Summary
Здесь мы подробно описываем метод эксплантации костного мозга, от пробоподготовки до микроскопического анализа слайдов, для оценки способности мегакариоцитов, которые дифференцировались в своей физиологической среде, образовывать проплацелеты.
Abstract
Последняя стадия мегакариопоэтиса приводит к цитоплазматическим расширениям из зрелых мегакариоцитов, так называемых проплацелетов. Многое было изучено о формировании проплатлетов с использованием in vitro-дифференцированных мегакариоцитов; однако появляется все больше доказательств того, что традиционные системы культивирования не точно повторяют процесс дифференцировки/созревания, который происходит внутри костного мозга. В этой рукописи мы представляем метод эксплантата, первоначально описанный в 1956 году Тьери и Бессисом для визуализации мегакариоцитов, которые созрели в своей родной среде, тем самым обходя потенциальные артефакты и неправильные интерпретации. Свежие костные мозги собирают путем промывки бедренных костей мышей, нарезают на поперечные сечения 0,5 мм и помещают в инкубационную камеру при 37 °C, содержащую физиологический буфер. Мегакариоциты постепенно становятся видимыми на периферии экспланта и наблюдаются до 6 часов под перевернутым микроскопом, соединенным с видеокамерой. Со временем мегакариоциты меняют свою форму, причем некоторые клетки имеют сферическую форму, а другие развивают толстые расширения или расширяют множество тонких пластин с обширным ветвлением. Проводятся как качественные, так и количественные исследования. Этот метод имеет то преимущество, что он прост, воспроизводим и быстр, так как присутствуют многочисленные мегакариоциты, и классически половина из них образует проплацелеты за 6 часов по сравнению с 4 днями для культивируемых мышиных мегакариоцитов. В дополнение к изучению мышей-мутантов, интересным применением этого метода является прямая оценка фармакологических агентов в процессе расширения проплатлетов, не вмешиваясь в процесс дифференцировки, который может происходить в культурах.
Introduction
Метод эксплантации костного мозга был впервые разработан Тьери и Бессисом в 1956 году для описания формирования цитоплазматических расширений мегакариоцитов крыс как начального события в образовании тромбоцитов1. Используя фазовый контраст и кинематографические методы, эти авторы охарактеризовали трансформацию зрелых круглых мегакариоцитов в «кальмароподобные» тромбоцитогенные клетки с цитоплазматическими расширениями, показывающими динамические движения удлинения и сокращения. Эти руки становятся все тоньше, пока не станут нитевидными с небольшими отеками вдоль рук и на кончиках. Эти типичные удлинения мегакариоцитов, полученные in vitro и в жидких средах, имеют определенное сходство с тромбоцитами, наблюдаемыми в фиксированном костном мозге, где мегакариоциты выступают длинными расширениями через синусоидальные стенки в кровообращение2,3. Открытие и клонирование ТПО в 1994 г. позволило дифференцировать мегакариоциты в культуре, способные образовывать расширения проплатлетов, напоминающие описанные в костном мозговых эксплантатах4,5,6. Однако созревание мегакариоцитов гораздо менее эффективно в условиях культивирования, в частности, обширная внутренняя мембранная сеть зрелых мегакариоцитов костного мозга недоразвита в культивированных мегакариоцитах, что затрудняет исследования механизмов биогенеза тромбоцитов7,8.
Здесь мы подробно описываем модель экспланта костного мозга, основанную на Тьери и Бессисе, чтобы проследить в реальном времени за образованием проплатлетов мышиных мегакариоцитов, которые полностью созрели в своей родной среде, тем самым обходя возможные артефакты in vitro и неправильные интерпретации. Представлены результаты, полученные у взрослых мышей дикого типа, иллюстрирующие способность мегакариоцитов к расширению проплацетов, их морфологию и сложность проплацелетов. Мы также внедряем стратегию быстрой количественной оценки для проверки качества для обеспечения точности и надежности данных в процессе регистрации мегакариоцитов. Протокол, представленный здесь, является самой последней версией метода, опубликованной в виде главы книгиранее 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с европейскими стандартами 2010/63/EU и Комитетом CREMEAS по этике экспериментов на животных Страсбургского университета (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).
1. Подготовка реагентов
- Готовят реагенты, как описано в таблице 1.
- Для запаса I растворите каждый порошок отдельно. Убедитесь, что осмолярность препарата выше 295 мОсм/л. Этот раствор можно хранить при 4 °C в течение одного года.
- Для буферного приготовления тирода внесите раствор, как описано в таблице 1,отрегулируйте объем до 100 мл с дистиллированной водой и добавьте 0,1 г безводной D (+) сахарозы. При необходимости отрегулируйте pH 7,3 с использованием 1 N HCl и осмолярность до 295 мОсм/л. Для предотвращения роста бактерий добавляют пенициллин G в конечной концентрации 10 Ед/мл и сульфат стрептомицина в конечной концентрации 0,29 мг/мл. Процедить конечный раствор через поры 0,22 мкм.
2. Подготовка экспериментального установки
- В день эксперимента нагрейте буфер Тирода при 37 °C и включите нагревательную камеру микроскопа, чтобы довести температуру до 37 °C.
- Подготовьте все необходимые инструменты, такие как таймер, инкубационные камеры, шприцы 5 мл, 21 г, щипцы, лезвие бритвы, пипетки Пастера, стеклянные слайды и 15 мл центрифужная трубка(рисунок 1А).
3. Выделение костного мозга мыши
- Усыпленить мышей C57BL/6 в возрасте 8-12 недель путем удушьяCO2 и вывиха шейки матки. Это должно быть сделано быстро компетентным и квалифицированным человеком.
- Чтобы избежать микробного загрязнения, замочите тело мыши в 70% (v/v) этаноле перед удалением бедренных кочных кочных кочных масс. Используйте инструменты, продезинфицированные в 70% этаноле для рассечения. Соберите две бедренные кости и очистите их, удалив любую адгезивную ткань. После быстрого погружения в этанол поместите их в 15 мл центрифужную трубку, содержащую 2 мл буфера Tyrode.
- Отрежьте эпифизы острым лезвием бритвы и промывайте костный мозг с помощью шприца 5 мл, заполненного буфером Tyrdode 2 мл. Чтобы достичь этого, введите иглу 21 G в отверстие бедренной кости (со стороны колена) и медленно нажмите на поршень, чтобы извлечь неповрежденный цилиндр костного мозга(рисунок 1B,C). Держите сеанс сбора костного мозга как можно короче (менее 10 минут).
4. Сечение костного мозга и помещение в инкубационную камеру
- Используйте пластиковую пипетку объемом 3 мл, чтобы аккуратно и аккуратно перенести неповрежденный костный мозг на стеклянную горку. Важно, чтобы образцы были покрыты буфером для предотвращения высыхания(рисунок 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте потока-опрокидываемого потока, чтобы свести к минимуму сдвиги, которые могут диссоциировать ткань. - Под стереомикроскопом (10x) отрежьте концы костного мозга, которые могли быть сжаты во время промывки. Затем вырежьте поперечные участки острым лезвием бритвы. Срезы должны быть достаточно тонкими, чтобы можно было провести подробное наблюдение, но гарантировать, что мегакариоциты не повреждаются при сжатии (обычно толщина около 0,5 мм)(рисунок 1E,F).
ПРИМЕЧАНИЕ: Секции выполнены с острым лезвием бритвы и под лупой для регулировки их толщины примерно до 0,5 мм. Выбираются только участки равномерной толщины. Эта процедура не сложна, но ее стандартизация требует некоторого опыта. - Используя пластиковую пипетку, соберите 10 секций в трубку объемом 1 мл, содержащую буфер Тирода(рисунок 1G).
- Аккуратно перенесите секции в инкубационную камеру диаметром 13 мм(рисунок 1Н).
- Аспирируйте буфер и отрегулируйте объем до 30 мкл буфера Tyrode, дополненного 5% сывороткой мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Именно на этом этапе могут быть добавлены фармакологические средства для оценки их влияния на образование проплателетов. - Расположите секции на расстоянии. Запечатайте самоклеящуюся камеру с помощью крышки размером 22 х 55 мм. Наклоняйте крышку во время прилипания, чтобы избежать образования пузырьков воздуха(рисунок 1I).
- Поместите камеру в нагревательную камеру при 37 °C. С этого момента запускается хронометр (T= 0 ч). Эксперимент длится 6 ч при 37 °C (T= 6 ч).
5. Наблюдение в режиме реального времени за эксплантами костного мозга
- Используйте инвертированный фазоконтрастный микроскоп (40-кратный объектив для увеличения), соединенный с видеокамерой, для наблюдения за эксплантами костного мозга. Дайте клеткам инкубироваться в течение 30 минут перед началом наблюдения. Во время наблюдения необходимо корректировать фокус, потому что мегакариоциты движутся.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возможны и другие режимы наблюдения (например, ДВС-травма, флуоресценция с использованием мышей, чьи мегакариоциты экспрессируют эндогенный флуоресцентный маркер), но фазово-контрастная микроскопия оптимальна для четкой визуализации длинных и тонких расширений мегакариоцитов, что позволяет точно количественно оценить. Через 30 мин клетки костного мозга постепенно мигрируют на периферию экспланта, образуя монослой. После 1 ч инкубации мегакариоциты можно идентифицировать по их большим размерам и полилобуляционным ядрам(рисунок 1J,K). После 3 ч инкубации количество мегакариоцитов увеличивается, а некоторые имеют длительные расширения. - Делайте видео для записи трансформации мегакариоцитов.
6. Количественная оценка проплателет-расширяющих мегакариоцитов
- Нарисуйте карту для локализации каждого участка в инкубационной камере(рисунок 1K).
- Через 1 ч определите видимые мегакариоциты (т.е. гигантские полилобулированные клетки) на периферии каждого участка и нарисуйте их положения на рисунке. Повторите эту процедуру через 3 и 6 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: На основании рисунка каждый мегакариоцит может быть легко локализован с течением времени и проанализирована эволюция их морфологии (например, размер, деформация, расширение проплатлетов и т.д.). Другой возможностью является использование специального навигационного программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Качественные результаты. В начале эксперимента все клетки уплотняются в области костного мозга. Требуется 30 минут, чтобы клетки стали хорошо видны на периферии эксплантов. Затем мегакариоциты распознаются по их большому размеру, и их эволюция затем может быть изучена с течением времени (размер, форма, динамика, расширение проплатлетов и высвобождение тромбоцитов)(рисунок 2A). Малые мегакариоциты имеют диаметр от 20 до 30 мкм, и их ядра полилобулированы, в то время как зрелые круглые мегакариоциты больше (> 30 мкм в диаметре) с увеличенной цитоплазмой. Может наблюдаться несколько темных мегакариоцитов(рисунок 2C). Они представляют собой мертвые клетки, доля которых не должна превышать 0,5%. Пропорция, превышающая это значение, указывает на проблему подготовки образца. Морфологию ядра можно легко визуализировать, изменяя фокус.
Количественные результаты. Мегакариоциты подсчитывают вручную, как описано в 6.2. и классифицируются по их морфологии через 3 ч и 6 ч после герметизации инкубационной камеры. На рисунке 2A обобщены четыре основных класса мегакариоцитов: (1) малые МК, (2) большие МК, (3) МК с толстыми расширениями, (4) МК с тонкими, удлиненными и разветвленными расширениями. Это более поздние типичные проплателетообразующие мегакариоциты, с выдающимися характеристиками отеков вдоль проплац и наличием рефракционных почек на их конечностях. С помощью картографирования(рисунок 1K)их эволюцию можно проследить с течением времени. Результаты выражаются в процентах от каждого класса в каждое время наблюдения. Классически, половина мегакариоцитов, видимых на периферии, простирается через 6 часов для костного мозга мыши дикого типа C57BL/6(рисунок 2B).
Можно проследить за судьбой круглых МК, захватывая последовательные изображения с течением времени, чтобы изобразить, как они образуют проплацелеты(Видео 1). Интересно, что когда МК с толстыми расширениями контролировались в течение 3 ч, было замечено, что толстые расширения могут либо отделяться от тела клетки и разветвляться на пластины, либо втягиваться, чтобы реформировать большие круглые МК.
| Реагентов | Н2О | ||||
| Склад I* | 16 г | 0,4 г | 2 г | 0,116 г | |
| НаКл | ККЛ | НаХКО3 | НаН2ПО4, | до 100 мл | |
| (2,73 м) | (53,6 мМ) | (238 мМ) | (8,6 мМ) | ||
| Склад II | 2,033 г MgCl2,6H2O (0,1 М) | ||||
| Склад III | 2,19 г CaCl2.6H2O (0,1 М) | до 100 мл | |||
| Акции HEPES** | 119 г HEPES* (0,5 М) | до 1 л | |||
| Буфер Тирода*** | 5 мл Запас I | 1 мл Шток II | 2 мл Запас III | 1 мл HEPES Сток | 1,8 мл альбумина Stock |
Таблица 1: Подготовка буфера тирода. Каждое запасное решение указано в первой колонке таблицы. Состав, а также количество реагента (указанного в граммах), необходимое для каждого запасного раствора, указывается в ряду. Каталожный номер и компания каждого реагента приведены в таблице основных поставок.
Рисунок 1:Фотографические изображения метода пробоподготовки для эксплантата костного мозга. (A) Экспериментальная установка, необходимая для подготовки костного мозга. (B) В кость вставляется игла, установленная на шприце 21 калибра. (C) Костный мозг смывается в трубку, содержащую буфер Тирода. (D) Затем костный мозг осторожно осаждается на стеклянной горке. (E) Конечности костного мозга отрезаны. (F) Цилиндр костного мозга разрезается на десять участков толщиной 0,5 мм. (Г-Н) Десять секций переносят в инкубационную камеру и наблюдают при 37 °C с помощью инвертированного микроскопа. (I) Репрезентативная фотография инкубационной камеры, содержащей десять участков костного мозга. Периферическиеклетки мигрируют, образуя слой, в котором мегакариоциты становятся видимыми. (K)Пример рисунка, иллюстрирующего десять эксплантных секций в инкубационной камере, а также расположение мегакариоцитов (Синяя метка X), которые мигрировали из ткани для каждого участка. Стрелка показывает мегакариоцит на периферии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Морфологическая классификация мегакариоцитов в эксплантах с течением времени. (А)Мегакариоциты классифицируются как «малые», «большие», с «толстым расширением» или «проплателет-расширяющиеся». Бары: 50 мкм(В)Доля мегакариоцитов в каждом классе определялась через 1 ч, 3 ч и 6 ч в общей сложности 1 468 мегакариоцитов, показывая, что доля «малых» и «сферических» мегакариоцитов со временем уменьшается, в то время как параллельно увеличивается доля мегакариоцитов, распространяющих проplatelets (n=6 мышей). Как правило, в эксплантатах мыши WT через 3 ч наблюдается от 8,3 до 11,5 мегакариоцитов на участок. Полоса ошибок соответствует стандартной погрешности среднего значения для каждого образца. (C) Репрезентативное изображение темного мегакариоцита. Бар: 50 мкм(D)Репрезентативное изображение мегакариоцита с немускулистым миозином II-A, помеченным зеленым флуоресцентным белком. Бар: 50 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Покадровое видео, показывающее MK, расширяющий проплателеты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем простой и недорогой метод in vitro для оценки эффективности мегакариоцитов для расширения процибетов, выросших в костном мозге. Модель эксплантата костного мозга для мышей имеет четыре основных преимущества. Во-первых, не требуются продвинутые технические навыки. Во-вторых, время, необходимое для получения мегакариоцитарных проплацелетов, довольно короткое, всего 6 часов для метода экспланта, по сравнению с минимумом 4 дня для обычного метода культивирования, начиная с мышиных прародителей. В-третьих, учитывая, что требуется только небольшое количество ткани и что полученные результаты воспроизводимы, это уменьшает количество необходимых мышей до минимума (обычно 6 мышей на экспериментальное состояние), что делает эти эксперименты экономически и этически эффективными. Наконец, но важно, сила этого метода заключается в использовании мегакариоцитов, которые полностью развились в их естественной среде, что может оказаться неоценимым в выявлении фенотипов, которые могут быть замаскированы in vitro потенциальными артефактами условий культуры. Это было ранее задокументировано у мышей с мегакариоцитарно-ограниченной инактивацией MYH9, где были обнаружены противоположные результаты по образованию проплатлетов in vitro (повышенное образование)10 и in vivo (снижение образования) дифференцированных мегакариоцитов11. Эти парадоксальные результаты были объяснены требованием миозина IIA для нормальной дифференцировки мегакариоцитов в среде ограничения, в то время как миозин IIA необязатен для дифференцировки мегакариоцитов в жидкой культуре7.
Интересным применением эксплантной модели костного мозга является возможность изучения влияния генетических мутаций или недостатков у трансгенных мышей и/или фармакологических агентов исключительно на процесс расширения тромбоцитов, не вмешиваясь в процесс дифференцировки, как в случае культуры in vitro12. Идеальная ситуация заключается в использовании костного мозга одной бедренной кости в качестве обработанного образца и его аналога в качестве контрольного. Кроме того, использование трансгенных мышей, позволяющих спонтанную флуоресценцию в мегакариоцитах, облегчает визуализацию процесса расширения тромбоцитов. Для визуализации флуоресцентных мегакариоцитов одной из возможностей может быть добавление флуоресцентно-меченых антител против специфических маркеров мегакариоцитов в культуральной камере. Другой возможностью может быть использование генетически модифицированных моделей мышей, экспрессирующих флуоресцентный белок, либо конкретно в мегакариоцитарной линии, такой как мыши с меченым CD41 YFP, о которых уже сообщалось в литературе13,либо во всех клетках, таких как мыши, где GFP связан с N-концем немышечного миозина II-A14, как показано на рисунке 2D.
Таким образом, этот эксплантный метод предоставляет как качественную, так и количественную информацию для лучшего понимания образования тромбоцитов в их естественной среде. Примечательно, что, хотя этот метод прост и быстр, он остается дополнением к исследованиям, выполненным с использованием классической жидкой культуры. Каждый из них приносит отдельные знания в соответствии с этапами пролиферации, созревания, расширения тромбоцитов и высвобождения тромбоцитов, которые человек хочет изучить. Например, там, где эксплант-метод дает информацию о способности расширения проплателетов мегакариоцитами, выросшими в физиологическом контексте, культура in vitro предоставляет информацию о важности микроокружения костного мозга, такого как влияние клеточной неугомонности7 или зависимости внеклеточного матрикса15. Таким образом, культуры мегакариоцитов in vitro позволяют модулировать параметры микросреды по жесткости и адгезивным белкам7,16. Пожалуйста, обратитесь к статье «Культура мегакариоцитов в трехмерном гидрогеле на основе метилцеллюлозы для улучшения созревания клеток и изучения влияния жесткости и удержания» J. Boscher et al., представленной в этом выпуске для получения дополнительной информации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Жана-Ива Ринкеля, Жюли Бошер, Патрисию Лоффер, Моник Фройнд, Кетти Кнез-Хипперт за техническую помощь. Эта работа была поддержана грантом ANR (Agence National de la Recherche) ANR-17-CE14-0001-01 и ANR-18-CE14-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 - 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
