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Immunology and Infection

मुरीन घावों में बायोफिल्म फैलाव का आकलन

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62136
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,2,3
1Department of Surgery, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Immunology and Molecular Microbiology, Texas Tech University Health Sciences Center, 3TTUHSC Surgery Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम चूहों में घाव के संक्रमण से बैक्टीरियल फैलाव का आकलन करने के लिए पूर्व वीवो और वीवो विधियों का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग सामयिक रोगाणुरोधी और एंटी-बायोफिल्म उपचारों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने या विभिन्न जीवाणु उपभेदों या प्रजातियों की फैलाव क्षमता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

बायोफिल्म से संबंधित संक्रमण पुरानी स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला में फंसाया जाता है जैसे गैर-उपचार मधुमेह पैर अल्सर, पुरानी साइनसाइटिस, ओटिटिस मीडिया को फिर से शुरू करना, और कई और अधिक। इन संक्रमणों के भीतर माइक्रोबियल कोशिकाओं को एक बाहकालीन बहुलक पदार्थ (ईपीएस) द्वारा संरक्षित किया जाता है, जो एंटीबायोटिक दवाओं को रोक सकता है और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को संक्रमण को साफ करने से रोक सकता है। इस बाधा को दूर करने के लिए, जांचकर्ताओं ने संभावित चिकित्सा विज्ञान के रूप में फैलाव एजेंटों का विकास शुरू कर दिया है । ये एजेंट बायोफिल्म ईपीएस के भीतर विभिन्न घटकों को लक्षित करते हैं, संरचना को कमजोर करते हैं, और बैक्टीरिया के फैलाव की शुरुआत करते हैं, जो सैद्धांतिक रूप से एंटीबायोटिक शक्ति और प्रतिरक्षा निकासी में सुधार कर सकते हैं। घाव संक्रमण के लिए फैलाव एजेंटों की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए, हमने प्रोटोकॉल विकसित किए हैं जो बायोफिल्म फैलाव को पूर्व वीवो और वीवोदोनों में मापते हैं। हम एक माउस सर्जिकल एक्सिसेशन मॉडल का उपयोग करते हैं जिसे बायोफिल्म से जुड़े पुराने घाव संक्रमण बनाने के लिए अच्छी तरह से वर्णित किया गया है। वीवो मेंफैलाव की निगरानी के लिए, हम घावों को बैक्टीरियल उपभेदों से संक्रमित करते हैं जो लूसिफ़ेरेस व्यक्त करते हैं। एक बार परिपक्व संक्रमण स्थापित हो जाने के बाद, हम एंजाइमों वाले समाधान के साथ घावों की सिंचाई करते हैं जो बायोफिल्म ईपीएस के घटकों को नीचा दिखाते हैं। फिर हम प्राप्त फैलाव के स्तर के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए घाव और छानने वाले अंगों में ल्यूमिनेसेंट सिग्नल के स्थान और तीव्रता की निगरानी करते हैं। बायोफिल्म फैलाव के पूर्व वीवो विश्लेषण के लिए, संक्रमित घाव ऊतक बायोफिल्म-अपमानजनक एंजाइम समाधान में डूबे हुए हैं, जिसके बाद ऊतक में शेष बैक्टीरियल लोड, बनाम समाधान में बैक्टीरियल लोड का आकलन किया जाता है। दोनों प्रोटोकॉल में ताकत और कमजोरियां हैं और फैलाव उपचार की प्रभावकारिता को सही ढंग से निर्धारित करने में मदद करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

दुनिया भर में एंटीबायोटिक प्रतिरोध के बढ़ने से विभिन्न प्रकार के जीवाणु संक्रमणों के इलाज के लिए एंटीबायोटिक विकल्पों की कमी हो रही है1. एंटीबायोटिक प्रतिरोध के अलावा, बैक्टीरिया बायोफिल्म से जुड़ी जीवनशैली2को अपनाकर एंटीबायोटिक सहिष्णुता हासिल कर सकते हैं । एक बायोफिल्म सूक्ष्मजीवों का एक समुदाय है जो पॉलीसैकराइड्स, एक्सपेरिअल डीएनए, लिपिड और प्रोटीन 3 के मैट्रिक्स द्वारा संरक्षित होता है, जिसे सामूहिक रूप से बाह्राश पॉलीमेरिक पदार्थ (ईपीएस) कहाजाताहै। एंटीबायोटिक प्रतिरोध संकट के रूप में जारी है, नई रणनीतियों है कि के उपयोग को लम्बा, या की प्रभावकारिता शक्तिशाली, एंटीबायोटिक दवाओं कष्टदाई रूप से की जरूरत है । एंटी-बायोफिल्म एजेंट एक आशाजनक समाधान4हैं।

प्रस्तावित विभिन्न एंटी-बायोफिल्म रणनीतियों में, फैलाव एजेंटों का उपयोग, जो बायोफिल्म ईपीएस के विभिन्न घटकों को लक्षित करते हैं, चिकित्सीय विकास5में सबसे आगे हैं। ग्लाइकोसाइड हाइड्रोलीज (जीएच) फैलाव एजेंट का एक ऐसा वर्ग है। GH एंजाइमों का एक बड़ा वर्ग है जो पॉलीसैकराइड्स के भीतर विभिन्न बांडों के दरार को उत्प्रेरित करता है जो ईपीएस को संरचनात्मक अखंडता प्रदान करते हैं। हमारे समूह के साथ-साथ अन्य लोगों ने दिखाया है कि जीएच बायोफिल्म्स को प्रभावी ढंग से नीचा दिखा सकता है, विट्रो और वीवो6,7,8,9,11दोनों में विभिन्न जीवाणु प्रजातियों के लिए फैलाव को प्रेरित कर सकता है और एंटीबायोटिक प्रभावकारिता में सुधार करसकताहै।

बायोफिल्म फैलाव में बढ़ती रुचि के साथ, प्रभावी तरीकों को विकसित करना महत्वपूर्ण है जो फैलाव प्रभावकारिता का आकलन करते हैं। यहां, हम चूहों में एक फैलाव एजेंट के साथ बायोफिल्म से जुड़े घाव संक्रमणों के उपचार के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, और वीवो और पूर्व वीवोमें फैलाव प्रभावकारिता का आकलन करते हैं। समग्र लक्ष्य प्रभावी तरीकों को प्रदान करना है जिसका उपयोग बायोफिल्म फैलाव को प्रभावी ढंग से और कुशलता से मापने के लिए प्रीक्लिनिकल मॉडल के साथ किया जा सकता है।

इन अध्ययनों में बायोफिल्म से जुड़े संक्रमण को स्थापित करने के लिए एक मुरीन सर्जिकल एक्सीशन इंफेक्शन मॉडल का इस्तेमाल किया गया था। हमने 15 वर्षों से अधिक समय तक इस मॉडल का उपयोग किया है और अपनी टिप्पणियों को 7 ,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21में प्रकाशित किया है । सामान्य तौर पर, यह एक गैर-घातक संक्रमण मॉडल है जहां बैक्टीरिया घाव बिस्तर पर स्थानीयकृत रहते हैं और बायोफिल्म से जुड़े होते हैं (ईपीएस से घिरे समुच्चय में देखे जाने वाले बैक्टीरिया), एक पुराने संक्रमण की स्थापना करते हैं जो 3 सप्ताह तक रहता है। हालांकि, अगर चूहों को इम्यूनोसमझौता किया जाता है (उदाहरण के लिए टाइप 1 मधुमेह के साथ), तो वे इस मॉडल में घातक प्रणालीगत संक्रमण विकसित करने के लिए अधिक संवेदनशील हो सकते हैं।

इस रिपोर्ट में, हम वीवो और पूर्व वीवोदोनों में घाव से बैक्टीरिया के फैलाव का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। दोनों प्रोटोकॉल का उपयोग एक फैलाव एजेंट की प्रभावकारिता की जांच करने के लिए किया जा सकता है और इसकी अपनी ताकत और कमजोरियां हैं। उदाहरण के लिए, वीवो में फैलाव का आकलन करने से फैलाव के बाद शरीर के अन्य हिस्सों में बैक्टीरिया के प्रसार के बारे में महत्वपूर्ण, वास्तविक समय की जानकारी प्रदान की जा सकती है, और मेजबान कैसे प्रतिक्रिया करता है। दूसरी ओर, फैलाव पूर्व वीवो का आकलन कई एजेंटों, खुराक, या योगों की स्क्रीनिंग के लिए अधिक वांछनीय हो सकता है, क्योंकि ऊतक को कई वर्गों में विभाजित किया जा सकता है जिन्हें अलग से परीक्षण किया जा सकता है, इस प्रकार आवश्यक चूहों की संख्या को कम किया जा सकता है। कई एजेंटों का आकलन करते समय, हम आम तौर पर विट्रो में पहले फैलाव को मापते हैं जैसा कि पहले 6,9,22वर्णित था। फिर हम बहुत आशाजनक एजेंटों की सीमित संख्या के लिए वीवो परीक्षण में सबसे प्रभावी पूर्व वीवो और रिजर्व का परीक्षण करते हैं।

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Protocol

इस पशु प्रोटोकॉल की समीक्षा की और टेक्सास टेक विश्वविद्यालय स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र (प्रोटोकॉल संख्या ०७०४४) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था । यह अध्ययन स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों की देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के सख्त अनुसार किया गया था ।

1. माउस संक्रमण के लिए बैक्टीरिया तैयार करना

नोट: यहां हम चूहों को संक्रमित करने का वर्णन केवल स्यूडोमोनास एरुगिनोसा केसाथ करते हैं । हालांकि, अन्य जीवाणु प्रजातियों का उपयोग संक्रमण पैदा करने के लिए किया जा सकता है। जीवाणु उपभेदों और सामग्रियों को सामग्री की तालिका में विस्तृत किया जाता है।

  1. इन प्रयोगों के लिए ल्यूमिनेसेंस प्लाज्मिड पीक्यूएफ 50-लक्स23 को ले जाने वाले स्यूडोमोनास एरुगिनोसा जंगली प्रकार के तनाव PAO1 का उपयोग करें जैसा कि पहले7वर्णित है।
  2. 16 से 20 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर लुरिया-बर्टानी (एलबी) शोरबा में, 200 आरपीएम पर मिलाते हुए, चकित एर्लेनमेयर फ्लास्क में पी एरुगिनोसा उपभेदों को बढ़ाएं। प्लाज्मिड के रखरखाव के लिए PAO1 (pQF50-लक्स) की रातोंरात संस्कृति के लिए एम्पीसिलिन के 100 μg/mL की अंतिम एकाग्रता जोड़ें।
  3. उपसंस्कृति पी aeruginosa एक Erlenmeyer फ्लास्क 100 μg/mL ampicillin की अंतिम एकाग्रता के साथ एलबी शोरबा के 10 मिलीएल युक्त करने के लिए रातोंरात संस्कृति के 100 μL जोड़कर। फिर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-2.5 घंटे के लिए बढ़ते हैं,0.4 के एक ओडी 600 एनएम के लिए, और फिर लगभग 10 4 कोशिकाओं की एक संक्रमित खुराक के लिए तीन बार क्रमिक रूप से पतला(1:10) ।

2. बायोफिल्म फैलाव एंजाइम की तैयारी

नोट: इस अध्ययन के लिए हम समान भागों एमीलेस और सेल्यूलेस (प्रत्येक का 5%) के 10% समाधान का उपयोग करते हैं, जिसे फैलाव उपचार के लिए "GH" के रूप में संदर्भित किया जाएगा।

  1. 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में पतला एमिलेज (बेसिलस सबटिलिससे) और फंगल सेलुलास (एस्परगिलस नाइजरसे) के 10% जीएच समाधान (w/v) का उपयोग करें। वाहन नियंत्रण उपचार के रूप में पीबीएस का उपयोग करें।
  2. एंजाइम सक्रियण के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक सभी उपचार गर्म करें।

3. प्रायोगिक जानवरों और प्रीऑपरेटिव सेटअप

  1. घर चूहों, पिंजरे प्रति 5 कूड़े साथियों, पर्यावरण नियंत्रित परिस्थितियों में, 12 घंटे प्रकाश/अंधेरे चक्र और भोजन और पानी के लिए उचित उपयोग के साथ ।
  2. अधिमानतः, 8 से 10 सप्ताह पुराने के बीच महिला स्विस वेबस्टर चूहों का उपयोग करें।
  3. प्रशासन के लिए संज्ञाहरण की उचित मात्रा निर्धारित करने के लिए चूहों का वजन करें।
  4. 100 मिलीग्राम/किलो केटामाइन 10 मिलीग्राम/किलो जाइलाज़ीन के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा संज्ञाहरण का प्रशासन करें।
  5. सूखापन को कम करने के लिए कपास झाड़ू का उपयोग करके आंखों पर ध्यान से आई क्रीम (जैसे, ताज़ा पी.M) लागू करें।
  6. सर्जरी के दौरान श्वसन दर, त्वचा रंगाई, और शरीर के तापमान सहित शारीरिक मापदंडों की निगरानी करें।

4. पृष्ठीय पूर्ण मोटाई उत्तेजना सर्जरी

  1. अंगुली चुटकी और श्वसन दर और प्रयास की निगरानी से संज्ञाहरण के सर्जिकल विमान का आकलन करें। पृष्ठीय सतह को शेव करें और 10 मिनट (या उत्पाद के निर्देशों के अनुसार) के लिए एक डिपिलेटरी क्रीम लागू करें, जिसके बाद धीरे-धीरे हटा दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि त्वचा सूखी थी।
  2. दर्द प्रबंधन के लिए, क्षेत्र में 0.05 एमएल लिडोकेन को कम से कम प्रशासित करें, और 0.02 एमएल बुप्रेनोरफिन को गर्दन के स्क्रफ में संक्षेप में इंजेक्ट करें। दर्द प्रबंधन सुनिश्चित करने के लिए 10 मिनट इंतजार करना पड़ा ।
  3. उत्तेजन से पहले, एक शराब झाड़ू का उपयोग करके पृष्ठीय सतह को कीटाणुरहित करें और पीठ के पीछे के हिस्से की ओर 1.5-सेमी व्यास सर्कल बनाएं। प्रक्रिया के दौरान एक बाँझ शल्य क्षेत्र बनाए रखें और ऑटोक्लेव उपकरणों और बाँझ दस्ताने का इस्तेमाल किया। संदूषण को सीमित करने के लिए, एक जलाया Bunsen बर्नर द्वारा सर्जरी का संचालन और प्रत्येक जानवर के लिए स्वच्छ उपकरण का उपयोग करें ।
  4. सर्जिकल कैंची के साथ पैनिकुलस मांसपेशी के स्तर तक एक पूर्ण मोटाई, उत्तेजनीय त्वचा घाव प्रशासन।
  5. एक्सिशन के बाद, तुरंत घावों को अर्धपरिजेय पॉलीयूरेथेन ड्रेसिंग के साथ कवर करें।
  6. संक्रमण स्थापित करने के लिए, घाव बिस्तर पर, ड्रेसिंग के नीचे 100 माइक्रोन पीबीएस में बैक्टीरिया के लगभग 104 सीएलयू इंजेक्ट करें।
    नोट: घाव भी बैक्टीरिया और/या कवक की कई प्रजातियों के साथ एक साथ संक्रमित किया जा सकता है, या पूर्व गठित बायोफिल्म्स12,या यहां तक कि19रोगियों से निकाले गए debridement ऊतक, घाव बिस्तर पर रखकर ।
  7. संक्रमण के बाद, हीटिंग पैड के साथ पिंजरे में चूहों जगह है और निगरानी जब तक वे अपने दक्षिणपंथी पलटा वापस आ गया ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि चूहों को ठंडा न हो क्योंकि इससे मौत हो सकती है।
  8. 48 घंटे के लिए घाव संक्रमण स्थापित करें।
  9. आँसू और पालन न करने के क्षेत्रों के लिए दैनिक चिपकने वाले ड्रेसिंग का निरीक्षण करें और यदि आवश्यक हो तो प्रतिस्थापित करें।

5. वीवो फैलाव उपचार में

नोट: यहां हम 3 सामयिक घाव सिंचाई समाधान(चित्रा 1)की एक श्रृंखला लागू करके फैलाव एजेंटों के प्रशासन का वर्णन करते हैं । हालांकि, प्रोटोकॉल को अन्य प्रकार के प्रसव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जैसे जैल, क्रीम या ड्रेसिंग का आवेदन।

  1. उपचार का प्रशासन करते समय आइसोफ्लुन एनेस्थीसिया (ऑक्सीजन के 3% और 1 एल प्रति मिनट पर) के तहत चूहों को रखें।
  2. 25 जी सुइयों के साथ तीन 1 एमएल सीरिंज तैयार करें, जिसमें प्रत्येक माउस के लिए उपचार के 200 माइक्रोन होते हैं।
  3. एंजाइम समाधान या पीबीएस नियंत्रण के 200 μL को ध्यान से उठाने और संदंश के साथ त्वचा को पिंच करके, जानवर के सिर की ओर घाव से थोड़ा ऊपर, घाव पर 200 माइक्रोन इंजेक्ट करें। ध्यान से उठाया त्वचा के माध्यम से सिरिंज छेदने और धीरे-धीरे ड्रेसिंग और घाव बिस्तर के बीच समाधान सुई। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली ड्रेसिंग अक्सर घाव बिस्तर और आसपास के ऊतकों दोनों का पालन करती है।
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि पूरे घाव बिस्तर को समाधान द्वारा कवर किया जाता है, धीरे-धीरे ड्रेसिंग को संदंश के साथ उठाएं, इसे घाव बिस्तर से दूर खींचें, जबकि धीरे-धीरे समाधान का इंजेक्शन दें।
  4. उपचार के बाद, चूहों को 30 मिनट के लिए अपने पिंजरों में वापस रखें।
  5. उपचार के 30 मिनट के संपर्क में आने के बाद, चूहों को आइसोफ्लाणे के साथ फिर से एनेस्थेटाइज करें और समाधान को सिरिंज के साथ एस्पिरेट करें, जिससे पहले की तरह ही क्षेत्र में पंचर होना सुनिश्चित हो सके।
    नोट: इस एस्पिरेटेड समाधान में फैलाया हुआ बैक्टीरियल कोशिकाएं होती हैं, जिन्हें विभिन्न डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए बचाया जा सकता है।
  6. हर बार एक नई सिरिंज का उपयोग करके, पहले के रूप में दूसरे और तीसरे सिंचाई उपचार का प्रशासन करें।

6. वीवो फैलाव इमेजिंग और विश्लेषण में

नोट: यदि संक्रमण शुरू करने के लिए बैक्टीरिया के एक ल्यूमिनेसेंट तनाव का उपयोग किया जाता है, तो घाव बिस्तर से फैलाव की कल्पना करने के लिए एक वीवो इमेजिंग सिस्टम (आईविस) का उपयोग किया जा सकता है।

  1. उपचार से तुरंत पहले और बाद में और 10 और 20 घंटे के बाद उपचार(चित्रा 2 और पूरक चित्रा 1)पर छवि चूहों ।
  2. इमेजिंग करें जबकि चूहों को आईवीआईएस में व्यक्तिगत रूप से रखकर संज्ञाहरण के तहत किया जाता है और 560 एनएम की तरंगदैर्ध्य में 5 एस के लिए हर एक इमेजिंग करते हैं। आगे के विश्लेषण के लिए छवियों को सहेजें।
    नोट: इष्टतम तरंगदैर्ध्य और एक्सपोजर समय इस्तेमाल किए गए रिपोर्टर और आईवीआईएस इंस्ट्रूमेंट और इमेजिंग सॉफ्टवेयर पर निर्भर करेगा।
  3. विश्लेषण के लिए, आईवीआईएस सॉफ्टवेयर में छवियों को खोलें और टूल पैलेट में विश्लेषण किए जाने वाले क्षेत्र का चयन करें।
  4. पृष्ठभूमि के लिए खाते के लिए, एक तस्वीर की पृष्ठभूमि पर एक चक्र रखें और फिर प्रत्येक माउस के लिए घाव बिस्तर के शीर्ष पर एक ही आकार के सर्कल रखें।
  5. माप मान अपलोड करने के लिए, व्यू-> क्षेत्र ऑफ इंटरेस्ट (आरओआई) मापों का चयन करें और माप की तालिका को स्प्रेडशीट पर अपलोड करें। प्रत्येक नमूने के लिए ल्यूमिनेसेंस की गणना करने के लिए प्रत्येक घाव बिस्तर माप से पृष्ठभूमि सर्कल पढ़ने को घटाना। प्रतिशत ल्यूमिनेसेंस की गणना करें:
    आरओआई प्री-ट्रीटमेंट-आरओआई पोस्ट-ट्रीटमेंट/आरओआई प्री-ट्रीटमेंट) x १०० ।
    नोट: नियंत्रण और इलाज चूहों का विश्लेषण एक साथ किया जाना चाहिए ताकि उन चरों के लिए सामान्य किया जा सके जो छवि अधिग्रहण या चमक को प्रभावित कर सकते हैं।

7. CFU का निर्धारण करके फैलाव का आकलन

  1. 100 मिलीग्राम/किलो केटामाइन 10 मिलीग्राम/किलो जाइलाज़ीन के साथ संज्ञाहरण के तहत पेंटोबार्बिटल सोडियम (जैसे, घातक प्लस) के 0.2 मिलील के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहों को मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दें।
  2. फसल घाव बिस्तर ऊतक पहले धीरे बाँझ संदंश के साथ ड्रेसिंग को हटाने, और फिर बाँझ शल्य कैंची के साथ घाव बिस्तर की परिधि के आसपास काट दिया । धीरे से घाव बिस्तर के एक छोर को संदंश के साथ उठाएं, जबकि कैंची का उपयोग करके नमूना को मांसपेशियों की परत से दूर करने/चिढ़ाने के लिए ।
  3. घाव बिस्तर से ऊतक को पूर्व-लेबल और पूर्व-तौला 2 एमएल होमोजेनाइजेशन ट्यूब में रखें जिसमें पीबीएस का 1 एमएल होता है। नमूनों को डालने के बाद फिर से ट्यूबों का वजन करें, और फिर किसी भी बिखरे हुए या शिथिल पालन बैक्टीरिया को कुल्ला करने के लिए धीरे-धीरे 3-5 बार उलटा करें, और पीबीएस को हटा दें। ताजा पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें।
  4. तिल्ली को फसल करने के लिए, चूहों को एक रीढ़ शारीरिक स्थिति में रखें और उनके हाथ-पैरों को विच्छेदन सतह पर रखकर सुरक्षित करें। क्षेत्र को कीटाणुरहित करने और नमूने को दूषित करने से फर रखने के लिए क्षेत्र को 70% इथेनॉल के साथ विच्छेदित करने के लिए भिगो दें।
  5. ध्यान से निचले पेट के डर्मिस में सर्जिकल कैंची के साथ मिडलाइन के लिए एक छोटा चीरा लंबवत बनाते हैं, जिससे त्वचा को आंतरिक अंगों से ऊपर और दूर खींचना सुनिश्चित होता है। चीरा आंतरिक रूप से जारी रखें, मध्य रेखा के साथ, जब तक उरोस्थि तक पहुंच गया था । एक बार पेरिटोनियल गुहा उजागर हो गया था और आंतरिक अंग दिखाई दे रहे थे, धीरे से संयोजी ऊतक से तिल्ली अलग और एक अलग समरूपता ट्यूब में जगह है ।
  6. प्लीहा वजन और PBS के साथ कुल्ला, के रूप में घाव बिस्तर ऊतक के लिए वर्णित है ।
    नोट: ब्याज के अन्य अंगों को इसी तरह काटा जा सकता है।
    1. प्रारंभिक चीरा बनाते समय, आंतों, या अन्य अंगों को पंचर करने से बचने का ध्यान रखें।
  7. 60 एस के लिए 5 मीटर प्रति वर्ष, दो बार बेंचटॉप होमोजेनाइजर का उपयोग करके 2 एमएल प्री-भरे मनका मिल ट्यूबों में नमूनों को समरूप बनाना।
  8. सीआईयू की गणना करने के लिए, चुनिंदा एगर पर नमूनों और स्पॉट-प्लेट को क्रमिक रूप से पतला करें। धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए, 1.5 एमएल ट्यूब, भंवर में पीबीएस के 900 माइक्रोन में नमूने के 100 माइक्रोन को पिपेट करें और 5 बार दोहराएं। चित्रा 3में दर्शाए गए आगर प्लेट पर प्रत्येक कमजोर पड़ने का पिपेट 10 माइक्रोन ।
    नोट: यदि अधिक सटीक सीएलयू क्वांटिटेशन की आवश्यकता है, तो अलग-अलग एगर प्लेटों में नमूने के प्रत्येक कमजोर पड़ने का 100 माइक्रोन फैलाएं।

8. फैलाव का पूर्व वीवो मूल्यांकन(चित्रा 4)

  1. चूहों को घाव करें और ऊपर वर्णित लगभग 104 पाओ1 के साथ संक्रमित करें, और फिर संक्रमण के बाद 48 घंटे को इच्छामृत्यु दें।
  2. सावधानी से संदंश के साथ ड्रेसिंग को हटा दें, बाँझ तकनीक का उपयोग करके और घाव बिस्तर को परेशान किए बिना।
  3. घाव बिस्तर के परिधि को असंक्रमित त्वचा से दूर काटने के लिए बाँझ सर्जिकल कैंची का उपयोग करें, घाव बिस्तर के एक छोर को उठाने के लिए संदंश और कैंची के नीचे और आसपास के असंक्रमित ऊतकों के नीचे मांसपेशियों की परत से उत्पादित संक्रमित घाव ऊतक को उठाने के लिए। घाव बिस्तर के नमूनों को बराबर भागों में विभाजित करें या पूरे उपयोग करें।
  4. घाव ऊतक को खाली, पूर्व-तौला 2 एमएल मनका मिल समरूप ट्यूबों में रखें। फिर सैंपल जोड़ने के बाद दोबारा ट्यूब का वजन करें। द्वारा नमूने के वजन की गणना करें:
    नमूना जोड़ने के बाद वजन - नमूना जोड़ने से पहले वजन।
  5. पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें, और धीरे-धीरे ट्यूब 3-5 बार उलटा नमूना कुल्ला और किसी भी प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं को दूर करने के लिए। पीबीएस निकालें और त्यागें।
  6. नमूने में जीएच उपचार (या पीबीएस को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में) का 1 मिलील जोड़ें और 80 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. बायोफिल्म फैलाव समाधान निकालें और एक अलग 1.5 एमएल ट्यूब में रखें। इसमें फैलाई गई कोशिकाएं होती हैं।
  8. शेष ऊतक नमूने में पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें और किसी भी शेष बिखरे हुए कोशिकाओं को कुल्ला करने के लिए धीरे-धीरे 3-5 बार उलटा करें। पीबीएस निकालें और त्यागें।
  9. शेष ऊतकों में पीबीएस का 1 एमएल जोड़ें और बेंचटॉप होमोजेनाइजर का उपयोग करके 60 एस के लिए 5 मीटर/एस पर समरूप हो।
  10. 1.5 एमएल ट्यूब में पीबीएस के 900 माइक्रोन में नमूना के 100 माइक्रोन रखकर और कुल 6 कमजोर पड़ने के लिए पांच बार दोहराकर, फैलाए गए कोशिकाओं और समरूप ऊतक नमूने के समाधान को क्रमिक रूप से पतला करें।
  11. स्पॉट-प्लेट मीडिया चयनात्मक एगर (उदाहरण के लिए, पी एरुगिनोसाके लिए स्यूडोमोनास आइसोलेशन एगर) पर प्रत्येक कमजोर पड़ने का 10 μL और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  12. सीआईयू की गणना करें और 'प्रतिशत तितर-बितर' की गणना करें (सुपरनैंट में सीआईयू/

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Representative Results

इस प्रयोग में, 8-10 सप्ताह पुरानी महिला स्विस वेबस्टर चूहों को ल्यूमिनेसेंस प्लाज्मिड pQF50-लक्स ले जाने वाले PAO1 के 104 सीएफयू से संक्रमित किया गया था। जैसा कि ऊपर वर्णित है, बायोफिल्म ईपीएस को पचाने के लिए पीबीएस (वाहन नियंत्रण) या 10% जीएच (उपचार) के 3 x 30 मिनट उपचारों का प्रशासन करने से पहले 48 घंटे के लिए संक्रमण स्थापित करने की अनुमति दी गई थी। चूहों को उपचार के बाद सीधे (0 एच) और उपचार के बाद 10 एच और 20 घंटे पर पूर्व-उपचार चित्रित किया गया था। चित्रा 2A और पूरक चित्रा 1 घाव बिस्तर के भीतर एक स्थापित संक्रमण दिखाते हैं जो एक उज्ज्वल बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल उत्पन्न करता है। घाव बिस्तर से बाहर बैक्टीरिया के फैलाव GH उपचार (0 एच) के तुरंत बाद कल्पना की जा सकती है, लेकिन PBS उपचार के बाद नहीं । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पिछले अध्ययनों में, हमने रक्त और तिल्ली में बैक्टीरिया का पता लगाया क्योंकि 5 एच पोस्ट जीएच उपचार7। अंगों में जीवाणु प्रसार भी इमेजिंग के लिए अपने पक्ष पर माउस रखकर देखा जा सकता है, जैसा कि चित्रा 2Aके निचले पैनल में दिखाया गया है ।

पीबीएस और जीएच-इलाज चूहों दोनों की छवियों ने प्री-ट्रीटमेंट(चित्रा 2B)की तुलना में 20 घंटे के बाद उपचार पर ल्यूमिनेसेंट सिग्नल में वृद्धि का प्रदर्शन किया। हम परिकल्पना यह समाधान की सिंचाई के कारण बायोफिल्म के यांत्रिक व्यवधान के कारण है। 20 घंटे के बाद उपचार, चूहों इच्छामृत्यु थे, और घाव बिस्तर और तिल्ली CFU गणना करने के लिए एकत्र किया गया/ जबकि घाव बिस्तरों में बैक्टीरियल लोड समान थे(चित्रा 2C),बैक्टीरिया केवल GH-इलाज चूहों(चित्रा 2 डी)की तिल्ली में पाए गए थे, जो फैलाए गए बैक्टीरिया के प्रसार का सुझाव देते थे।

इससे पहले, हमने दिखाया है कि GH उपचार बैक्टीरिया के समुच्चय को तोड़ सकता है, सीआईएफयू में सुधार21मायने रखता है। यह जीएच-इलाज चूहों के घाव बिस्तरों में बैक्टीरियल लोड की मामूली वृद्धि की व्याख्या कर सकता है। अंत में, हालांकि GH-इलाज घाव बिस्तर थोड़ा अधिक CFU/ग्राम था, वहां एक कम प्रतिशत बायोल्यूमिनेसेंट परिवर्तन किया गया । इन परिणामों CFU मायने रखता है के साथ चमक की पुष्टि के महत्व का सुझाव देते हैं । ये प्रतिनिधि परिणाम डेटा का एक उदाहरण देते हैं जिसे ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके एकत्र किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1। बायोफिल्म से जुड़े घाव संक्रमण की स्थापना और वीवो मेंफैलाव एजेंट प्रभावकारिता का आकलन । ड्रेसिंग के इलाज से पहले माउस की त्वचा के लिए आंसू या आसंजन के नुकसान के लिए जांच की गई । समझौता ड्रेसिंग बदल दिया गया । चूहों को उपचार प्रशासन से तुरंत पहले संज्ञाहरण के तहत रखा गया था। एंजाइम समाधान, या एक वाहन नियंत्रण के २०० μL, घाव बिस्तर और ड्रेसिंग के बीच अंतरिक्ष में इंजेक्शन था । ड्रेसिंग धीरे संदंश का उपयोग कर सुनिश्चित करने के लिए पूरे घाव समाधान में संतृप्त किया गया था उठाया गया था । इलाज के लिए 30 मिनट के लिए घाव बिस्तर पर छोड़ दिया गया था । 30 मिनट के बाद, उपचार एक सिरिंज के साथ aspirated था, और उपचार के एक और २०० μL जोड़ा गया था । यह कुल 3 उपचार के लिए दोहराया गया था। वास्तविक समय में फैलाव को मापने के लिए, चूहों को उपचार से पहले आईवीआईएस का उपयोग करके चित्रित किया गया था, तुरंत उपचार के बाद (0 एच), 10 एच, और 20 घंटे के बाद उपचार। 20 घंटे के बाद उपचार, चूहों इच्छामृत्यु थे, और घाव बिस्तर और तिल्ली एकत्र किए गए । नमूनों को पीबीएस में धोया गया और फिर 60 एस के लिए 5 मीटर पर दो बार ताजा पीबीएस में समरूप किया गया। इसके बाद नमूनों को क्रमिक रूप से पतला कर स्पॉट चढ़ाया गया । सीएलयू की गणना की गई और सीएलयू/ग्राम की गणना की गई । घाव से बैक्टीरिया के फैलाव का स्तर या तो आईवीआईएस द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है या सीएलयू की संख्या निर्धारित करके जो तिल्ली में व्यवस्थित रूप से फैलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। प्रतिनिधि डेटा प्रदर्शित करता है कि वीवो में फैलाव का आकलन कैसे किया जाता है। 48 एच के लिए10 4 PAO1 (pQF50-लक्स) से संक्रमित घावों का इलाज या तो पीबीएस, या 10% GH (बायोफिल्म फैलाव एंजाइम समाधान) के साथ किया गया था। पीबीएस उपचार एक वाहन नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। घाव बिस्तरों को 3 x 30 मिनट उपचार के साथ इलाज किया गया था। चूहों को उपचार से पहले आईवीआईएस का उपयोग करके चित्रित किया गया था, तुरंत उपचार के बाद, 10 एच पोस्ट-उपचार, और 20 घंटे के बाद उपचार। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि साइड-व्यू छवियां ओवरहेड-व्यू छवियों (ए)में दिखाए गए लोगों की तुलना में विभिन्न पीबीएस और जीएच-इलाज चूहों से हैं। प्रत्येक पूर्व उपचार घाव बिस्तर और प्रत्येक 20 घंटे के बाद उपचार घाव बिस्तर के लिए ROIs दर्ज किए गए । प्री-ट्रीटमेंट से प्रतिशत परिवर्तन की गणना (आरओआई प्री-ट्रीटमेंट-आरओआई पोस्ट-ट्रीटमेंट/आरओआई प्री-ट्रीटमेंट) एक्स १०० (बी) केरूप में की गई थी । उपचार के बाद 20 घंटे में, चूहों को इच्छामृत्यु दी गई। घाव बिस्तरों और तिल्ली एकत्र किए गए थे और क्रमशः CFU/ग्राम (सी और डी)निर्धारित करने के लिए तौला गया था । एन = 3। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। सीरियल तनुशन और स्पॉट प्लेटिंग। समरूप नमूना भंवर था और 100 माइक्रोन को 1.5 एमएल एप्पेंडोर्फ ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया गया था जिसमें पीबीएस का 900 माइक्रोन था। नमूना भंवर था और 100 माइक्रोन पीबीएस के 900 माइक्रोन के साथ एक और 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया गया था। इस प्रक्रिया को 5 बार दोहराया गया। पिछले कमजोर पड़ने ट्यूब के साथ शुरू, नमूना के 10 μL हाजिर10-8में आगर प्लेट पर चढ़ाया गया था । इसे 10-3को कमजोर करने तक जारी रखा गया था । आमतौर पर,10-3 कमजोर पड़ने के परिणामस्वरूप जगह के भीतर बैक्टीरिया का एक लॉन होता है। कुछ अंगों, जिनमें कम बैक्टीरियल लोड होता है, को 10-1 कमजोर पड़ने तक स्पॉट प्लेटिंग की आवश्यकता हो सकती है। प्रत्येक ऊतक नमूने के लिए दोहराएं। 24-48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में आगर प्लेट रखें, या उन परिस्थितियों में बढ़ें जो ब्याज की जीवाणु प्रजातियों के लिए इष्टतम हैं। सीआईयू की गणना करने के लिए, सबसे कम कमजोर पड़ने पर व्यक्तिगत कालोनियों की गणना करें, और सीआईएफयू/एमएल निर्धारित करने के लिए उचित कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा करें या ऊतक के सीआईएफयू/जी की गणना करने के लिए ऊतक वजन का उपयोग करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4। संक्रमित ऊतक पूर्व वीवोसे फैलाव को मापना । चूहों को इच्छामृत्यु दी गई और संक्रमित घाव ऊतक को aseptically हटा दिया गया था । संक्रमित ऊतक को 2 एमएल मनका मिल होमोजेनाइजिंग ट्यूब में रखा गया था और पीबीएस के साथ संक्षेप में धोया गया था। फैलाव एजेंट के 1 मिलील और नमूना 80 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया गया था। इनक्यूबेशन के बाद, फैलाया कोशिकाओं युक्त समाधान को हटा दिया गया और एक अलग 1.5 एमएल ट्यूब में रखा गया। शेष ऊतक को पीबीएस के 1 एमएल से धोया गया था। ताजा पीबीएस के 1 एमएल को ऊतक में जोड़ा गया और 60 एस के लिए 5 मीटर प्रति मीटर पर समरूप किया गया। एंजाइम समाधान और समरूप ऊतक तो क्रमिक रूप से पतला और चयनात्मक आगर पर चढ़ाया हाजिर थे । सीआईयू की गणना की गई थी और फैलाव की गणना की गई थी: एंजाइम समाधान से सीएलयू/ कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 1. वीवो फैलाव में मापना। घाव 48 घंटे के लिए 104 PAO1 (pQF50-लक्स) से संक्रमित थे और फिर पीबीएस, या 10% GH (बायोफिल्म फैलाव एंजाइम समाधान) के साथ इलाज किया गया था। पीबीएस उपचार एक वाहन नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। घाव बिस्तरों को 3 x 30 मिनट सिंचाई उपचार के साथ इलाज किया गया था। चूहों को उपचार से पहले आईविस का उपयोग करके चित्रित किया गया था, तुरंत उपचार के बाद, 10 एच पोस्ट-उपचार, और 20 एच पोस्ट-ट्रीटमेंट (ए)। उपचार के बाद 20 घंटे में, चूहों को इच्छामृत्यु दी गई। घाव बिस्तरों और तिल्ली को एकत्र किया गया था और क्रमशः सीएलयू/ग्राम (बी और सी)निर्धारित करने के लिए तौला गया था। एन = 3। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां हम उन प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिनका उपयोग बायोफिल्म फैलाव एजेंटों की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इन प्रोटोकॉल को आसानी से विभिन्न प्रकार के फैलाव एजेंटों, जीवाणु प्रजातियों या पूर्व वीवो नमूनों के साथ उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें नैदानिक डिब्राइडमेंट नमूने शामिल हैं। यह प्रोटोकॉल तितर-बितर जीवाणु कोशिकाओं को इकट्ठा करने और अध्ययन करने के लिए एक चिकित्सकीय प्रासंगिक मॉडल भी प्रदान करता है। बिखरे हुए जीवाणु कोशिकाओं के फेनोटाइप को प्लैंक्टोनिक या बायोफिल्म कोशिकाओं 5 , 24 , 25,26से अलग दिखाया गया है . हालांकि, वीवो में फैले बैक्टीरिया के फेनोटाइप अभी तक वर्णित कियाजाना है . यदि फैलाव एजेंटों को चिकित्सकीय रूप से उपयोग किया जाना है, तो उनकी प्रभावकारिता का निर्धारण करना, साथ ही इन कोशिकाओं को अपनाने वाले फेनोटाइप को समझना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल का उपयोग यह अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है कि ईपीएस संरचना में भिन्नता या सिग्नलिंग रास्तों में परिवर्तन फैलाव को कैसे प्रभावित करता है। उदाहरण के लिए, विभिन्न एक्सोपोलिनोसैकराइड घटकों (जैसे, पेल, पीएसएल, एल्गिनेट) में म्यूटेशन के साथ पी एरुगिनोसा उपभेदों के फैलाव की तुलना जंगली प्रकार के उपभेदों की तुलना की जा सकती है।

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल को चार मुख्य वर्गों में तोड़ा जा सकता है: (1) संक्रमण (2) प्रशासन उपचार या (3) पूर्व वीवो उपचार के लिए संक्रमित ऊतक एकत्र करने और (4) फैलाव प्रभावकारिता का निर्धारण करना। धारा 1 का महत्वपूर्ण हिस्सा घाव बिस्तर में संक्रमण की सफल स्थापना है। यदि ल्यूमिनेसेंट उपभेदों, जो प्लाज्मिड स्थिरता बनाए रखने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं की आवश्यकता होती है, का उपयोग किया जा रहा है, तो संक्रमण की तैयारी में उपभेदों को विकसित करते समय उपयुक्त एंटीबायोटिकदवाओं को जोड़ना अनिवार्य है। यह भी माना जाना चाहिए कि जानवर (एंटीबायोटिक दबाव के बिना) में संक्रमण के दौरान प्लाज्मिड को बनाए नहीं रखा जा सकता है, इस प्रकार बैक्टीरियल लोड का आकलन पूरी तरह से आईवीआईएस इमेजिंग पर भरोसा नहीं करना चाहिए, लेकिन सीआईएफयू द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए। संक्रमण शुरू करने के लिए इनोक्यूलेशन खुराक भी एक महत्वपूर्ण कदम है। पी एरुगिनोसा और एस ऑरियस के लिए, 104-5 सीएलयू की एक संक्रमित खुराक आमतौर पर उपयोग की जाती है, लेकिन इष्टतम खुराक बैक्टीरियल और माउस प्रजातियों के आधार पर भिन्न हो सकती है।

धारा 2 का महत्वपूर्ण हिस्सा यह सुनिश्चित कर रहा है कि घाव बिस्तर संक्रमण और उपचार के विकास के दौरान ड्रेसिंग द्वारा कवर किया जाता है। यदि ड्रेसिंग का ठीक से पालन नहीं किया जाता है, तो उपचार घाव बिस्तर से रिसाव कर सकता है और अप्रभावी हो सकता है। ड्रेसिंग घाव बिस्तर को संभावित संदूषकों से संरक्षित रखने और माउस द्वारा संकुचन उपचार को ख़राब करने के लिए भी महत्वपूर्ण है, जो मानव घाव भरने की नकल करने के लिए आवश्यक है। अंत में, धारा 3 का महत्वपूर्ण हिस्सा एकत्र किए गए नमूनों को ठीक से संभालना है। सीएलयू की गणना करने के लिए, संक्रमित ऊतक को समरूपता के लिए पीबीएस के एक और 1 एमएल के अलावा से पहले पीबीएस के 1 एमएल के साथ धोया जाना चाहिए। फेफड़ों जैसे अधिक रेशेदार अंगों को अधिक गहन समरूपता की आवश्यकता हो सकती है।

इन प्रोटोकॉल की प्राथमिक सीमाओं में ड्रेसिंग की आवश्यक बारीकी से निगरानी और छवि फैलाव के लिए आईवीआईएस का उपयोग और फैलाव प्रभावकारिता के बारे में अनुमान लगाना शामिल है। दीर्घकालिक अध्ययनों के लिए, फर का पुनः विकास समस्याग्रस्त हो सकता है क्योंकि यह घाव साइट के ड्रेसिंग पालन में बाधा डाल सकता है। ड्रेसिंग अक्सर प्रतिस्थापन की आवश्यकता होती है, और उनके हटाने से घाव और संदूषण के अवसर का आकस्मिक डिब्राइडमेंट हो सकता है। घाव बिस्तर से फैलाव की कल्पना करने के लिए, एक बायोल्यूमिनेसेंट बैक्टीरियल तनाव का उपयोग किया जाना चाहिए। यदि ब्याज की जीवाणु प्रजातियों में बायोल्यूमिनेसेंट रिपोर्टर का अभाव है, तो यह विकल्प व्यवहार्य नहीं है। एक और सीमा जीवाणु को प्रेरित करने के लिए फैलाव उपचार की क्षमता है, जो माउस की मौत का कारण बन सकती है। हालांकि, हमने देखा है कि फैलाया कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से वीवो7में एंटीबायोटिक दवाओं द्वारा मारा जा सकता है ।

चित्रा 2 में चित्रित प्रतिनिधि परिणाम फैलाव प्रभावकारिता को मापने के लिए आईवीआईएस की सीमा को दर्शाते हैं। सबसे पहले, ब्याज की जीवाणु प्रजातियों के एक ल्यूमिनेसेंट तनाव का उपयोग किया जाना चाहिए। तनाव को एक ल्यूमिनेसेंट संकेत का उत्पादन करना चाहिए जो घाव के बिस्तर से शरीर के अन्य हिस्सों तक फैलाव की कल्पना करने के लिए ऊतक की कई परतों के माध्यम से पता लगाने के लिए पर्याप्त उज्ज्वल है। यह सुझाव दिया गया है कि आईवीआईएस27द्वारा पता लगाने के लिए ल्यूमिनेसेंट सिग्नल का उत्पादन करने के लिए न्यूनतम लगभग10 6 बैक्टीरिया की आवश्यकता होती है । जब बैक्टीरिया स्थिर चरण28में प्रवेश करते हैं तो ल्यूमिनेसेंट सिग्नल में कमी का भी वर्णन किया गया है । इससे आरओआई मापा जाता है और29की गणना करने वाले सीएलयू के बीच एक डिस्कनेक्ट हो सकता है । यह सीमा झूठी मान्यताओं का कारण बन सकती है जब पता लगाने के लिए पर्याप्त संकेत नहीं होता है, लेकिन बैक्टीरिया अभी भी मौजूद हैं। जैसा कि चित्रा 2B,पीबीएस और 10% जीएच उपचार में दिखाया गया है, उपचार के बाद ल्यूमिनेसेंस में वृद्धि हुई। यह एक जिज्ञासु और लगातार अवलोकन है, जिसे विट्रो (क्लाउडिया मार्क्स, बिंगहैमटनविश्वविद्यालय, व्यक्तिगत संचार) में कोशिकाओं को फैलाने के बाद भी देखा गया है। यह संभव है कि उपचार के प्रशासन से बायोफिल्म का शारीरिक व्यवधान उन कोशिकाओं को फैलाता है जो कसकर पैक किए गए थे, जिसके परिणामस्वरूप प्रकाश संकेत बढ़ जाता है। वैकल्पिक रूप से, फैलाव उपचार बायोफिल्म कोशिकाओं को 'जगा' सकता है जो पहले चयापचय रूप से निष्क्रिय थे, जिसके परिणामस्वरूप बायोल्यूमिनेसेंस में वृद्धि हुई। किसी भी तरह से, सीआईडब्ल्यूआई डेटा के साथ आईवीआईएस इमेजिंग के परिणामों की पुष्टि करना महत्वपूर्ण है। अंत में, संक्रमित घाव ऊतक30,31के भीतर बैक्टीरिया का विषम वितरण होता है। इसलिए, यदि ऊतक को अधिक नमूने प्रदान करने के लिए पूर्व वीवो विभाजित किया जाता है, तो यह नहीं माना जाना चाहिए कि प्रत्येक घाव अनुभाग में बैक्टीरियल लोड समान है।

इन मॉडलों की सीमाओं को दूर करने के लिए आयोजित किए जा सकते हैं कि संशोधन और समस्या निवारण कर रहे हैं। सबसे पहले, डिपिलेटरी क्रीम के जोखिम के लिए आवंटित समय की राशि का उपयोग माउस प्रजातियों के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, 7 मिनट आम तौर पर स्विस वेबस्टर चूहों के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि C57BL/6 चूहों को सफलतापूर्वक फर को हटाने के लिए 10 मिनट तक जोखिम की आवश्यकता हो सकती है । बेशक यह उपयोग किए गए उत्पाद पर भी निर्भर करता है, और एक्सपोजर समय निर्माता के निर्देशों से कभी भी अधिक नहीं होना चाहिए। यदि एक लंबा अध्ययन (4 + दिन) आयोजित किया जा रहा है, तो फिर से उगाए गए फर को हटाने और ड्रेसिंग की उचित मुहर सुनिश्चित करने के लिए डिपिलेटरी क्रीम को फिर से लागू करने की आवश्यकता हो सकती है। इसके बाद, यदि एक ल्यूमिनेसेंट सिग्नल का पता लगाना मुश्किल है, तो आईविस इमेजिंग के दौरान एक्सपोजर समय बढ़ाया जा सकता है। इनोक्यूलेशन डोज और इंफेक्शन का समय भी एडजस्ट किया जा सकता है। एक संक्रमित खुराक का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो बहुत अधिक नहीं है कि यह माउस को अभिभूत करता है, लेकिन यह भी कम नहीं है कि बैक्टीरिया तुरंत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से साफ हो जाता है।

इस प्रोटोकॉल में, हम फैलाव एजेंटों के साथ 48 एच-पुराने घाव संक्रमणों का इलाज करने का वर्णन करते हैं, क्योंकि यह एक समय बिंदु है जो हमने पी एरुगिनोसा और/या एस ऑरियस के कारण संक्रमण दिखाया है स्थापित किया गया है और बायोफिल्म से जुड़े 12,15,16। हालांकि, बैक्टीरियल प्रजातियों के आधार पर, अन्य समय अंक अधिक इष्टतम हो सकते हैं। आदर्श रूप से, संक्रमण स्थापित होने के बाद घाव में बैक्टीरियल लोड पठार होना चाहिए। उदाहरण के लिए, हमने देखा है कि पी एरुगिनोसा और एस ऑरियस दोनों के साथ, घाव में बैक्टीरियल लोड लगभग 108 सीएलयू/जी ऊतक तक पहुंचता है ४८ घंटे के बाद संक्रमण और घाव बंद होने तक उस स्तर पर रहता है । चित्रा 1 3 x 30 मिनट वॉश की आवश्यकता वाले समाधान के साथ उपचार दिखाता है। हालांकि, अगर फैलाव एजेंट दूसरे रूप में था, तो वॉश जरूरी नहीं होगा। उदाहरण के लिए, एक क्रीम, जेल या इंजीनियर ड्रेसिंग बस घाव बिस्तर के शीर्ष पर रखा जा सकता है । अंत में, घाव को प्लैंक्टोनिक बैक्टीरियल कोशिकाओं के टीका, पूर्व सूचित बायोफिल्म्स12,या यहां तक कि किसी अन्य जानवर या मानव19,32से संक्रमित डिब्राइडेशन ऊतक सहित विभिन्न तरीकों से संक्रमित किया जा सकता है। हमने देखा है कि घाव बिस्तर पर एक प्रीफॉर्मेड बायोफिल्म या डिब्राइडमेंट नमूना प्रत्यारोपण के परिणामस्वरूप अधिक सफल पॉली-माइक्रोबियल संक्रमण होते हैं, जब कई प्रजातियों को उनके प्लैंक्टोनिक फॉर्म12में टीका लगाया जाता है।

कुल मिलाकर, ये प्रोटोकॉल बायोफिल्म फैलाव और चिकित्सीय बायोफिल्म फैलाव एजेंटों के मूल्यांकन का अध्ययन करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। ये मॉडल जटिल पॉली-माइक्रोबियल बायोफिल्म से जुड़े संक्रमणों के विकास के लिए अनुमति देते हैं जो चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक मानव संक्रमणों की नकल करते हैं। हमारी आशा है कि इन प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाएगा और चिकित्सकीय उपयोग के लिए एंटी-बायोफिल्म फैलाव एजेंटों के विकास को आगे बढ़ाने के लिए परिष्कृत किया जाएगा ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R21 AI137462-01A1), टेड नैश लांग लाइफ फाउंडेशन, जैपर एल और जैक डेंटन विल्सन फाउंडेशन और रक्षा विभाग (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher 14823434 Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle Fisher 14823434 Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt Fisher BP1760-5 Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase MP Biomedicals 2100447 Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) ZooPharm RX216118 Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase MP Biomedicals 2150583 Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream Walmart 287746 Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips Fisher 12-460-536 Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL Fisher 101406 Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer MP Biomedicals 6VFV9 Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 0298-9373-68 Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) Fisher 15340151 Used to homogenize samples for plating
Isoflurane Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN Sigma Aldrich K4138 Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller Fisher BP1426-2 Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable Diamond Back Drugs 2468 Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem Sigma Aldrich PHR1772-500MG Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges Fisher 13-761-52 Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain Ref [13] N/A PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes Fisher PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x Fisher BP3991 Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing Mckesson 66024007 Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar VWR 90004-394 Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M. Walmart Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads Fisher 22-363-750 Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors Fisher 89515 Can also use curved scissors
Swiss Webster mice Charles River 551NCISWWEB Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL Fisher 14823434 Used to administer drugs and enzyme treatment

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 174 पूर्व वीवो, वीवो में,बायोफिल्म फैलाव घाव संक्रमण एंटी-बायोफिल्म एजेंट स्यूडोमोनास एरुगिनोसा
मुरीन घावों में बायोफिल्म फैलाव का आकलन
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Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds. J. Vis. Exp. (174), e62136, doi:10.3791/62136 (2021).

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