.
  9. Ajouter 1 mL de PBS au tissu restant et homogénéiser à 5 m/s pendant 60 s à l’aide d’un homogénéisateur de paillasse.
  10. Diluer en série la solution de cellules dispersées et l’échantillon de tissu homogénéisé en plaçant 100 μL d’échantillon dans 900 μL de PBS dans un tube de 1,5 mL et en répétant cinq fois pour un total de 6 dilutions.
  11. Plaque ponctuelle de 10 μL de chaque dilution sur une gélose sélective en milieu (p. ex. gélose d’isolement Pseudomonas pour P. aeruginosa)et incuber les plaques à 37 °C pendant la nuit.
  12. Comptez l’UFC et calculez le « pourcentage dispersé » comme suit : (UFC dans le surnageant/ (UFC dans le surnageant+ UFC dans le tissu du biofilm)) x 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dans cette expérience, des souris femelles de Webster suisses âgées de 8 à 10 semaines ont été infectées par 10à 4 UFC de PAO1 portant le plasmide de luminescence pQF50-lux. Comme décrit ci-dessus, on a permis à une infection d’établir pendant 48 h avant d’administrer 3 x 30 traitements de minute de PBS (contrôle du véhicule) ou de GH à 10 % (traitement) pour digérer l’EPS du biofilm. Des souris ont été idés prétraitement, directement après traitement (0 h) et à 10 h et 20 h après le traitement. La figure 2A et la figure supplémentaire 1 montrent une infection établie dans le lit de la plaie générant un signal bioluminescent lumineux. La dispersion des bactéries hors du lit de blessure peut être visualisée immédiatement après le traitement de GH (0 h), mais pas après le traitement de PBS. Il convient de noter que dans des études précédentes, nous avons détecté des bactéries dans le sang et la rate dès 5 h après le traitement GH7. La dissémination bactérienne dans les organes peut également être vue en plaçant la souris sur le côté pour l’imagerie, comme le montre le panneau inférieur de la figure 2A.

Des images de souris traitées au PBS et au GH ont démontré une augmentation du signal luminescent à 20 h après le traitement par rapport au prétraitement(figure 2B). Nous émettons l’hypothèse que cela est dû à la perturbation mécanique du biofilm causée par l’irrigation de la solution. À 20 h poteau-traitement, les souris ont été euthanasiées, et les lits de blessure et la rate ont été rassemblés pour énumérer CFU/gramme de tissu. Alors que les charges bactériennes dans les lits de plaies étaient similaires(figure 2C), desbactéries n’ont été détectées que dans la rate de souris traitées au GH(figure 2D),ce qui suggère une propagation disséminée des bactéries dispersées.

Précédemment, nous avons montré que le traitement GH peut briser les agrégats de bactéries, améliorant le nombre de CFU21. Cela peut expliquer la légère augmentation de la charge bactérienne dans les lits de plaies des souris traitées par GH. Enfin, bien que les lits de plaies traités par GH aient eu une UFC/gramme légèrement plus élevé, il y avait un changement bioluminescent de pourcentage plus faible. Ces résultats suggèrent l’importance de confirmer la luminescence avec des comptes de CFU. Ces résultats représentatifs donnent un exemple de données qui peuvent être collectées en utilisant les protocoles décrits ci-dessus.

Figure 1
Figure 1. Établir des infections des plaies associées au biofilm et évaluer l’efficacité de l’agent de dispersion in vivo. Les pansements ont été vérifiés pour des larmes ou une perte d’adhérence à la peau de la souris avant le traitement. Les pansements compromis ont été remplacés. Des souris ont été placées sous anesthésie juste avant l’administration de traitement. 200 μL de solution enzymatique, ou un témoin de véhicule, ont été injectés dans l’espace entre le lit de la plaie et le pansement. Le pansement a été doucement soulevé utilisant la pince pour s’assurer que la blessure entière était saturée en solution. Le traitement a été laissé sur le lit de blessure pendant la minute 30. Après 30 min, le traitement a été aspiré avec une seringue, et un autre 200 μL de traitement a été ajouté. Ceci a été répété pour un total de 3 traitements. Pour mesurer la dispersion en temps réel, des souris ont été iimages utilisant IVIS avant le traitement, immédiatement après le traitement (0 h), 10 h, et 20 h après le traitement. À 20 h poteau-traitement, les souris ont été euthanasiées, et les lits de blessure et la rate ont été rassemblés. Les échantillons ont été rincés dans du PBS puis homogénéisés dans du PBS frais deux fois à 5 m/s pendant 60 s. Les échantillons ont ensuite été dilués en série et plaqués spot. L’UFC a été dénombrée et l’UFC/gramme a été calculée. Le niveau de dispersion des bactéries de la plaie peut être évalué par IVIS ou en déterminant le nombre d’UFC qui se propagent systémiquement à la rate. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Des données représentatives montrent comment évaluer la dispersion in vivo. Des blessures infectées avec 104 PAO1 (pQF50-lux) pendant 48 h ont été traitées avec PBS, ou 10% GH (solution enzymatique de dispersion de biofilm). Le traitement de PBS a été employé comme commande de véhicule. Les lits de blessure ont été traités avec des traitements de minute de 3 x 30. Des souris ont été idés utilisant IVIS avant le traitement, immédiatement après le traitement, 10 h après le traitement, et 20 h après le traitement. Il convient de noter que les images de vue latérale proviennent de souris pbs et gh-traitées différentes de celles montrées dans les images de vue aérienne (A). Les ROIs pour chaque lit de blessure de prétraitement et chaque lit de blessure de poteau-traitement de 20 h ont été enregistrés. Le pourcentage de variation par rapport au prétraitement a été calculé comme suit : (RCI avant le traitement-RCI après le traitement/RCI prétraitement) x 100 (B). À 20 h de post-traitement, des souris ont été euthanasiées. Les lits de plaies et les rates ont été recueillis et pesés pour déterminer l’UFC/gramme (C et D, respectivement). N=3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Dilution en série et placage ponctuel. L’échantillon homogénéisé a été vortexé et 100 μL ont été transférés dans un tube Eppendorf de 1,5 mL contenant 900 μL de PBS. L’échantillon a été vortexé et 100 μL ont été transférés dans un autre tube Eppendorf de 1,5 mL avec 900 μL de PBS. Ce processus a été répété 5 fois. À partir du dernier tube de dilution, 10 μL d’échantillon ont été plaqués ponctuellement sur la plaque de gélose à la tache10-8. Ceci a été poursuivi jusqu’à la dilution10-3. Typiquement, la dilution 10-3 se traduit par une pelouse de bactéries dans la tache. Certains organes, qui ont de faibles charges bactériennes, peuvent nécessiter un placage ponctuel jusqu’à la dilution 10-1. Répétez l’opération pour chaque échantillon de tissu. Placer la plaque de gélose dans un incubateur à 37 °C pendant 24-48 h, ou cultiver dans des conditions optimales pour les espèces bactériennes d’intérêt. Pour dénombrer l’UFC, compter les colonies individuelles à la dilution la plus faible possible et multiplier par le facteur de dilution approprié pour déterminer l’UFC/mL ou utiliser le poids des tissus pour calculer l’UFC/g de tissu. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Mesure de la dispersion à partir de tissus infectés ex vivo. Des souris ont été euthanasiées et le tissu infecté de blessure a été aseptiquement enlevé. Le tissu infecté a été placé dans un tube homogénéisant de moulin à perles de 2 ml et rincé brièvement avec du PBS. 1 mL d’agent dispersant a été ajouté et l’échantillon a été inubpé pendant 2 h à 37 °C avec des secousses à 80 tr/min. Après incubation, la solution contenant les cellules dispersées a été retirée et placée dans un tube séparé de 1,5 mL. Le tissu restant a été rincé avec 1 ml de PBS. 1 mL de PBS frais a été ajouté au tissu et homogénéisé à 5 m/s pendant 60 s. La solution enzymatique et le tissu homogénéisé ont été alors périodiquement dilués et tacheté sur la gélose sélective. L’UFC a été dénombrée et la dispersion a été calculée comme suit : UFC provenant d’une solution enzymatique/ (UFC provenant d’une solution enzymatique + UFC provenant de tissus) x 100. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure supplémentaire 1. Mesure de la dispersion in vivo. Des blessures ont été infectées avec10 4 PAO1 (pQF50-lux) pendant 48 h et puis traitées avec PBS, ou 10% GH (solution enzymatique de dispersion de biofilm). Le traitement de PBS a été employé comme commande de véhicule. Les lits de blessure ont été traités avec 3 x 30 traitements d’irrigation de minute. Des souris ont été idés utilisant IVIS avant le traitement, immédiatement après le traitement, 10 h après le traitement, et 20 h après le traitement (A). À 20 h de post-traitement, des souris ont été euthanasiées. Les lits de plaies et les rates ont été recueillis et pesés pour déterminer l’UFC/gramme (B et C, respectivement). N=3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nous décrivons ici les protocoles qui peuvent être utilisés pour étudier l’efficacité des agents de dispersion du biofilm. Ces protocoles peuvent être facilement adaptés pour être utilisés avec différents types d’agents de dispersion, d’espèces bactériennes ou d’échantillons ex vivo, y compris des échantillons de débridement clinique. Ce protocole fournit également un modèle cliniquement pertinent pour collecter et étudier les cellules bactériennes dispersées. Il a été démontré que les phénotypes des cellules bactériennes dispersées sont distincts de ceux des cellules planctoniques ou biofilm 5,24,25,26; cependant, les phénotypes des bactéries dispersées in vivo n’ont pas encore étédécrits. Si les agents de dispersion doivent être utilisés thérapeutiquement, il est important de déterminer leur efficacité, ainsi que de comprendre le phénotype que ces cellules adoptent. En outre, ce protocole pourrait être utilisé pour étudier comment les variations de la structure EPS ou l’altération des voies de signalisation affectent la dispersion. Par exemple, la dispersion des souches de P. aeruginosa présentant des mutations dans différents composants exopolysaccharides (p. ex. Pel, Psl, Alginate) pourrait être comparée à celle des souches de type sauvage.

Dans l’ensemble, ce protocole peut être divisé en quatre sections principales : (1) l’établissement d’une infection (2) l’administration d’un traitement ou (3) la collecte de tissus infectés pour un traitement ex vivo et (4) la détermination de l’efficacité de la dispersion. La partie critique de la section 1 est l’établissement réussi de l’infection dans le lit de la plaie. Si des souches luminescentes, qui nécessitent des antibiotiques pour maintenir la stabilité du plasmide, sont utilisées, il est impératif d’ajouter les antibiotiques appropriés lors de la culture des souches en préparation de l’infection. Il faut également considérer que les plasmides peuvent ne pas être maintenus pendant l’infection chez l’animal (sans pression antibiotique), donc l’évaluation de la charge bactérienne ne devrait pas reposer entièrement sur l’imagerie IVIS, mais être confirmée par CFU. La dose inoculante est également une étape critique pour initier l’infection. Pour P. aeruginosa et S. aureus, une dose infectieuse de 104-5 UFC est généralement utilisée, mais la dose optimale peut différer selon les espèces bactériennes et de souris utilisées.

La partie critique de la section 2 est de s’assurer que le lit de la plaie est couvert par le pansement tout au long du développement de l’infection et du traitement. Si le pansement n’est pas respecté correctement, le traitement peut fuir du lit de la plaie et peut être inefficace. Le pansement est également important pour garder le lit de plaie protégé contre les contaminants potentiels, et pour altérer la cicatrisation contractile par la souris, ce qui est essentiel pour imiter la cicatrisation des plaies humaines. Enfin, la partie essentielle de la section 3 est de traiter correctement les échantillons prélevés. Pour dénombrer l’UFC, le tissu infecté doit être rincé avec 1 mL de PBS avant l’ajout d’un autre 1 mL de PBS pour homogénéisation. Des organes plus fibreux, tels que les poumons, peuvent nécessiter une homogénéisation plus approfondie.

Les principales limites de ces protocoles comprennent la surveillance étroite requise du pansement et l’utilisation d’IVIS pour imager la dispersion et faire des hypothèses sur l’efficacité de la dispersion. Pour les études à long terme, la re-croissance de la fourrure peut être problématique parce qu’elle peut empêcher l’adhérence du pansement au site de la plaie. Les pansements doivent souvent être remplacés et leur retrait peut entraîner un débridement accidentel de la plaie et une possibilité de contamination. Pour visualiser la dispersion du lit de la plaie, une souche bactérienne bioluminescente doit être utilisée. Si l’espèce bactérienne d’intérêt n’a pas de rapporteur bioluminescent, cette option n’est pas réalisable. Une autre limitation est le potentiel du traitement de dispersion pour induire une bactériémie, ce qui peut entraîner la mort de la souris. Cependant, nous avons vu que les cellules dispersées peuvent être efficacement tuées par des antibiotiques in vivo7.

Les résultats représentatifs illustrés à la figure 2 illustrent une limite de l’IVIS pour mesurer l’efficacité de la dispersion. Tout d’abord, une souche luminescente de l’espèce bactérienne d’intérêt doit être utilisée. La souche doit produire un signal luminescent suffisamment brillant pour être détecté à travers plusieurs couches de tissu afin de visualiser la dispersion du lit de la plaie vers d’autres parties du corps. Il a été suggéré qu’un minimum d’environ 106 bactéries sont nécessaires pour produire un signal luminescent assez fort pour détecter par IVIS27. Une diminution du signal luminescent a également été décrite lorsque les bactéries entrent en phase stationnaire28. Cela peut entraîner une déconnexion entre les ROIs mesurés et CFU énumérés29. Cette limitation peut conduire à de fausses hypothèses lorsqu’il n’y a pas de signal suffisamment fort pour être détecté, mais que des bactéries sont toujours présentes. Comme le montre la figure 2B,les traitements PBS et GH à 10 % ont entraîné une augmentation de la luminescence après le traitement. Il s’agit d’une observation curieuse et cohérente, qui a également été observée après la dispersion de cellules in vitro (CláudiaMarques, Université de Binghamton, communication personnelle). Il est possible que la perturbation physique du biofilm résultant de l’administration du traitement se propage simplement sur des cellules qui étaient étroitement emballées, ce qui entraîne une augmentation du signal lumineux. Alternativement, le traitement de dispersion pourrait « réveiller » des cellules de biofilm qui étaient auparavant métaboliquement inactives, entraînant une bioluminescence accrue. Quoi qu’il en soit, il est crucial de confirmer les résultats de l’imagerie IVIS avec les données CFU. Enfin, il existe une distribution hétérogène des bactéries dans les tissus de plaies infectées30,31. Par conséquent, si le tissu est divisé ex vivo pour fournir plus d’échantillons, il ne faut pas supposer que la charge bactérienne dans chaque section de la plaie est identique.

Il existe des modifications et des dépannages qui peuvent être effectués pour surmonter les limitations de ces modèles. Tout d’abord, le temps alloué à l’exposition de la crème dépilatoire peut devoir être ajusté en fonction de l’espèce de souris utilisée. Par exemple, 7 min est généralement utilisé pour les souris Webster suisses, tandis que les souris C57BL/6 peuvent avoir besoin de jusqu’à 10 minutes d’exposition pour éliminer avec succès la fourrure. Bien sûr, cela dépend également du produit utilisé, et les temps d’exposition ne doivent jamais dépasser les instructions du fabricant. Si une longue étude (4 jours et plus) est menée, il peut être nécessaire de réappliquer la crème dépilatoire pour éliminer la fourrure régénérée et assurer un joint approprié du pansement. Ensuite, si un signal luminescent est difficile à détecter, le temps d’exposition peut être augmenté pendant l’imagerie IVIS. La dose d’inoculation et le temps d’infection peuvent également être ajustés. Il est important d’utiliser une dose infectieuse qui n’est pas trop élevée qu’elle submerge la souris, mais qui n’est pas non plus trop faible pour que les bactéries soient immédiatement effacées par la réponse immunitaire.

Dans ce protocole, nous décrivons traiter 48 infections h-vieilles de blessure avec des agents de dispersion, car c’est un point de temps nous avons montré des infections provoquées par P. aeruginosa et/ou S. aureus sont établies et biofilm-associées 12,15,16. Cependant, selon les espèces bactériennes, d’autres points temporels peuvent être plus optimaux. Idéalement, la charge bactérienne dans la plaie devrait plafonner une fois qu’une infection est établie. Par exemple, nous avons vu qu’avec P. aeruginosa et S. aureus, la charge bactérienne dans la plaie atteint approximativement 108 UFC/g de tissu par 48 h après l’infection et reste à ce niveau jusqu’à la fermeture de la plaie. La figure 1 illustre le traitement avec une solution nécessitant 3 x 30 lavages min. Cependant, si l’agent de dispersion était sous une autre forme, les lavages ne seraient pas nécessaires. Par exemple, une crème, un gel ou un pansement conçu pourrait simplement être placé sur le dessus du lit de la plaie. Enfin, la plaie peut être infectée de diverses manières, notamment par inoculation de cellules bactériennes planctoniques, de biofilms préformés12,ou même de tissus de débridement infectés provenant d’un autre animal ou humain19,32. Nous avons vu que la transplantation d’un biofilm préformé ou d’un échantillon de débridement sur le lit de la plaie entraîne des infections polybiennes plus réussies que lorsque plusieurs espèces sont inoculées sous leur forme planctonique12.

Dans l’ensemble, ces protocoles décrivent les méthodes d’étude de la dispersion du biofilm et l’évaluation des agents thérapeutiques de dispersion du biofilm. Ces modèles permettent le développement d’infections complexes associées au biofilm polybien qui imitent des infections humaines cliniquement pertinentes. Nous espérons que ces protocoles seront utilisés et affinés pour poursuivre le développement d’agents de dispersion anti-biofilm à usage thérapeutique.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), de la Ted Nash Long Life Foundation, de la Jasper L. and Jack Denton Wilson Foundation et du Département de la Défense (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher 14823434 Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle Fisher 14823434 Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt Fisher BP1760-5 Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase MP Biomedicals 2100447 Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) ZooPharm RX216118 Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase MP Biomedicals 2150583 Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream Walmart 287746 Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips Fisher 12-460-536 Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL Fisher 101406 Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer MP Biomedicals 6VFV9 Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 0298-9373-68 Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) Fisher 15340151 Used to homogenize samples for plating
Isoflurane Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN Sigma Aldrich K4138 Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller Fisher BP1426-2 Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable Diamond Back Drugs 2468 Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem Sigma Aldrich PHR1772-500MG Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges Fisher 13-761-52 Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain Ref [13] N/A PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes Fisher PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x Fisher BP3991 Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing Mckesson 66024007 Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar VWR 90004-394 Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M. Walmart Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads Fisher 22-363-750 Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors Fisher 89515 Can also use curved scissors
Swiss Webster mice Charles River 551NCISWWEB Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL Fisher 14823434 Used to administer drugs and enzyme treatment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
  2. Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
  3. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
  4. Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
  5. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).
  6. Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
  7. Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).
  8. Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).
  9. Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).
  10. Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
  11. Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
  12. Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).
  13. Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
  14. Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
  15. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
  16. Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
  17. Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).
  18. Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129 (2015).
  19. Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, Sup10 33-43 (2016).
  20. Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).
  21. Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
  22. DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
  23. Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
  24. Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462 (2014).
  25. Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
  26. Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
  27. Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
  28. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
  29. Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
  30. Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. Heterogeneity in biofilms. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).
  31. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
  32. Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).

Tags

Immunologie et infection Numéro 174 Ex vivo In vivo biofilm dispersion infection des plaies agent anti-biofilm Pseudomonas aeruginosa
Évaluation de la dispersion du biofilm dans les plaies murines
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Redman, W. K., Welch, G. S.,… More

Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds. J. Vis. Exp. (174), e62136, doi:10.3791/62136 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter