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Bioengineering

Caractérisation rapide de parties génétiques avec des systèmes acellulaires

Published: August 30, 2021 doi: 10.3791/62816
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3,4, 2,4, 4, 2, 4, 4
1US Army Combat Capabilities Development Command Army Research Laboratory, 2Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 3Excet, Inc., 4US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center

Summary

Des parties génétiques bien caractérisées sont nécessaires à la conception de nouveaux circuits génétiques. Nous décrivons ici une méthode rentable et à haut débit pour caractériser rapidement des parties génétiques. Notre méthode réduit les coûts et le temps en combinant des lysats acellulaires, de l’ADN linéaire pour éviter le clonage et de la manipulation acoustique des liquides pour augmenter le débit et réduire les volumes de réaction.

Abstract

La caractérisation et le catalogage des parties génétiques sont essentiels à la conception de circuits génétiques utiles. Le fait d’avoir des pièces bien caractérisées permet d’affiner les circuits génétiques, de sorte que leur fonction entraîne des résultats prévisibles. Avec la croissance de la biologie synthétique en tant que domaine, il y a eu une explosion de circuits génétiques qui ont été mis en œuvre dans les microbes pour exécuter des fonctions relatives à la détection, à l’altération métabolique et à l’informatique cellulaire. Ici, nous montrons une méthode rapide et rentable pour caractériser les parties génétiques. Notre méthode utilise du lysat acellulaire, préparé en interne comme support pour évaluer les pièces via l’expression d’une protéine rapporteur. L’ADN modèle est préparé par amplification PCR à l’aide d’amorces peu coûteuses pour ajouter des parties variantes au gène rapporteur, et le modèle est ajouté à la réaction sous forme d’ADN linéaire sans clonage. Les pièces qui peuvent être ajoutées de cette manière comprennent les promoteurs, les opérateurs, les sites de liaison des ribosomes, les isolants et les terminateurs. Cette approche, combinée à l’incorporation d’un manipulateur de liquide acoustique et de plaques à 384 puits, permet à l’utilisateur d’effectuer des évaluations à haut débit de pièces génétiques en une seule journée. En comparaison, les approches de criblage cellulaire nécessitent un clonage long et des temps d’essai plus longs en raison des étapes de normalisation de la culture et de la densité de culture pendant la nuit. De plus, travailler dans un lysat acellulaire permet à l’utilisateur d’exercer un contrôle plus étroit sur les conditions d’expression grâce à l’ajout de composants exogènes et d’ADN à des concentrations précises. Les résultats obtenus grâce au dépistage acellulaire peuvent être utilisés directement dans des applications de systèmes acellulaires ou, dans certains cas, comme moyen de prédire la fonction dans des cellules entières.

Introduction

Un effort central de la biologie synthétique est de développer des kits d’outils génétiques contenant des parties bien caractérisées, qui peuvent être utilisées pour construire des circuits génétiques1 qui remplissent des fonctions utiles lorsqu’ils sont déployés dans des microbes ou des lysats acellulaires. Les domaines dans lesquels ces circuits génétiques ont gagné du terrain sont la détection 2,3,4, la performance humaine 5,6, les biocarburants 7,8, la production de matériaux 9,10 et l’informatique cellulaire 11. Des registres de parties génétiques normalisées ont été établis12 pour cataloguer les parties nouvelles et existantes en catégories telles que les promoteurs, les opérateurs, les séquences codantes et les terminateurs, pour n’en nommer que quelques-unes. Des efforts tels que le concours international iGEM (Genetically Engineered Machines)13 ont joué un rôle déterminant dans la caractérisation et le catalogage de ces parties génétiques. De nombreuses méthodes ont été développées pour faciliter l’assemblage rapide de ces pièces en circuits génétiques utiles14,15. Des logiciels ont même été développés pour automatiser la composition de pièces bien caractérisées en circuits qui atteignent une fonction souhaitée16. Cependant, l’assemblage de circuits génétiques utiles avec des fonctions prévisibles repose sur la présomption que les trousses d’outils génétiques contiennent des parties génétiques bien caractérisées. En raison de la nécessité de ces trousses d’outils pour l’avancement de la biologie synthétique, de nombreux efforts pour mieux cataloguer les circuits et les pièces avec des données de caractérisation appropriées ont été décrits 17,18,19,20,21.

Une approche de caractérisation des composants génétiques utilise des systèmes de synthèse de protéines acellulaires (CFPS), qui reconstituent des fonctions cellulaires telles que la transcription et la traduction ex vivo22. Plusieurs études ont démontré le potentiel du CFPS pour le prototypage de composants génétiques 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 que ce soit pour des applications directes dans des systèmes acellulaires ou pour prédire la fonction des constructions génétiques dans les cellules, telles que l’activité relative des parties d’une bibliothèque 29 , optimisation des voies métaboliques27 et charge cellulaire30. Les avantages du prototypage dans CFPS par rapport aux cellules mis en évidence par ces études comprennent l’évitement du clonage fastidieux, un contrôle précis de la concentration de l’ADN et d’autres composants de la réaction, et la capacité de mélanger et de faire correspondre facilement plusieurs constructions d’ADN. L’avantage d’éviter le clonage est particulièrement évident lors de l’utilisation de modèles d’ADN linéaires, qui permettent d’assembler de nouvelles constructions par des méthodes in vitro qui prennent des heures au lieu des jours33. La possibilité de manipuler la concentration de constructions d’ADN et d’autres composants simplement par pipetage rend l’approche encore plus attrayante en permettant une expérimentation à haut débit alimentée par des robots de manipulation de liquides34,35. Bien que des succès dans l’utilisation du CFPS pour le prototypage aient été signalés, il est important de noter qu’il reste à voir dans quels contextes les résultats du CFPS peuvent prédire de manière fiable la fonctionnalité dans les cellules.

Ici, nous présentons une méthode de prototypage CFPS qui met l’accent sur les avantages en termes de vitesse, de débit et de coût par rapport aux approches traditionnelles basées sur les cellules. L’approche est dérivée de nos travaux antérieurs où nous avons utilisé CFPS pour caractériser rapidement une bibliothèque de variantes du promoteur T7 régulées par le facteur de transcription TetR32, élargissant considérablement la petite poignée de variantes de promoteurs T7 réglementées qui étaient disponibles dans la littérature à l’époque36,37. D’autres ont, depuis lors, encore élargi l’éventail de ces promoteurs38. Dans notre méthode, l’assemblage de la construction génétique est accéléré en utilisant la PCR pour amplifier l’ADN modèle via des amorces qui ajoutent des parties génétiques variantes à un gène rapporteur. La manipulation acoustique des liquides dans les plaques à 384 puits est utilisée pour augmenter le débit et diminuer le volume de matériaux requis. Des travaux antérieurs ont démontré l’utilisation réussie de la manipulation acoustique des liquides à des volumes significativement inférieurs39,40 avec une variabilité comparable au pipetage manuel de volumes plus importants 41. En plus de la méthode, nous fournissons des informations de dépannage et une évaluation des économies potentielles de temps et de coûts. Notez que bien que nous incluions ici un protocole pour la production de lysats sans cellules basé sur Sun et al.42, de nombreux autres kits et protocoles commerciaux43,44 devraient également fonctionner. De même, alors que nous démontrons la méthode de caractérisation des variantes promotrices32, d’autres parties peuvent être interchangées par amplification PCR, telles que les riborégulateurs, les sites de liaison des ribosomes (RBS), les isolants, les marqueurs de protéines et les terminateurs. Nous espérons que cette méthodologie pourra aider la communauté de la biologie synthétique à continuer d’augmenter le nombre de pièces caractérisées pour l’assemblage de circuits génétiques prévisibles avec une fonction utile.

Protocol

1. Préparation de l’extrait cellulaire

  1. Préparation des médias
    1. Pour les milieux 2xYT : Ajouter 16 g de tryptone, 10 g d’extrait de levure et 5 g de NaCl à 900 mL d’eau désionisée et ajuster le pH à 7,0 avec 5 M de NaOH. Augmenter le volume de la solution à 1 L à l’aide d’eau désionisée et stériliser en autoclave ou en filtre. Vous pouvez également acheter un support 2xYT.
    2. Pour le tampon S30B : Préparer une solution de 14 mM de Mg-glutamate, 60 mM de K-glutamate et 5 mM de Tris dans 2 L d’eau désionisée. Utiliser 2 M Tris pour ajuster le pH à 8,2, autoclaver et conserver à 4 °C. Compléter la solution en ajoutant du dithiothréitol (DTT) à une concentration finale de 1 mM juste avant utilisation.
  2. Préparation des cellules
    1. Streak Escherichia coli BL21(DE3) Rosetta2 cellules ou autre lignée cellulaire de choix (voir Cole et coll.44 pour une étude complète récente) sur une plaque de gélose LB (bouillon de lysogénie) et incuber à 37 °C pendant 10-14 h.
    2. Utilisez une seule colonie d’E. coli pour inoculer 3 mL de milieu 2xYT dans un tube de culture de 10 mL. Incuber ce tube à 37 °C en agitant à 250 tr/min pendant 8 h.
    3. Utiliser 50 μL de la culture de 3 mL pour inoculer 50 mL de milieu 2xYT dans une fiole de 500 mL. Incuber cette fiole à 37 °C en agitant à 250 tr/min pendant 8 h.
    4. Utilisez 7,5 mL de la culture de 50 mL pour inoculer chacun des quatre flacons déflecteurs de 4 L contenant 0,75 L de milieu 2xYT. Incuber ces flacons à 37 °C en les agitant à 220 tr/min jusqu’à ce qu’ils aient atteint une densité optique à 600 nm de 2 à 4, après environ 3-4 h.
    5. Récolter les cellules de chaque fiole en les transférant dans des récipients de 1 L et en les centrifugeant à 5 000 x g pendant 12 min à 4 °C. Jeter le surnageant en le décantant dans un conteneur à déchets.
    6. Laver chaque pastille de cellule avec 150 ml de tampon S30B glacé en les remettant complètement en suspension à l’aide d’une pipette pour perturber la masse cellulaire, puis recueillir à nouveau les cellules par centrifugation à 5 000 x g pendant 12 min. Jetez le surnageant.
    7. Lavez à nouveau chaque pastille de cellule dans 40 ml de tampon S30B glacé en les remettant complètement en suspension et en perturbant la masse cellulaire à l’aide d’une pipette. Transférer les cellules dans des tubes coniques prépesés de 50 mL et recueillir à nouveau les cellules par centrifugation à 2 000 x g pendant 8 min à 4 °C. Jeter le surnageant par décantation.
    8. Peser les granulés de cellules humides. Congeler les pastilles cellulaires en plaçant les tubes directement dans de l’azote liquide et les stocker à -80 °C.
  3. Lyse cellulaire
    1. Décongeler les granules de la cellule sur de la glace.
    2. Resuspendre chaque pastille de cellule dans 1,4 mL de tampon S30B par 1 g de pastille de cellule par vortex.
    3. Lyser les cellules par cellule de pression française à 640 psi à 4 °C. Recueillir le lysat dans des tubes microcentrifugés sur de la glace et ajouter 3 μL de DTT 1 M par 1 mL de lysat immédiatement après la lyse.
      REMARQUE: Il est préférable de tapoter la vanne de libération de presse française avec une petite tige métallique pour maintenir une pression uniforme et éviter les chutes soudaines de pression.
    4. Éliminer le lysat par centrifugation à 30 000 x g pendant 30 min à 4 °C et jeter la pastille après avoir pipeté le surnageant dans un nouveau tube à microcentrifugeuses glacé, en prenant soin de ne pas perturber la pastille.
    5. Centrifuger le surnageant une seconde fois à 30 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Pipeter le surnageant résultant dans un tube à microcentrifuger glacé. Jetez la pastille.
    6. Incuber le surnageant dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 h.
    7. Éliminer le surnageant par centrifugation à 15 000 x g pendant 15 min à 4 °C et transférer le surnageant résultant dans un tube à microcentrifugation glacé, en prenant soin de ne pas perturber la pastille.
    8. Centrifuger le surnageant une seconde fois à 15 000 x g pendant 15 min à 4 °C et transférer le surnageant obtenu dans un tube à microcentrifuger glacé, en prenant soin de ne pas perturber les pastilles restantes.
    9. Répartir le surnageant dans des aliquotes de 100 μL dans des tubes microcentrifugés de 1,5 mL et les congeler en les plaçant directement dans de l’azote liquide. Conserver le surnageant à -80 °C.

2. Préparation linéaire du modèle

  1. Conception de l’apprêt
    1. Choisissez une séquence de base comme modèle PCR. Inclure au minimum une séquence rapporteure, telle que sfGFP (superfolder Green Fluorescent Protein), LacZ ou Spinach aptamer. Incluez d’autres pièces qui seront fixées sur les variantes filtrées, telles que les terminaisons, les promoteurs ou les RBS, selon les besoins de la conception.
      REMARQUE: L’inclusion d’un terminateur n’est pas toujours nécessaire pour l’expression de l’ADN linéaire dans les systèmes acellulaires.
    2. Pour les amorces avant, choisissez un minimum de 20 pb correspondant à l’extrémité 5' de la séquence de base comme extrémité 3' de l’amorce. Si vous ajoutez des parties à l’extrémité 5' de la construction, concevez le reste de l’extrémité 5' de l’amorce pour ajouter les parties génétiques d’intérêt à la séquence centrale par amplification PCR (Figure 1A et Figure 2).
      REMARQUE: Étant donné que les amorces supérieures à ~ 60 pb augmentent souvent considérablement en coût, plusieurs amorces qui se chevauchent peuvent être conçues pour ajouter des séquences plus longues ou plusieurs parties. Bien que plusieurs amorces puissent être utilisées dans une seule réaction de PCR, il est recommandé d’effectuer plusieurs cycles de PCR.
    3. Pour les amorces inversées, choisissez un minimum de 20 pb pour faire correspondre l’extrémité 3' de la séquence de base à l’extrémité 3' de l’amorce. Si vous ajoutez des parties à l’extrémité 3' de la construction, concevez le reste de l’extrémité 5' de l’amorce pour ajouter les parties génétiques d’intérêt à la séquence centrale par amplification PCR (Figure 1A et Figure 2). S’assurer que la température de recuit de l’amorce inversée se situe à moins de 5 °C de la température de recuit de l’ensemble de l’amorce avant.
  2. Amplification linéaire du gabarit
    1. Déterminer le nombre de réactions de PCR à effectuer en fonction du nombre de séquences de carottes et calculer la quantité de chaque composant requis à l’aide du tableau 1.
    2. Préparer le mélange principal conformément au tableau 1 et le conserver sur de la glace. Aliquote 30 ou 40 μL (voir le tableau 1) du mélange maître dans le nombre déterminé de tubes de PCR et ajouter 10 μL de chaque amorce variable (c.-à-d. amorces codant pour un changement de pièce, voir le tableau 1) à 5 μM aux tubes de PCR étiquetés de manière appropriée.
    3. Placez les tubes PCR dans le thermocycleur et exécutez le programme PCR suivant: 98 °C pendant 3 min; 30 cycles de 98 °C pendant 15 s, XX °C pendant 20 s, 72 °C pendant YY min; extension finale à 72 °C pendant 10 min. Ensuite, maintenez la réaction à 4 °C.
      Où XX représente la température de recuit de l’apprêt avec la température de recuit inférieure et YY représente le temps d’extension calculé pour la longueur de l’amplicon sur la base des recommandations du fabricant pour la polymérase haute fidélité utilisée. Optimisez ces conditions au besoin pour différents apprêts et/ou modèles.
    4. (Facultatif) Ajouter 1 μL d’enzyme de restriction DpnI pour digérer le modèle original. Incuber la réaction à 37 °C pendant 1 h. Effectuez cette étape uniquement si le modèle d’origine est de l’ADN plasmidique.
    5. Analyser 5 μL de chaque produit PCR par électrophorèse sur gel. Séparer le produit à l’aide d’un gel d’agarose à 1 % à 180 V pendant 20 min. Vérifiez la taille de bande correcte, qui variera en fonction de la séquence de noyau choisie et de la longueur des pièces ajoutées.
  3. Purifiez le gabarit linéaire à l’aide d’un kit de purification PCR commercial ou par la méthode de nettoyage PCR préférée. Si plusieurs bandes étaient présentes par électrophorèse sur gel, optimiser les conditions de PCR ou purifier les bandes de poids moléculaire correctes à l’aide d’un kit d’extraction de gel commercial conformément aux recommandations du fabricant.
  4. Quantifier chaque modèle d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Évaluer la qualité du modèle d’ADN en vérifiant que le rapport 260 nm/280 nm est d’environ 1,8.
  5. (Facultatif) Encore une fois, séparez une partie de la matrice d’ADN à l’aide d’un gel d’agarose à 1 % à 180 V pendant 20 minutes et assurez-vous que toutes les bandes indésirables ont été éliminées pendant la purification du gabarit.
  6. Utilisez immédiatement des modèles d’ADN purifiés ou conservez-les à -20 °C.

3. Préparation de protéines purifiées

  1. Expression des protéines
    1. Pour chaque protéine à exprimer, assembler une construction d’expression appropriée. Codon-optimiser le gène pour l’expression dans E. coli. Insérez le gène dans un vecteur d’expression pET-22b ou un autre vecteur d’expression approprié via la méthode d’assemblage plasmidique préférée. Transformer le plasmide d’expression en cellules d’expression BL21(DE3) Rosetta2 ou en une autre lignée cellulaire appropriée.
    2. Pour chaque protéine, utiliser une seule colonie pour inoculer 3 mL de milieu LB dans un tube de culture de 10 mL. Incuber ces tubes à 37 °C et agiter à 250 tr/min pendant une nuit.
    3. Inoculer une fiole de 2 L contenant 750 mL de milieu LB avec 1 mL de culture de nuit. Incuber ces flacons à 37 °C en agitant à 250 tr/min jusqu’à ce qu’ils atteignent un OD600 de 0,6-1,0.
    4. Induire l’expression des protéines en ajoutant 0,75 mL de 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) dans de l’eau dans chaque fiole et continuer à incuber ces fioles à 37 °C en agitant à 250 rpm pendant 4 h.
    5. Récolter les cellules de chaque fiole à l’aide d’un flacon centrifugeuse de 1 L, par centrifugation à 5 000 x g pendant 12 min. Jetez le surnageant.
    6. Transférer les pastilles dans un tube conique de 50 ml et peser chaque pastille. Congeler les cellules dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C ou passer à l’étape 3.2.
      REMARQUE : Cette étape devrait entraîner une concentration de 2 à 5 g de cellules par 0,75 mL.
  2. Purification des protéines par chromatographie sur colonne d’affinité nickel
    1. Préparer le tampon de lyse en combinant 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl et 5 mM imidazole. Ajuster à pH 8,0.
    2. Préparer le tampon de lavage en combinant 50 mM de Tris-Cl, 500 mM de NaCl et 25 mM d’imidazole. Ajuster à pH 8,0.
    3. Préparer le tampon d’élution en combinant 50 mM de Tris-Cl, 500 mM de NaCl et 250 mM d’imidazole. Ajuster à pH 8,0.
    4. Préparez le tampon de dialyse en combinant 50 mM NaHPO4, 100 mM NaCl et 2% de DMSO. Ajuster à pH 7,5.
    5. Décongeler les granulés de cellules en plaçant les tubes dans de l’eau à température ambiante. Ajouter 5 mL du tampon de lyse par 1 g de la pastille cellulaire et remettre en suspension par vortex.
    6. Lyser les cellules par sonication. Séparer l’homogénat cellulaire de manière à ce qu’il n’y ait pas plus de 30 mL par tube conique de 50 mL et garder chaque tube sur de la glace. Lyser les cellules à l’aide d’un sonicateur avec une sonde de 0,16 cm de diamètre en 15 tours avec des pauses de 30 s, 10 fois.
      REMARQUE: Évitez de mousser, car cela dénature la protéine. La formation de mousse peut être évitée en gardant la pointe du sonicateur immergée au moins aux 2/3 dans le lysat pendant qu’il est opérationnel. D’autres méthodes de lyse cellulaire en plus de la sonication sont également possibles44.
    7. Éliminer le lysat par centrifugation à 15 000 x g pendant 30 min à 4 °C et placer le surnageant dans un nouveau tube conique de 50 mL.
    8. Ajouter 1 mL de résine d’acide nickel-nitrilotriacétique (Ni-NTA) pour chaque 5 mL de surnageant. Diviser le lysat cellulaire/suspension de Ni-NTA de manière à ce qu’il n’y ait pas plus de 36 mL par tube conique de 50 mL. Incuber à 4 °C sur un rotateur tubulaire à 10 rpm pendant 1 h.
    9. Charger la résine en décantant le lysat cellulaire / suspension Ni-NTA dans une colonne de chromatographie volumique sur lit de 2 mL et recueillir l’éluant si nécessaire pour une analyse plus approfondie, sinon, jeter. Lavez la résine avec 10 volumes de lit de résine de tampon de lavage.
    10. Recueillir la protéine en ajoutant trois volumes de tampon d’élution sur le lit de résine à la colonne et concentrer le volume à 1,5 mL à l’aide d’un concentrateur centrifuge avec la membrane de coupure de poids moléculaire appropriée pour chaque protéine.
    11. Dialyser la protéine contre 2 L de tampon de dialyse à 4 °C pendant 1 h. Dialyser à nouveau la protéine contre 2 L de tampon de dialyse pendant une nuit à 4 °C.
    12. Quantifier la protéine en utilisant son coefficient d’extinction molaire et son absorbance à 280 nm. Analyser la pureté de la protéine en la séparant à l’aide de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE). Conserver la protéine à -80 °C.

4. Synthèse protéique acellulaire

  1. Préparation du mélange réactionnel CFPS
    1. Préparer le mélange de suppléments en suivant les étapes de préparation de la solution d’acides aminés, de préparation de la solution énergétique et de préparation tampon dans Sun et coll.42. Conserver séparément ou combiné à -80 °C en aliquotes. S’assurer que les concentrations finales correspondent à celles décrites dans Sun et coll.42 dans la section Exécution expérimentale d’une réaction TX-TL.
    2. Préparez un additif pour protéger l’ADN linéaire de la dégradation. Si vous utilisez GamS33,45, préparez-vous via les étapes de la section 3 ci-dessus, ou procurez-vous auprès d’un vendeur commercial; Pour d’autres approches, consultez la littérature correspondante46,47,48. Vous pouvez également utiliser un système CFPS qui ne nécessite pas d’additifs49.
    3. Préparez la polymérase T7, les protéines répressrices et d’autres additifs en suivant les étapes de la section 3 ci-dessus ou procurez-vous auprès d’un fournisseur commercial.
    4. Déterminer le nombre de réactions CFPS à effectuer et calculer la quantité de chaque composant requis à l’aide du tableau 2. Modifier les concentrations des composants, y compris ajouter ou retirer des composants au besoin, et ajuster la quantité d’eau de sorte que le volume final de chaque mélange réactionnel soit toujours de 10 μL. De même, modifier le mélange-maître pour faciliter la distribution d’autres composants par manipulation acoustique du liquide au gré (voir la section Discussion ).
    5. Décongeler tous les composants sur la glace et préparer un mélange maître en mélangeant chaque composant comme calculé ci-dessus. Bien mélanger tous les composants à l’aide d’une pipette. Portez une attention particulière pour éviter les précipitations, en particulier pour le mélange d’acides aminés. Conserver le mélange principal sur la glace.
    6. Refroidir une plaque de 384 puits sur de la glace et répartir le mélange principal en aliquotes de 9 μL dans chaque puits.
      REMARQUE: Il est possible de distribuer ces composants par manipulation acoustique de liquide, mais il faut prendre soin d’assurer une distribution correcte (voir la section Discussion pour le dépannage).
  2. Distribution de composants supplémentaires par manipulation acoustique des liquides
    1. Calculer la quantité de protéine répressive (et d’autres composants facultatifs) requise pour toutes les réactions CFPS.
    2. Décongeler la protéine répressrice sur la glace et la répartir dans une plaque source acoustique de manipulation de liquide ou une autre plaque appropriée. S’assurer que la quantité appropriée de volume mort requise pour le type de plaque source utilisée est incluse.
    3. Répartir la protéine répressrice dans des volumes de 1 μL dans les puits appropriés via le manipulateur de liquide. Pour plus d’informations sur le dépannage de la distribution, consultez la section Discussion .
  3. Courbes standard
    1. Inclure une dilution en série du rapporteur purifié (voir rubrique 3 pour la purification des protéines)41 ou l’étalon chimique approprié50 sur la plaque pour permettre la comparaison des résultats avec d’autres études et d’autres laboratoires. Choisissez une plage de concentrations appropriée pour le rapporteur utilisé et la plage d’expression attendue des expériences.
  4. Réactions en cours d’exécution du CFPS
    1. Préchauffez le lecteur de plaques à 30 °C. Réglez le lecteur de plaques pour qu’il lise aux réglages appropriés pour le rapporteur utilisé dans la séquence de base sans trembler les étapes.
      REMARQUE: Alors que 30 ° C est utilisé ici, 29 ° C et 37 ° C sont également couramment utilisés et fonctionnent bien avec ce protocole. D’autres températures peuvent être préférées pour d’autres préparations de réaction acellulaires. Pour les intervalles de lecture, 10 minutes suffisent pour obtenir une bonne résolution pour les données représentatives présentées ici; cependant, d’autres résolutions peuvent être meilleures en fonction de la protéine rapporteur et de la recette particulière du CFPS.
    2. (Facultatif) Exécutez d’abord une réaction d’essai pour régler le réglage de gain ou de sensibilité approprié pour capturer le changement de fluorescence sans débordement de signal.
    3. Scellez la plaque de 384 puits avec un couvercle étanche en plastique imperméable pour éviter l’évaporation. Si possible, sur l’instrument, réglez un gradient vertical de température de 1 °C pour limiter la condensation sur le joint. Placez la plaque de 384 puits sur le support de plaque et commencez la lecture.

Representative Results

Pour démontrer l’utilité de nos méthodes, nous présentons des résultats qui décrivent les effets de la proximité de la séquence tetO au promoteur T7 sur la régulation de l’expression pilotée par l’ARN T7. Les résultats complets et leurs implications peuvent être trouvés dans les travaux de McManus et al.32. Le flux de travail est décrit à la figure 1. Quinze gabarits linéaires, variant uniquement par la distance du promoteur T7 par rapport à la séquence tetO , ont été préparés par PCR amplifiant le rapporteur sfGFP avec des amorces conçues pour ajouter chaque variante du promoteur (Figure 2) comme décrit dans la section 2 du protocole. Les composants de réaction et les réactions du CFPS ont été préparés conformément au protocole. L’expression du sfGFP a été mesurée à partir de chaque matrice avec un titrage de 12 concentrations différentes de la protéine TetR, en triplicate, à l’aide d’un manipulateur de liquide acoustique. À 36 réactions CFPS par gabarit et 15 gabarits, un total de 540 réactions pour l’ensemble des combinaisons T7-tetO ont été effectuées. L’ensemble de l’évaluation a été effectué sur deux plaques dans deux lecteurs de plaques. L’analyse de ces données a montré que l’ARNP T7 régule à la baisse l’expression induite par T7 de manière égale jusqu’à 13 pb en aval à partir du début du transcrit T7 (Figure 3). Ce résultat a des implications pour la conception future de circuits génétiques régulatables pilotés par T7 en décrivant une fenêtre putative pour une répression efficace de T7 par d’autres répresseurs. La comparaison des résultats du protocole décrit ici avec l’ADN préparé par clonage traditionnel a révélé une différence faible mais statistiquement significative dans le degré de répression du TetR entre les formats. Nous avons émis l’hypothèse que la liaison non spécifique de TetR à l’ADN vecteur pourrait expliquer la différence observée. Les résultats expérimentaux ont montré que l’ajout d’ADN vectoriel linéaire aux réactions avec l’ADN modèle linéaire réduisait la différence à une signification non statistique, bien que cela n’exclue pas les contributions d’autres facteurs, tels que les différences de périodicité de l’hélice d’ADN pour les formats linéaires et circulaires, qui, à leur tour, pourraient affecter la liaison TetR. Selon l’application, l’utilisation d’un gabarit linéaire peut nécessiter une validation supplémentaire.

Nous incluons en outre des données représentatives sur les problèmes potentiels liés à la distribution précise à l’aide de la manipulation acoustique des liquides (Figure 4). Une solution de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4 contenant 0,25 mM de colorant tartrazine a été utilisée pour évaluer deux méthodes de programmation d’un manipulateur de liquide acoustique pour distribuer des volumes >1 μL. Après distribution de liquide, la plaque de destination a été scellée et centrifugée à 1 500 x g pendant 1 min, et l’absorbance à 425 nm mesurée avec un lecteur de plaques. Des résultats représentatifs de neuf expériences sont présentés et démontrent une distribution plus cohérente dans la série de huit puits de destination lorsque le transfert de 5 μL est divisé en distributions distinctes de 1 μL. Sur la base de ces observations, il est recommandé de décomposer les transferts >1 μL en transferts multiples de ≤1 μL. Consultez la section Discussion pour plus de détails sur le dépannage de cet aspect important du protocole.

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail d’une journée pour l’évaluation des parties promotrices dans l’extrait acellulaire. (A) Un rapporteur est amplifié par PCR à l’aide d’amorces contenant des parties génétiques à évaluer (2-5 h). (B) Le mélange réactionnel sans cellule est préparé comme indiqué dans le protocole et distribué dans une plaque de 384 puits avec les gabarits amplifiés par PCR (30 min). (C) La manipulation acoustique des liquides est utilisée pour distribuer des composants supplémentaires, qui peuvent inclure des protéines répressives, des molécules effectrices et tout autre effecteur conditionnel (10 min). (D) L’expression de la protéine rapporteur de chaque réaction est mesurée dans un lecteur de plaque (2-16 h, selon la recette et la construction du CFPS). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Conception de l’amorce pour l’ajout de parties génétiques à un gène rapporteur par amplification PCR. (A) Le gène rapporteur sfGFP (vert) sera amplifié pour ajouter un RBS (rouge) et un promoteur T7 (bleu) par PCR. (B) Le sfGFP (vert) et un RBS (rouge) seront amplifiés pour ajouter une séquence tetO (or) et un promoteur T7 (bleu) par PCR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Effet de la position tetO sur la régulation d’une expression pilotée par T7. Valeurs de répression maximales normalisées pour les gabarits linéaires et circulaires en fonction de la position tetO. Les traces représentent la moyenne et les écarts-types pour trois répétitions. Ce chiffre a été modifié à partir de McManus et al.32 sous une licence Creative Commons CC-BY. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Utilisation d’un colorant tartrazine pour valider la distribution de liquide avec un manipulateur de liquide acoustique. Les barres noires indiquent la distribution de 5 μL de solution de tartrazine à partir d’une seule source dans chacun des huit puits de destination consécutifs d’une plaque de 384 puits à l’aide d’une seule commande de programmation. Les barres grises indiquent la distribution de 1 μL d’une seule source dans chacun des huit puits de destination consécutifs à l’aide d’une seule commande de programmation, puis la répétition de cette étape quatre fois pour un total de 5 μL distribués dans chaque puits de destination. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nom du composant Volume pour 1 réaction (μL) Volume pour 110% de X nombre de réactions (μL)
Prémélange PCR Q5 25
Eau 4
Gabarit (1–3 ng/μL) 1
(si fixe1) Amorce avant (5 μM) 0 ou 10
(si fixe1) Amorce inversée (5 μM) 0 ou 10
Total du Master Mix : 30 ou 40
(si variable1) Amorce avant (5 μM) 0 ou 10
(si variable1) Amorce inversée (5 μM) 0 ou 10

Tableau 1 : Feuille de travail pour la préparation des réactifs pour les réactions de PCR. Les valeurs de la colonne la plus à droite peuvent être renseignées par les utilisateurs en fonction du nombre de réactions prévu. 1 Les amorces variables contiennent une partie spécifique à ajouter dans la réaction PCR et peuvent être l’amorce directe, l’amorce inverse ou les deux. Les amorces fixes n’ajoutent pas de pièce et peuvent être l’amorce avant ou l’amorce inverse, mais pas les deux.

Nom du composant Volume pour 1 réaction (μL) Volume pour 110% de X nombre de réactions (μL)
Extrait cellulaire 4.2
Mélange de suppléments 3.3
Protéine GamS (207 μM) 0.15
ADN modèle (20 nM) 1
T7 Polymérase (13 mg/mL) 0.12
Eau 0,73 (ce nombre peut varier)
Total du Master Mix : 9
Protéine répressive: 1

Tableau 2 : Feuille de travail pour la préparation des réactifs pour les réactions CFPS. Les valeurs de la colonne la plus à droite peuvent être renseignées par les utilisateurs en fonction du nombre de réactions prévu.

Tableau supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Les protocoles décrits ici fournissent un moyen rentable et rapide de cribler des parties génétiques via l’expression d’une protéine rapporteur par CFPS. Des parties génétiques bien caractérisées sont cruciales pour la conception de circuits génétiques prévisibles avec une fonction utile. Cette méthodologie augmente le débit et réduit le temps nécessaire pour cribler de nouvelles parties génétiques en supprimant la nécessité de travailler dans les cellules vivantes, tout en conservant la fonctionnalité qui reflète l’environnement cellulaire en conservant le processus métabolique d’expression des protéines dans le lysat cellulaire. Notre protocole peut être effectué en 1 jour après réception des amorces (~2,5-6 h pour la préparation de la réaction, 2-16 h pour la réaction CFPS; Figure 1), contre au moins 3 jours pour le clonage traditionnel (1 jour pour l’assemblage et la transformation de la construction, la vérification de la séquence des clones et la culture des cellules pour l’évaluation). Nous estimons en outre que le coût par construction utilisant l’ADN linéaire est d’environ un tiers du clonage traditionnel (78 $ contre 237 $; Tableau supplémentaire 1) méthode. Les services de synthèse commerciale offrent actuellement un minimum de 4 jours ouvrables selon la taille, bien qu’ils auraient des coûts similaires à ceux de notre méthode si les fragments linéaires sont criblés directement dans CFPS (78 $ contre 91 $); Nous n’avons pas vérifié cette approche. Le coût d’évaluation d’une pièce avec CFPS est faible par rapport à la génération de l’ADN modèle (0,05 $ / réaction22 contre 78 $ par modèle), bien qu’il faille noter que les coûts de démarrage des réactifs en vrac et de l’équipement de lyse sont d’au moins plusieurs milliers de dollars. L’utilisation d’un manipulateur de liquide acoustique n’améliore que marginalement les coûts en permettant de réduire les volumes jusqu’à 0,5 μL40; L’avantage le plus significatif est la réduction du temps de préparation des réactions (~10 min vs jusqu’à 1 h, selon le nombre de réactions), en particulier lorsque la préparation d’un grand nombre de réactions soulève des préoccupations quant à la réaction préparée en restant assis pendant de longues périodes avant l’incubation.

Bien que rapide et rentable, les limites quant au moment où le prototypage CFPS prédit adéquatement la fonction in vivo restent à voir. Par exemple, toute réactivité croisée avec l’ADN génomique ne sera pas détectée en raison de l’ablation du génome de l’hôte pendant la production du système CFPS. En outre, les concentrations de composants peuvent être inférieures de 1 à 2 ordres de grandeur dans CFPS que dans les cellules51, ce qui est susceptible d’affecter le comportement de certaines parties en raison de différentes conditions d’encombrement macromoléculaire. En outre, la capacité de l’ADN linéaire à prédire la fonction in vivo peut être limitée, par exemple, lorsque la structure secondaire de l’ADN joue un rôle important. Une dernière limitation est que les constructions ne sont pas vérifiées avant de tester les fonctions. Il peut y avoir des cas où la partie caractérisée n’est pas réellement alignée avec la séquence théorique prévue. Toutes ces limitations peuvent être atténuées en validant un sous-ensemble des pièces criblées par cette méthode dans l’application in vivo prévue.

Nous avons initialement développé cette méthodologie pour étudier les effets du changement de position de l’opérateur sur les promoteurs hybrides T7-tetO 32. Nous avons présenté les protocoles ici dans un format plus générique, de sorte qu’ils puissent être appliqués aux promoteurs, aux opérateurs, aux séquences de liaison aux ribosomes, aux isolants et aux terminateurs. Ces parties génétiques peuvent être ajoutées à l’extrémité 5' ou 3' du gène rapporteur par PCR à l’aide d’amorces pour chaque conception, évitant ainsi la nécessité de synthétiser ou de cloner chaque variante à tester. Les produits PCR résultants servent d’ADN modèle pour l’évaluation via l’expression d’une protéine rapporteure. Dans notre travail, le protocole de purification d’affinité fourni ici a été utilisé pour TetR et GamS. La même procédure peut être utilisée pour l’expression et la purification d’autres répresseurs, activateurs, polymérases, facteurs sigma et autres protéines apparentées à une partie génétique d’intérêt, bien que des modifications puissent être nécessaires pour la protéine désirée exprimée. La purification et le titrage de ces protéines dans les réactions CFPS permettent une caractérisation plus détaillée d’une partie génétique particulière. Enfin, il existe de nombreux protocoles alternatifs CFPS et chacun devrait se prêter à la partie de la méthodologie consacrée à l’examen préalable des parties. À titre d’exemple, nous n’incluons pas d’étape de dialyse dans ce protocole, que d’autres ont jugée importante pour l’expression des promoteurs bactériens natifs22. Il est également possible de faire varier les concentrations des composants constitutifs sous-jacents du CFPS. L’utilisation de la manipulation de liquides améliore la capacité de tester la myriade de conditions en augmentant le débit et en diminuant les matériaux requis34,35.

Un domaine qui peut nécessiter un dépannage important est l’optimisation du manipulateur de liquide acoustique. La distribution acoustique du liquide doit être optimisée pour chaque composant transféré et il est fortement recommandé d’exécuter des contrôles pour vérifier la distribution et la reproductibilité appropriées avant de collecter des données. Le type de plaque source et le réglage de la classe de liquide idéal dépendront du liquide spécifique à distribuer et de ses composants. Il n’est pas recommandé d’utiliser des plaques enrobées d’amine pour distribuer l’ADN, car le revêtement d’amine peut interagir avec l’ADN. Il convient également de noter que la capacité de distribuer des concentrations plus élevées de certains composants peut dépendre du modèle acoustique de manutention de liquides. Un transfert de liquide d’essai peut être effectué en le distribuant sur un joint de plaque de papier d’aluminium pour visualiser la formation réussie de gouttelettes; Cependant, ce test fournit des informations limitées et les gouttelettes de différents paramètres peuvent sembler identiques. L’utilisation d’un colorant soluble dans l’eau, comme la tartrazine, peut être utilisée pour vérifier avec plus de précision que le volume correct est supprimé avec un réglage ou un flux de travail donné (voir Résultats représentatifs). La programmation optimale des transferts de liquides peut également influer sur l’exactitude et la cohérence des données générées; pour les transferts de >1 μL d’un puits source à un puits de destination, nous avons constaté que les transferts séquentiels de ≤1 μL devraient être programmés pour réduire la variabilité systématique du puits au puits (figure 4). Enfin, les volumes morts théoriques et réels des puits sources peuvent varier considérablement en fonction du type de plaque source, du réglage de la classe de liquide et des composants du liquide spécifique; L’utilisation de la fonction d’étude acoustique du manipulateur de liquides pour évaluer les volumes de puits avant d’exécuter un programme peut aider à évaluer la précision avec laquelle l’instrument est capable de mesurer un liquide particulier.

Les performances de réaction CFPS peuvent varier lorsque l’on compare les résultats entre différents utilisateurs, lots de matériaux, lecteurs de plaques et laboratoires41. Pour les cas où de telles comparaisons sont nécessaires lors du prototypage de circuits génétiques, nous recommandons d’inclure des réactions de contrôle interne avec des promoteurs constitutifs standard dans chaque plaque de réaction pour aider à normaliser les résultats dans les configurations expérimentales. La méthode de préparation de l’ADN peut également contribuer de manière majeure à l’activité du CFPS; L’inclusion d’une étape de précipitation de l’éthanol est recommandée. De plus, la composition réactionnelle optimale peut varier selon le lot d’extrait34. Il a été démontré que les concentrations optimales de glutamate de magnésium et de glutamate de potassium, en particulier, varient selon le lot42 ou avec la protéine promotrice ou rapporteur utilisée24. Les concentrations de ces composants doivent être optimisées par criblage à travers plusieurs concentrations de chaque composant par construction génétique et par préparation d’extrait cellulaire afin de déterminer les conditions optimales pour l’expression des protéines. Enfin, les meilleures pratiques pour une performance constante de la réaction CFPS comprennent un mélange minutieux, un pipetage minutieux et une uniformité dans la préparation de chaque composant du réactif.

Au-delà de la caractérisation de pièces individuelles, la même méthode peut être utilisée pour cribler des combinaisons de pièces qui forment des circuits complexes, tels que les circuits logiques16 ou les oscillateurs52,53. Cette méthode peut également être appliquée au criblage et à l’optimisation des biocapteurs pour des applications dans le diagnostic épidémiologique 54,55,56,57 ou la détection et la quantification des dangers 3,58,59. L’application de techniques basées sur l’IA telles que l’apprentissage actif34 peut également être associée à la nature à haut débit de cette méthode pour conduire une exploration rapide des espaces de conception biologique complexes. En fin de compte, nous envisageons cette approche pour soutenir les temps de développement accélérés pour de nouveaux modèles génétiques en biologie synthétique.

Disclosures

RMM détient une participation financière dans Tierra Biosciences, une société privée qui utilise des technologies acellulaires telles que celles décrites dans cet article pour l’expression et le criblage des protéines.

Les autres auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été rendu possible grâce au programme de recherche appliquée pour l’avancement des priorités scientifiques et technologiques du Bureau du secrétaire à la Défense. Nous remercions Scott Walper (Naval Research Laboratory) pour avoir fourni le stock de sfGFP utilisé, et Zachary Sun et Abel Chiao (Tierra Biosciences) pour les discussions fructueuses liées au prototypage avec des systèmes sans cellules et au dépannage connexe de la manipulation acoustique des liquides.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2x YT medium Sigma-Aldrich Y2377-250G Alternative to making 2xYT media
Agar Bacto 214010 For plating cells
Chromatography column (5 cm diameter) BIO-RAD 731-1550 Used for protein purification.
Destination plate Thermo Scientific Nunc plate 142761 For CFPS reactions
DMSO Sigma-Aldrich D2650 For dialysis buffer
DpnI NEB R0176L For digestion of plasmid templates
DTT Roche 20871723 S30 Buffer B
E. coli BL21(DE3) Rosetta2 Novagen 70954 Cell line used for production of lysate and purified proteins
Echo acoustic liquid handler Labcyte 525 Acoustic liquid handler
French pressure cell Thermo Spectronic FA-078 For lysing cells for CFPS
Imidazole Sigma-Aldrich 56750 For buffers
Impermeable plastic sealable lid Thermo 232702 Plate seal
IPTG RPI I56000-25.0 Used for protein induction.
K-Glu Sigma-Aldrich g1501-500G S30 Buffer B
Labcyte Echo source plate Labcyte PL-05525 For use with Echo acoustic liquid handler
Mg-Glu Sigma-Aldrich 49605-250G S30 Buffer B
NaCl Sigma-Aldrich S7653-250G For buffers
NaHPO4 Sigma-Aldrich 71505 For dialysis buffer
NaOH Mallinckrodt Chemicals 7708-10 For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899
Ni-NTA resin Invitrogen R901-15 For production of purified proteins
PCR H2O Ambion AM9937 PCR of linear templates
Plate Reader BioTek H10 Plate reader used
Q5 PCR Master Mix NEB M0494S PCR of linear templates
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28606 PCR of linear templates
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28004 PCR of linear templates
QSonica Ultrasonic Processor Qsonica Q700 Cell disruption during protein purification
RTS Amino Acid Sampler biotechrabbit BR1401801 Updated supplier from Sun et al.
Tris MP 819623 S30 Buffer B
Tris-Cl Sigma-Aldrich T5941 For buffers
Tryptone Fluka T7293 For making 2xYT media
Yeast Extract Bacto 212750 For making 2xYT media

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