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Bioengineering

सेल-फ्री सिस्टम के साथ आनुवंशिक भागों का तेजी से लक्षण वर्णन

Published: August 30, 2021 doi: 10.3791/62816
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3,4, 2,4, 4, 2, 4, 4
1US Army Combat Capabilities Development Command Army Research Laboratory, 2Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 3Excet, Inc., 4US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center

Summary

उपन्यास आनुवंशिक सर्किट के डिजाइन के लिए अच्छी तरह से विशेषता वाले आनुवंशिक भाग आवश्यक हैं। यहां हम आनुवंशिक भागों को तेजी से चिह्नित करने के लिए एक लागत प्रभावी, उच्च-थ्रूपुट विधि का वर्णन करते हैं। हमारी विधि सेल-मुक्त लाइसेट, क्लोनिंग से बचने के लिए रैखिक डीएनए और थ्रूपुट बढ़ाने और प्रतिक्रिया की मात्रा को कम करने के लिए ध्वनिक तरल हैंडलिंग के संयोजन से लागत और समय को कम करती है।

Abstract

उपयोगी आनुवंशिक सर्किट के डिजाइन के लिए आनुवंशिक भागों को चिह्नित करना और सूचीबद्ध करना महत्वपूर्ण है। अच्छी तरह से विशेषता वाले भागों के होने से आनुवंशिक सर्किट की ठीक-ट्यूनिंग की अनुमति मिलती है, जैसे कि उनके कार्य के परिणामस्वरूप अनुमानित परिणाम होते हैं। एक क्षेत्र के रूप में सिंथेटिक जीव विज्ञान के विकास के साथ, आनुवंशिक सर्किट का विस्फोट हुआ है जिसे संवेदन, चयापचय परिवर्तन और सेलुलर कंप्यूटिंग से संबंधित कार्यों को निष्पादित करने के लिए रोगाणुओं में लागू किया गया है। यहां, हम आनुवंशिक भागों को चिह्नित करने के लिए एक तेज़ और लागत प्रभावी विधि दिखाते हैं। हमारी विधि सेल-फ्री लाइसेट का उपयोग करती है, जिसे एक रिपोर्टर प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से भागों का मूल्यांकन करने के लिए एक माध्यम के रूप में इन-हाउस तैयार किया जाता है। टेम्पलेट डीएनए पीसीआर प्रवर्धन द्वारा रिपोर्टर जीन में वेरिएंट भागों को जोड़ने के लिए सस्ती प्राइमरों का उपयोग करके तैयार किया जाता है, और टेम्पलेट को क्लोनिंग के बिना रैखिक डीएनए के रूप में प्रतिक्रिया में जोड़ा जाता है। इस तरह से जोड़े जा सकने वाले भागों में प्रमोटर, ऑपरेटर, राइबोसोम बाइंडिंग साइट, इन्सुलेटर और टर्मिनेटर शामिल हैं। यह दृष्टिकोण, एक ध्वनिक तरल हैंडलर और 384-वेल प्लेटों के समावेश के साथ मिलकर, उपयोगकर्ता को एक ही दिन में आनुवंशिक भागों के उच्च-थ्रूपुट मूल्यांकन करने की अनुमति देता है। तुलनात्मक रूप से, सेल-आधारित स्क्रीनिंग दृष्टिकोणों को समय लेने वाली क्लोनिंग की आवश्यकता होती है और रात भर की संस्कृति और संस्कृति घनत्व सामान्यीकरण चरणों के कारण लंबे समय तक परीक्षण समय होता है। इसके अलावा, सेल-मुक्त लाइसेट में काम करने से उपयोगकर्ता को सटीक सांद्रता पर बहिर्जात घटकों और डीएनए को जोड़ने के माध्यम से अभिव्यक्ति की स्थिति पर सटीक सख्त नियंत्रण करने की अनुमति मिलती है। सेल-मुक्त स्क्रीनिंग से प्राप्त परिणामों का उपयोग सीधे सेल-मुक्त प्रणालियों के अनुप्रयोगों में या, कुछ मामलों में, पूरे कोशिकाओं में कार्य की भविष्यवाणी करने के तरीके के रूप में किया जा सकता है।

Introduction

सिंथेटिक जीव विज्ञान का एक मुख्य प्रयास अच्छी तरह से विशेषता वाले भागों वाले आनुवंशिक उपकरण किट विकसित करना है, जिसका उपयोग आनुवंशिक सर्किट1 के निर्माण के लिए किया जा सकता है जो रोगाणुओं या सेल-मुक्त लाइसेट में तैनात होने पर उपयोगी कार्य करते हैं। जिन क्षेत्रों में इस तरह के आनुवंशिक सर्किट ने कर्षण प्राप्त किया है, वे 2,3,4, मानव प्रदर्शन 5,6, जैव ईंधन 7,8, सामग्री उत्पादन 9,10 और सेलुलर कंप्यूटिंग 11 को महसूस कर रहे हैं। मानकीकृत आनुवंशिक भागों की रजिस्ट्रियां स्थापित की गई हैंताकि नए और मौजूदा भागों को प्रमोटरों, ऑपरेटरों, कोडिंग अनुक्रमों और टर्मिनेटर जैसी श्रेणियों में सूचीबद्ध किया जा सके। आईजीईएम (अंतर्राष्ट्रीय आनुवंशिक रूप से इंजीनियरिंग मशीन) प्रतियोगिता13 जैसे प्रयासों ने इन आनुवंशिक भागों को चिह्नित करने और सूचीबद्ध करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। इन भागों को उपयोगी आनुवंशिक सर्किट14,15 में तेजी से इकट्ठा करने की सुविधा के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। सॉफ्टवेयर को अच्छी तरह से विशेषता वाले भागों की संरचना को सर्किट में स्वचालित करने के लिए भी विकसित किया गया है जो वांछित फ़ंक्शन16 प्राप्त करते हैं। हालांकि, अनुमानित कार्यों के साथ उपयोगी आनुवंशिक सर्किट की असेंबली इस धारणा पर टिकी हुई है कि आनुवंशिक उपकरण किट में अच्छी तरह से विशेषता वाले आनुवंशिक भाग होते हैं। सिंथेटिक जीव विज्ञान की प्रगति की दिशा में इन टूल किट की आवश्यकता के कारण, उचित लक्षण वर्णन डेटा के साथ सर्किट और भागों को बेहतर ढंग से सूचीबद्ध करने के कई प्रयासोंको 17,18,19,20,21 वर्णित किया गया है।

आनुवंशिक घटकों को चिह्नित करने के लिए एक दृष्टिकोण सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) प्रणालियों का उपयोग करता है, जो प्रतिलेखन और अनुवाद एक्स विवो22 जैसे सेलुलर कार्यों का पुनर्गठन करते हैं। कई अध्ययनों ने आनुवंशिक घटकों को प्रोटोटाइप करने के लिए सीएफपीएस की क्षमता का प्रदर्शन कियाहै 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 चाहे सेल-मुक्त प्रणालियों में प्रत्यक्ष अनुप्रयोगों के लिए या कोशिकाओं में आनुवंशिक संरचनाओं के कार्य की भविष्यवाणी करने के लिए, जैसे कि पुस्तकालय के भीतर भागों की सापेक्ष गतिविधि। , चयापचय मार्ग अनुकूलन27, और सेलुलर बोझ30। इन अध्ययनों द्वारा हाइलाइट किए गए सीएफपीएस बनाम कोशिकाओं में प्रोटोटाइप के लाभों में समय लेने वाली क्लोनिंग से बचना, डीएनए और अन्य प्रतिक्रिया घटकों की एकाग्रता पर सटीक नियंत्रण और कई डीएनए संरचनाओं को आसानी से मिश्रण और मिलान करने की क्षमता शामिल है। क्लोनिंग से बचने का लाभ रैखिक डीएनए टेम्प्लेट का उपयोग करते समय विशेष रूप से स्पष्ट होता है, जो नए निर्माणों को इन विट्रो विधियों द्वारा इकट्ठा करने में सक्षम बनाता है जिसमें33 दिनों के बजाय घंटे लगते हैं। पाइपिंग द्वारा डीएनए संरचनाओं और अन्य घटकों की एकाग्रता में हेरफेर करने की क्षमता तरल हैंडलिंग रोबोट34,35 द्वारा संचालित उच्च-थ्रूपुट प्रयोग को सक्षम करके दृष्टिकोण को और भी आकर्षक बनाती है। जबकि प्रोटोटाइप के लिए सीएफपीएस का उपयोग करने वाली सफलताओं की सूचना दी गई है, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह देखा जाना बाकी है कि सीएफपीएस परिणाम किन संदर्भों के तहत कोशिकाओं में कार्यक्षमता की विश्वसनीय भविष्यवाणी कर सकते हैं।

यहां, हम सीएफपीएस प्रोटोटाइप के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो पारंपरिक सेल-आधारित दृष्टिकोणों की तुलना में गति, थ्रूपुट और लागत में फायदे पर जोर देता है। दृष्टिकोण हमारे पिछले काम से लिया गया है जहां हमने प्रतिलेखन कारक टेटआर32 द्वारा विनियमित टी 7 प्रमोटर वेरिएंट की एक लाइब्रेरी को तेजी से चिह्नित करने के लिए सीएफपीएस का उपयोग किया, जो36,37 के समय साहित्य में उपलब्ध विनियमित टी 7 प्रमोटर वेरिएंट के छोटे मुट्ठी भर पर काफी विस्तार कर रहा था। तब से अन्य ने ऐसे प्रवर्तकों की सीमा को और बढ़ा दियाहै। हमारी विधि में, पीसीआर का उपयोग करके आनुवंशिक निर्माण असेंबली को प्राइमरों के माध्यम से टेम्पलेट डीएनए को बढ़ाने के लिए तेज किया जाता है जो एक रिपोर्टर जीन में वेरिएंट आनुवंशिक भागों को जोड़ते हैं। 384-वेल प्लेटों में ध्वनिक तरल हैंडलिंग का उपयोग थ्रूपुट बढ़ाने और आवश्यक सामग्री की मात्रा को कम करने के लिए किया जाता है। पिछले काम ने39,40 की मात्रा में ध्वनिक तरल हैंडलिंग के सफल उपयोग का प्रदर्शन किया है, जिसमें बड़ी मात्रा 41 के मैनुअल पिपेटिंग के बराबर परिवर्तनशीलता है। विधि के अलावा, हम समस्या निवारण जानकारी और संभावित लागत और समय की बचत का आकलन प्रदान करते हैं। ध्यान दें कि जब हम यहां सन एट अल.42 के आधार पर सेल-फ्री लाइसेट बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल करते हैं, तो कई अन्य वाणिज्यिक किट और प्रोटोकॉल43,44 भी काम करना चाहिए। इसी तरह, जब हम प्रमोटर वेरिएंट32 के लक्षण वर्णन के लिए विधि का प्रदर्शन करते हैं, तो अन्य भागों को पीसीआर प्रवर्धन द्वारा इंटरचेंज किया जा सकता है, जैसे कि राइबोरेगुलेटर्स, राइबोसोम बाइंडिंग साइट्स (आरबीएस), इन्सुलेटर, प्रोटीन टैग और टर्मिनेटर। हमें उम्मीद है कि यह पद्धति सिंथेटिक जीव विज्ञान समुदाय को उपयोगी कार्य के साथ अनुमानित आनुवंशिक सर्किट की असेंबली के लिए विशेषता वाले भागों की संख्या बढ़ाने में मदद कर सकती है।

Protocol

1. सेल निकालने की तैयारी

  1. मीडिया की तैयारी
    1. 2xYT मीडिया के लिए: 900 एमएल विआयनीकृत पानी में 16 ग्राम ट्रिप्टोन, 10 ग्राम खमीर निकालने और 5 ग्राम NaCl जोड़ें और पीएच को 5 M NaOH के साथ 7.0 में समायोजित करें। विआयनीकृत पानी का उपयोग करके समाधान की मात्रा को 1 एल तक बढ़ाएं और ऑटोक्लेव या फ़िल्टर स्टरलाइज़ करें। वैकल्पिक रूप से, 2xYT मीडिया खरीदें।
    2. एस 30 बी बफर के लिए: 2 एल विआयनीकृत पानी में 14 एमएम एमजी-ग्लूटामेट, 60 एमएम के-ग्लूटामेट और 5 एमएम ट्राइस का घोल तैयार करें। पीएच को 8.2, ऑटोक्लेव में समायोजित करने के लिए 2 एम ट्रिस का उपयोग करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग से ठीक पहले 1 mM की अंतिम सांद्रता में Dithiothreitol (DTT) जोड़कर समाधान को पूरा करें।
  2. कोशिकाओं की तैयारी
    1. स्ट्रीक एस्चेरिचिया कोलाई बीएल 21 (डीई 3) रोसेटा 2 कोशिकाएं या पसंद की अन्य सेल लाइन (हाल ही में व्यापक समीक्षा के लिए कोल एट अल .44 देखें) एक एलबी (लिसोजेनी ब्रोथ) एगर प्लेट पर और 10-14 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. 10 एमएल कल्चर ट्यूब में 2xYT माध्यम के 3 एमएल को टीका लगाने के लिए एकल ई कोलाई कॉलोनी का उपयोग करें। इस ट्यूब को 8 घंटे के लिए 250 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. 500 एमएल फ्लास्क में 2xYT माध्यम के 50 mL को टीका लगाने के लिए 3 mL संस्कृति से 50 μL का उपयोग करें। इस फ्लास्क को 8 घंटे के लिए 250 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. 2xYT माध्यम के 0.75 L युक्त चार 4 L चकराए गए फ्लास्क में से प्रत्येक को टीका लगाने के लिए 50 mL संस्कृति से 7.5 mL का उपयोग करें। इन फ्लास्क को 220 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि वे लगभग 3-4 घंटे के बाद 2 से 4 के 600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व तक नहीं पहुंच जाते।
    5. प्रत्येक फ्लास्क से कोशिकाओं को 1 एल कंटेनरों में स्थानांतरित करके और 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 मिनट के लिए 5,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके काटें। एक अपशिष्ट कंटेनर में डिकैंट करके सतह पर तैरने वाले को फेंक दें।
    6. सेल द्रव्यमान को बाधित करने के लिए पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक सेल पेलेट को 150 एमएल बर्फ-ठंडा एस 30 बी बफर के साथ धोएं, और फिर 12 मिनट के लिए 5,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को फिर से इकट्ठा करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    7. प्रत्येक सेल पेलेट को 40 एमएल बर्फ-ठंडे एस 30 बी बफर में फिर से धोएं और उन्हें पूरी तरह से पुन: निलंबित करके और पिपेट का उपयोग करके सेल द्रव्यमान को बाधित करें। कोशिकाओं को पूर्व-वजन वाले 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 2,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को फिर से इकट्ठा करें। सतह पर तैरने वाले को डीकैंटिंग करके फेंक दें।
    8. गीले सेल छर्रों का वजन करें। ट्यूबों को सीधे तरल नाइट्रोजन में रखकर सेल छर्रों को फ्लैश-फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. सेल लाइसिस
    1. बर्फ पर सेल छर्रों को पिघलाएं।
    2. प्रत्येक सेल पेलेट को 1.4 एमएल एस 30 बी बफर में प्रति 1 ग्राम सेल पेलेट में भंवर द्वारा पुन: निलंबित किया जाता है।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 640 पीएसआई पर फ्रांसीसी दबाव सेल द्वारा कोशिकाओं को लाइस करें। बर्फ पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में लाइसेट एकत्र करें और लाइसिस के तुरंत बाद लाइसेट के प्रति 1 एमएल में 1 एम डीटीटी के 3 μL जोड़ें।
      नोट: दबाव बनाए रखने और दबाव में अचानक गिरावट से बचने के लिए एक छोटी धातु रॉड के साथ फ्रांसीसी प्रेस रिलीज वाल्व को टैप करना सबसे अच्छा है।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा लाइसेट को 30,000 x g पर साफ़ करें और सतह पर तैरने वाले को एक नई बर्फ-ठंडा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालने के बाद गोली को छोड़ दें, इस बात का ध्यान रखते हुए कि गोली को बाधित न किया जाए।
    5. सुपरनैटेंट को दूसरी बार 30,000 x g पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। परिणामी सतह पर तैरने वाले को बर्फ-ठंडा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बदलें। गोली को त्याग दें।
    6. सुपरनैटेंट को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सतह पर तैरने वाले को साफ करें और परिणामस्वरूप सतह पर तैरने वाले को बर्फ-ठंडे माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, इस बात का ध्यान रखते हुए कि गोली को बाधित न किया जाए।
    8. सुपरनैटेंट को दूसरी बार 15,000 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और परिणामस्वरूप सुपरनैटेंट को बर्फ-ठंडे माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, इस बात का ध्यान रखते हुए कि किसी भी शेष गोली को बाधित न किया जाए।
    9. सुपरनैटेंट को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 100 μL एलिकोट में वितरित करें और उन्हें सीधे तरल नाइट्रोजन में रखकर फ्रीज करें। सुपरनैटेंट को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. रैखिक टेम्पलेट तैयारी

  1. प्राइमर डिजाइन
    1. पीसीआर टेम्पलेट के रूप में एक कोर अनुक्रम चुनें। कम से कम एक रिपोर्टर अनुक्रम शामिल करें, जैसे कि एसएफजीएफपी (सुपरफ़ोल्डर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन), LacZ, या पालक एपटामर। अन्य भागों को शामिल करें जो स्क्रीन किए गए वेरिएंट में तय किए जाएंगे, जैसे टर्मिनेटर, प्रमोटर या आरबीएस, डिजाइन के लिए उपयुक्त हैं।
      नोट: सेल-मुक्त प्रणालियों में रैखिक डीएनए से अभिव्यक्ति के लिए एक टर्मिनेटर को शामिल करना हमेशा आवश्यक नहीं होता है।
    2. फॉरवर्ड प्राइमरों के लिए, प्राइमर के 3' छोर के रूप में कोर अनुक्रम के 5 ' अंत से मेल खाने वाले न्यूनतम 20 बीपी का चयन करें। यदि निर्माण के 5' अंत में भागों को जोड़ते हैं, तो पीसीआर प्रवर्धन (चित्रा 1 ए और चित्रा 2) के माध्यम से कोर अनुक्रम में रुचि के आनुवंशिक भागों को जोड़ने के लिए प्राइमर के 5 ' अंत के शेष भाग को डिजाइन करें।
      नोट: चूंकि ~ 60 बीपी से ऊपर के प्राइमर अक्सर लागत में नाटकीय रूप से वृद्धि करते हैं, इसलिए कई ओवरलैपिंग प्राइमरों को लंबे अनुक्रम या कई भागों को जोड़ने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। जबकि एक पीसीआर प्रतिक्रिया में कई प्राइमरों का उपयोग किया जा सकता है, पीसीआर के कई राउंड करने की सिफारिश की जाती है।
    3. रिवर्स प्राइमरों के लिए, प्राइमर के 3' छोर के रूप में कोर अनुक्रम के 3 ' अंत से मेल खाने के लिए न्यूनतम 20 बीपी चुनें। यदि निर्माण के 3' अंत में भागों को जोड़ते हैं, तो पीसीआर प्रवर्धन (चित्रा 1 ए और चित्रा 2) के माध्यम से कोर अनुक्रम में रुचि के आनुवंशिक भागों को जोड़ने के लिए प्राइमर के 5 ' अंत के शेष भागों को डिजाइन करें। सुनिश्चित करें कि रिवर्स प्राइमर का एनीलिंग तापमान पूरे फॉरवर्ड प्राइमर के एनीलिंग तापमान के 5 डिग्री सेल्सियस के भीतर है।
  2. रैखिक टेम्पलेट प्रवर्धन
    1. कोर अनुक्रमों की संख्या के आधार पर किए जाने वाले पीसीआर प्रतिक्रियाओं की संख्या निर्धारित करें और तालिका 1 का उपयोग करके आवश्यक प्रत्येक घटक की मात्रा की गणना करें।
    2. तालिका 1 के अनुसार मास्टर मिश्रण तैयार करें और इसे बर्फ पर स्टोर करें। मास्टर के एलिकोट 30 या 40 μL (तालिका 1 देखें) पीसीआर ट्यूबों की निर्धारित संख्या में मिश्रण करते हैं और प्रत्येक चर प्राइमर के 10 μL को जोड़ते हैं (यानी, एक भाग परिवर्तन को एन्कोडिंग करने वाले प्राइमर, तालिका 1 देखें) उचित रूप से लेबल पीसीआर ट्यूबों के लिए 5 μM पर।
    3. पीसीआर ट्यूबों को थर्मोसाइक्लर में रखें और निम्नलिखित पीसीआर प्रोग्राम चलाएं: 3 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; 15 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, 20 सेकंड के लिए XX डिग्री सेल्सियस, YY मिनट के लिए 72 °C; 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार। फिर, प्रतिक्रिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      जहां, XX कम एनीलिंग तापमान के साथ प्राइमर के लिए एनीलिंग तापमान का प्रतिनिधित्व करता है और वाईवाई उपयोग किए गए उच्च-निष्ठा पोलीमरेज़ के लिए निर्माता की सिफारिशों के आधार पर एम्प्लिकॉन की लंबाई के लिए गणना किए गए विस्तार समय का प्रतिनिधित्व करता है। विभिन्न प्राइमरों और / या टेम्प्लेट के लिए आवश्यकतानुसार इन शर्तों को अनुकूलित करें।
    4. (वैकल्पिक) मूल टेम्पलेट को पचाने के लिए DpnI प्रतिबंध एंजाइम का 1 μL जोड़ें। प्रतिक्रिया को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यह चरण केवल तभी करें जब मूल टेम्पलेट प्लास्मिड डीएनए हो।
    5. जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के 5 μL का विश्लेषण करें। 20 मिनट के लिए 180 वोल्ट पर 1% अगारोस जेल का उपयोग करके उत्पाद को अलग करें। सही बैंड आकार की जांच करें, जो चुने हुए कोर अनुक्रम और जोड़े गए भागों की लंबाई के साथ भिन्न होगा।
  3. एक वाणिज्यिक पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके या पसंदीदा पीसीआर सफाई विधि द्वारा रैखिक टेम्पलेट को शुद्ध करें। यदि जेल वैद्युतकणसंचलन विश्लेषण द्वारा कई बैंड मौजूद थे, तो या तो पीसीआर स्थितियों को अनुकूलित करें या निर्माता की सिफारिश के अनुसार वाणिज्यिक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके सही आणविक भार बैंड को शुद्ध करें।
  4. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके प्रत्येक डीएनए टेम्पलेट की मात्रा निर्धारित करें। डीएनए टेम्पलेट की गुणवत्ता का आकलन यह जांचकर करें कि 260 एनएम / 280 एनएम अनुपात लगभग 1.8 है।
  5. (वैकल्पिक) फिर से 20 मिनट के लिए 180 वी पर 1% अगारोस जेल का उपयोग करके डीएनए टेम्पलेट के एक हिस्से को अलग करें और सुनिश्चित करें कि टेम्पलेट शुद्धिकरण के दौरान किसी भी अवांछित बैंड को हटा दिया गया था।
  6. तुरंत शुद्ध डीएनए टेम्प्लेट का उपयोग करें या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. शुद्ध प्रोटीन तैयार करना

  1. प्रोटीन अभिव्यक्ति
    1. प्रत्येक प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए, एक उपयुक्त अभिव्यक्ति निर्माण को इकट्ठा करें। कोलोन-ई कोलाई में अभिव्यक्ति के लिए जीन का अनुकूलन करें। जीन को पसंदीदा प्लास्मिड असेंबली विधि के माध्यम से पीईटी -22 बी अभिव्यक्ति वेक्टर या अन्य उपयुक्त अभिव्यक्ति वेक्टर में डालें। अभिव्यक्ति प्लास्मिड को बीएल 21 (डीई 3) रोसेटा 2 अभिव्यक्ति कोशिकाओं या अन्य उपयुक्त सेल लाइन में बदलें।
    2. प्रत्येक प्रोटीन के लिए, 10 एमएल कल्चर ट्यूब में 3 एमएल एलबी माध्यम को टीका लगाने के लिए एक एकल कॉलोनी का उपयोग करें। इन ट्यूबों को रात भर 250 आरपीएम पर हिलाने के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. रात भर की संस्कृति के 1 एमएल के साथ 750 एमएल एलबी माध्यम वाले 2 एल फ्लास्क को टीका लगाएं। इन फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पर 250 आरपीएम पर झटकों के साथ इनक्यूबेट करें जब तक कि वे0.6-1.0 के ओडी 600 तक न पहुंच जाएं।
    4. प्रत्येक फ्लास्क में पानी में 0.75 एमएल 1 एम आइसोप्रोपिल β-डी-1-थियोगलैक्टोपायरानोसाइड (आईपीटीजी) जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करें और 4 घंटे के लिए 250 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इन फ्लास्क को इनक्यूबेट करना जारी रखें।
    5. प्रत्येक फ्लास्क से कोशिकाओं को 1 लीटर सेंट्रीफ्यूज बोतल का उपयोग करके, 12 मिनट के लिए 5,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा काटें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    6. छर्रों को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और प्रत्येक गोली का वजन करें। तरल नाइट्रोजन में कोशिकाओं को फ्लैश-फ्रीज करें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या चरण 3.2 पर आगे बढ़ें।
      नोट: इस चरण से प्रति 0.75 एमएल में 2-5 ग्राम कोशिकाओं के परिणाम की उम्मीद है।
  2. निकल आत्मीयता कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्रोटीन शुद्धिकरण
    1. 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, और 5 mM imidazole के संयोजन से लाइसिस बफर तैयार करें। pH 8.0 पर समायोजित करें।
    2. 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, और 25 mM imidazole के संयोजन से वॉश बफर तैयार करें। pH 8.0 पर समायोजित करें।
    3. 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, और 250 mM imidazole के संयोजन से क्षालन बफर तैयार करें। pH 8.0 पर समायोजित करें।
    4. 50 mM NaHPO4, 100 mM NaCl और 2% DMSO के संयोजन से डायलिसिस बफर तैयार करें। pH 7.5 पर समायोजित करें।
    5. कमरे के तापमान के पानी में ट्यूबों को रखकर सेल छर्रों को पिघलाएं। सेल पेलेट के प्रति 1 ग्राम लाइसिस बफर के 5 एमएल जोड़ें और भंवर द्वारा पुन: निलंबित करें।
    6. कोशिकाओं को सोनिकेशन द्वारा अलग करें। सेल होमोजेनेट को अलग करें ताकि प्रति 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 30 एमएल से अधिक न हो और प्रत्येक ट्यूब को बर्फ पर रखें। 30 सेकंड ब्रेक के साथ 15 सेकंड में 0.16 सेमी व्यास की जांच के साथ एक सोनिकेटर का उपयोग करके कोशिकाओं को 10 बार।
      नोट: फोमिंग से बचें, क्योंकि यह प्रोटीन को विकृत करता है। सोनिकेटर टिप को लाइसेट में कम से कम 2/3 डुबोकर रखकर फोम के गठन से बचा जा सकता है, जबकि यह चालू है। सोनिकेशन के अलावा सेल लाइसिस के अन्य तरीकेभी संभव हैं।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा लाइसेट को 15,000 x g पर साफ़ करें और सुपरनैटेंट को एक नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
    8. प्रत्येक 5 एमएल सुपरनैटेंट के लिए 1 एमएल निकल-नाइट्रिलोट्रिएसेटिक एसिड (नी-एनटीए) राल जोड़ें। सेल लाइसेट / नी-एनटीए घोल को विभाजित करें ताकि प्रति 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 36 एमएल से अधिक न हो। 1 घंटे के लिए 10 आरपीएम पर घूमने वाली ट्यूब पर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    9. सेल लाइसेट/नी-एनटीए घोल को 2 एमएल बेड वॉल्यूम क्रोमैटोग्राफी कॉलम में डिकैंटिंग करके राल लोड करें और आगे के विश्लेषण के लिए यदि आवश्यक हो तो एलुएंट एकत्र करें, अन्यथा, छोड़ दें। राल को वॉश बफर के 10 राल बेड वॉल्यूम के साथ धोएं।
    10. कॉलम में क्षालन बफर के तीन राल बिस्तर वॉल्यूम जोड़कर प्रोटीन एकत्र करें और प्रत्येक प्रोटीन के लिए उपयुक्त आणविक भार कट-ऑफ झिल्ली के साथ केन्द्रापसारक सांद्रक का उपयोग करके मात्रा को 1.5 एमएल तक केंद्रित करें।
    11. 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 एल डायलिसिस बफर के खिलाफ प्रोटीन को डायलाइज करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 2 एल डायलिसिस बफर के खिलाफ प्रोटीन को फिर से डायलाइज करें।
    12. 280 एनएम पर अपने दाढ़ विलोपन गुणांक और अवशोषण का उपयोग करके प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें। सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) का उपयोग करके शुद्धता के लिए प्रोटीन का विश्लेषण करें। प्रोटीन को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण

  1. सीएफपीएस प्रतिक्रिया मिश्रण की तैयारी
    1. सन एट अल.42 में अमीनो एसिड समाधान तैयारी, ऊर्जा समाधान तैयारी और बफर तैयारी चरणों का पालन करके पूरक मिश्रण तैयार करें। अलग से स्टोर करें या एलिकोट में -80 डिग्री सेल्सियस पर संयुक्त करें। सुनिश्चित करें कि अंतिम सांद्रता टीएक्स-टीएल प्रतिक्रिया अनुभाग के प्रयोगात्मक निष्पादन में सन एट अल .42 में वर्णित लोगों से मेल खाती है।
    2. रैखिक डीएनए को क्षरण से बचाने के लिए एक योजक तैयार करें। यदि GamS33,45 का उपयोग कर रहे हैं, तो ऊपर अनुभाग 3 में चरणों के माध्यम से तैयार करें, या एक वाणिज्यिक विक्रेता से प्राप्त करें; अन्य दृष्टिकोणों के लिए, संबंधित साहित्य46,47,48 की जांच करें। वैकल्पिक रूप से, एक सीएफपीएस प्रणाली का उपयोग करें जिसे एडिटिव्स49 की आवश्यकता नहीं है।
    3. ऊपर अनुभाग 3 में दिए गए चरणों का उपयोग करके टी 7 पोलीमरेज़, रिप्रेसर प्रोटीन और अन्य एडिटिव्स तैयार करें या एक वाणिज्यिक विक्रेता से प्राप्त करें।
    4. प्रदर्शन किए जाने वाले सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं की संख्या निर्धारित करें और तालिका 2 का उपयोग करके आवश्यक प्रत्येक घटक की मात्रा की गणना करें। घटकों की सांद्रता को संशोधित करें, जिसमें आवश्यकतानुसार घटकों को जोड़ना या हटाना शामिल है, और पानी की मात्रा को समायोजित करें ताकि प्रत्येक प्रतिक्रिया मिश्रण की अंतिम मात्रा हमेशा 10 μL हो। इसी तरह, वांछित रूप से ध्वनिक तरल हैंडलिंग द्वारा अन्य घटकों के वितरण की सुविधा के लिए मास्टर मिश्रण को संशोधित करें ( चर्चा अनुभाग देखें)।
    5. बर्फ पर सभी घटकों को पिघलाएं और ऊपर गणना के अनुसार प्रत्येक घटक को मिलाकर एक मास्टर मिश्रण तैयार करें। पिपेट द्वारा सभी घटकों को अच्छी तरह से मिलाएं। वर्षा से बचने के लिए सावधानीपूर्वक ध्यान दें, खासकर अमीनो एसिड मिश्रण के लिए। मास्टर मिश्रण को बर्फ पर रखें।
    6. बर्फ पर एक 384-वेल प्लेट को ठंडा करें और प्रत्येक कुएं में 9 μL एलिकोट में मास्टर मिश्रण वितरित करें।
      नोट: ध्वनिक तरल हैंडलिंग द्वारा इन घटकों को वितरित करना संभव है, हालांकि उचित वितरण सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए (समस्या निवारण के लिए चर्चा अनुभाग देखें)।
  2. ध्वनिक तरल हैंडलिंग द्वारा अतिरिक्त घटकों का वितरण
    1. सभी सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक दमनकारी प्रोटीन (और अन्य वैकल्पिक घटकों) की मात्रा की गणना करें।
    2. बर्फ पर दमनकारी प्रोटीन को पिघलाएं और इसे ध्वनिक तरल हैंडलिंग स्रोत प्लेट या अन्य उपयुक्त प्लेट में वितरित करें। सुनिश्चित करें कि उपयोग की जाने वाली स्रोत प्लेट के प्रकार के लिए आवश्यक मृत मात्रा की उचित मात्रा शामिल है।
    3. रिप्रेसर प्रोटीन को तरल हैंडलर के माध्यम से उपयुक्त कुओं में 1 μL वॉल्यूम में वितरित करें। वितरण समस्या निवारण के बारे में अधिक जानकारी के लिए, चर्चा अनुभाग देखें.
  3. मानक वक्र
    1. अन्य अध्ययनों और अन्य प्रयोगशालाओं के साथ परिणामों की तुलना को सक्षम करने के लिए प्लेट पर शुद्ध रिपोर्टर (प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए अनुभाग 3 देखें) 41 या उपयुक्त रासायनिक मानक50 का एक सीरियल कमजोर पड़ना शामिल करें। प्रयोगों के रिपोर्टर और अपेक्षित अभिव्यक्ति सीमा के लिए उपयुक्त सांद्रता की एक श्रृंखला चुनें।
  4. CFPS प्रतिक्रियाओं को चलाना
    1. प्लेट रीडर को 30 डिग्री सेल्सियस तक प्री-वार्म करें। चरणों को हिलाए बिना कोर अनुक्रम में उपयोग किए जाने वाले रिपोर्टर के लिए उपयुक्त सेटिंग्स पर पढ़ने के लिए प्लेट रीडर सेट करें।
      नोट: जबकि 30 डिग्री सेल्सियस का उपयोग यहां किया जाता है, 29 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस भी आमतौर पर उपयोग किए जाते हैं और इस प्रोटोकॉल के साथ अच्छी तरह से काम करते हैं। वैकल्पिक सेल-मुक्त प्रतिक्रिया तैयारी के लिए अन्य तापमानों को प्राथमिकता दी जा सकती है। पढ़ने के अंतराल के लिए, यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि डेटा के लिए एक अच्छा समाधान प्राप्त करने के लिए 10 मिनट पर्याप्त है; हालांकि, रिपोर्टर प्रोटीन और विशेष सीएफपीएस नुस्खा के आधार पर अन्य संकल्प बेहतर हो सकते हैं।
    2. (वैकल्पिक) सिग्नल अतिप्रवाह के बिना प्रतिदीप्ति में परिवर्तन को पकड़ने के लिए उपयुक्त लाभ या संवेदनशीलता सेटिंग सेट करने के लिए पहले एक परीक्षण प्रतिक्रिया चलाएं।
    3. वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक अभेद्य प्लास्टिक सीलेबल ढक्कन के साथ 384-वेल प्लेट को सील करें। यदि संभव हो, तो उपकरण पर, सील पर संघनन को सीमित करने के लिए 1 डिग्री सेल्सियस ऊर्ध्वाधर तापमान ढाल सेट करें। प्लेट धारक पर 384-वेल प्लेट रखें और पढ़ना शुरू करें।

Representative Results

हमारे तरीकों की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, हम ऐसे परिणाम प्रस्तुत करते हैं जो टी 7 आरएनएपी-संचालित अभिव्यक्ति के विनियमन पर टी 7 प्रमोटर के लिए टेटओ अनुक्रम की निकटता के प्रभावों का वर्णन करते हैं। पूर्ण परिणाम और उनके निहितार्थ मैकमैनस एट अल .32 के काम में पाए जा सकते हैं। वर्कफ़्लो चित्र 1 में वर्णित है। पंद्रह रैखिक टेम्प्लेट, जो केवल टेटओ अनुक्रम के सापेक्ष टी 7 प्रमोटर की दूरी में भिन्न होते हैं, पीसीआर द्वारा एसएफजीएफपी रिपोर्टर द्वारा तैयार किए गए थे, जिसमें प्रोटोकॉल के खंड 2 में वर्णित प्रत्येक प्रमोटर संस्करण (चित्रा 2) को जोड़ने के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमर थे। प्रोटोकॉल का पालन करते हुए सीएफपीएस प्रतिक्रिया घटक और प्रतिक्रियाएं तैयार की गईं। एसएफजीएफपी की अभिव्यक्ति को ध्वनिक तरल हैंडलर का उपयोग करके, तीन प्रतियों में, टेटआर प्रोटीन की 12 अलग-अलग सांद्रता के अनुमापन के साथ प्रत्येक टेम्पलेट से मापा गया था। प्रति टेम्पलेट 36 सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं और 15 टेम्प्लेट पर, टी 7-टेटओ संयोजनों के पूरे सेट के लिए कुल 540 प्रतिक्रियाएं की गईं। पूरा मूल्यांकन दो प्लेट रीडर में दो प्लेटों पर किया गया था। इस डेटा के विश्लेषण से पता चला है कि टी 7 आरएनएपी टी 7 ट्रांसक्रिप्ट (चित्रा 3) की शुरुआत से 13 बीपी डाउनस्ट्रीम के माध्यम से टी 7-संचालित अभिव्यक्ति को समान रूप से डाउनरेगुलेट करता है। इस परिणाम में अन्य दमनकर्ताओं द्वारा टी 7 के प्रभावी दमन के लिए एक कथित खिड़की का वर्णन करके विनियमित टी 7-संचालित जीन सर्किट के भविष्य के डिजाइन के लिए निहितार्थ हैं। पारंपरिक क्लोनिंग द्वारा तैयार डीएनए के साथ यहां वर्णित प्रोटोकॉल के परिणामों की तुलना से प्रारूपों के बीच टेटआर दमन की डिग्री में एक छोटा लेकिन सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर सामने आया। हमने अनुमान लगाया कि वेक्टर डीएनए के लिए टेटआर का गैर-विशिष्ट बंधन देखे गए अंतर की व्याख्या कर सकता है। प्रयोगात्मक परिणामों से पता चला है कि रैखिक टेम्पलेट डीएनए के साथ प्रतिक्रियाओं में रैखिक वेक्टर डीएनए को जोड़ने से गैर-सांख्यिकीय महत्व में अंतर कम हो गया, हालांकि इसने अन्य कारकों से योगदान को खारिज नहीं किया, जैसे कि रैखिक बनाम परिपत्र प्रारूपों के लिए डीएनए हेलिक्स की आवधिकता में अंतर, जो बदले में, टेटआर बाइंडिंग को प्रभावित कर सकता है। एप्लिकेशन के आधार पर, रैखिक टेम्पलेट के उपयोग के लिए अतिरिक्त सत्यापन की आवश्यकता हो सकती है।

हम ध्वनिक तरल हैंडलिंग (चित्रा 4) का उपयोग करके सटीक वितरण के साथ संभावित मुद्दों पर प्रतिनिधि डेटा शामिल करते हैं। 1x फॉस्फेट बफ़र्ड सलाइन (PBS), pH 7.4 जिसमें 0.25 mM टारट्राज़िन डाई होती है, का उपयोग ध्वनिक तरल हैंडलर को प्रोग्रामिंग के दो तरीकों का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था ताकि वॉल्यूम >1 μL दिया जा सके। तरल वितरण के बाद, गंतव्य प्लेट को सील कर दिया गया और 1 मिनट के लिए 1,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, और 425 एनएम पर अवशोषण को प्लेट रीडर के साथ मापा गया। नौ प्रयोगों के प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं और आठ गंतव्य कुओं की श्रृंखला में अधिक सुसंगत वितरण प्रदर्शित करते हैं जब 5 μL स्थानांतरण को अलग-अलग 1 μL डिस्पेंसर में विभाजित किया जाता है। इन टिप्पणियों के आधार पर, यह अनुशंसा की जाती है कि >1 μL के स्थानांतरण को ≤1 μL के कई स्थानान्तरणों में विभाजित किया जाए। प्रोटोकॉल के इस महत्वपूर्ण पहलू के समस्या निवारण के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें.

Figure 1
चित्र 1: सेल-मुक्त अर्क में प्रमोटर भागों के मूल्यांकन के लिए एकल-दिवसीय वर्कफ़्लो। (A) एक रिपोर्टर को मूल्यांकन किए जाने वाले आनुवंशिक भागों वाले प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर-प्रवर्धित किया जाता है (2-5 घंटे)। (बी) सेल-मुक्त प्रतिक्रिया मिश्रण प्रोटोकॉल में विस्तृत रूप से तैयार किया जाता है और पीसीआर-प्रवर्धित टेम्पलेट्स (30 मिनट) के साथ 384-वेल प्लेट में वितरित किया जाता है। (सी) ध्वनिक तरल हैंडलिंग का उपयोग अतिरिक्त घटकों को वितरित करने के लिए किया जाता है, जिसमें दमनकारी प्रोटीन, प्रभावक अणु और कोई अन्य सशर्त प्रभावक (10 मिनट) शामिल हो सकते हैं। (डी) प्रत्येक प्रतिक्रिया से रिपोर्टर प्रोटीन अभिव्यक्ति को एक प्लेट रीडर (सीएफपीएस नुस्खा और निर्माण के आधार पर 2-16 घंटे) में मापा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पीसीआर प्रवर्धन द्वारा रिपोर्टर जीन में आनुवंशिक भागों को जोड़ने के लिए प्राइमर डिजाइन। (ए) एसएफजीएफपी रिपोर्टर जीन (हरा) को पीसीआर द्वारा एक आरबीएस (लाल) और टी 7 प्रमोटर (नीला) जोड़ने के लिए प्रवर्धित किया जाएगा। (बी) एसएफजीएफपी (हरा) और एक आरबीएस (लाल) को पीसीआर द्वारा एक टेटओ अनुक्रम (सोना) और टी 7 प्रमोटर (नीला) जोड़ने के लिए प्रवर्धित किया जाएगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: टी 7-संचालित अभिव्यक्ति के विनियमन पर टेटओ स्थिति का प्रभाव। टेटओ स्थिति के एक फ़ंक्शन के रूप में रैखिक और परिपत्र टेम्पलेट के लिए सामान्यीकृत अधिकतम दमन मान। निशान तीन प्रतिकृतियों के लिए औसत और मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े को क्रिएटिव कॉमन्स सीसी-बीवाई लाइसेंस के तहत मैकमैनस एट अल.32 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: ध्वनिक तरल हैंडलर के साथ तरल वितरण को मान्य करने के लिए टारट्राज़िन डाई का उपयोग करना। ब्लैक बार एक ही प्रोग्रामिंग कमांड का उपयोग करके 384-वेल प्लेट के लगातार आठ गंतव्य कुओं में से प्रत्येक में एक स्रोत से 5 μL टारट्राज़िन समाधान वितरित करने का संकेत देते हैं। ग्रे बार एकल प्रोग्रामिंग कमांड का उपयोग करके लगातार आठ गंतव्य कुओं में से प्रत्येक में एक स्रोत से 1 μL वितरित करने का संकेत देते हैं, और फिर प्रत्येक गंतव्य में वितरित कुल 5 μL के लिए इस चरण को चार बार दोहराते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

घटक का नाम 1 अभिक्रिया के लिए आयतन (μL) प्रतिक्रियाओं की X संख्या के 110% के लिए मात्रा (μL)
Q5 पीसीआर प्रीमिक्स 25
पानी 4
टेम्पलेट (1–3 ng/μL) 1
(यदि तयकिया गया है 1) फॉरवर्ड प्राइमर (5 μM) 0 या 10
(यदि तयकिया गया है 1) रिवर्स प्राइमर (5 μM) 0 या 10
मास्टर मिक्स कुल: 30 या 40
(यदि चर1) फॉरवर्ड प्राइमर (5 μM) 0 या 10
(यदि चर1) रिवर्स प्राइमर (5 μM) 0 या 10

तालिका 1: पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए अभिकर्मकों की तैयारी के लिए कार्यपत्रक। प्रतिक्रियाओं की इच्छित संख्या के आधार पर उपयोगकर्ताओं द्वारा दाएं कॉलम में मान भरे जा सकते हैं। 1 परिवर्तनीय प्राइमरों में पीसीआर प्रतिक्रिया में जोड़ा जाने वाला एक विशिष्ट हिस्सा होता है और यह फॉरवर्ड प्राइमर, रिवर्स प्राइमर या दोनों हो सकता है। फिक्स्ड प्राइमर एक हिस्सा नहीं जोड़ते हैं और फॉरवर्ड प्राइमर या रिवर्स प्राइमर हो सकते हैं लेकिन दोनों नहीं।

घटक का नाम 1 अभिक्रिया के लिए आयतन (μL) प्रतिक्रियाओं की X संख्या के 110% के लिए मात्रा (μL)
सेल निकालने 4.2
पूरक मिश्रण 3.3
GamS प्रोटीन (207 μM) 0.15
टेम्पलेट डीएनए (20 एनएम) 1
टी 7 पोलीमरेज़ (13 मिलीग्राम / 0.12
पानी 0.73 (यह संख्या भिन्न हो सकती है)
मास्टर मिक्स कुल: 9
दमनकारी प्रोटीन: 1

तालिका 2: सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं के लिए अभिकर्मकों की तैयारी के लिए कार्यपत्रक। प्रतिक्रियाओं की इच्छित संख्या के आधार पर उपयोगकर्ताओं द्वारा दाएं कॉलम में मान भरे जा सकते हैं।

अनुपूरक तालिका। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल सीएफपीएस द्वारा एक रिपोर्टर प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से आनुवंशिक भागों को स्क्रीन करने के लिए एक लागत प्रभावी और तेजी से साधन प्रदान करते हैं। अच्छी तरह से विशेषता वाले आनुवंशिक भाग उपयोगी कार्य के साथ अनुमानित आनुवंशिक सर्किट के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह पद्धति थ्रूपुट को बढ़ाती है और जीवित कोशिकाओं में काम करने की आवश्यकता को दूर करके नए आनुवंशिक भागों को स्क्रीन करने के लिए आवश्यक समय को कम करती है, जबकि कोशिका लाइसेट में प्रोटीन अभिव्यक्ति की चयापचय प्रक्रिया को बनाए रखते हुए सेलुलर वातावरण को प्रतिबिंबित करने वाली कार्यक्षमता को बनाए रखती है। हमारा प्रोटोकॉल प्राइमरों की प्राप्ति के बाद 1 दिन में किया जा सकता है (प्रतिक्रिया तैयारी के लिए ~ 2.5-6 घंटे, सीएफपीएस प्रतिक्रिया के लिए 2-16 घंटे; चित्रा 1), पारंपरिक क्लोनिंग के लिए कम से कम 3 दिनों की तुलना में (निर्माण असेंबली और परिवर्तन, क्लोन के अनुक्रम सत्यापन और मूल्यांकन के लिए कोशिकाओं के संवर्धन के लिए प्रत्येक 1 दिन)। हम आगे अनुमान लगाते हैं कि रैखिक डीएनए का उपयोग करके प्रति निर्माण लागत पारंपरिक क्लोनिंग का लगभग एक तिहाई है ($ 78 बनाम $ 237; अनुपूरक तालिका 1) विधियाँ। वाणिज्यिक संश्लेषण सेवाएं वर्तमान में आकार के आधार पर न्यूनतम 4 कार्य दिवसों को उद्धृत करती हैं, हालांकि उनकी हमारी विधि के समान लागत होगी यदि रैखिक टुकड़े सीधे सीएफपीएस ($ 78 बनाम $ 91) में जांच किए जाते हैं; हमने इस दृष्टिकोण को सत्यापित नहीं किया है। सीएफपीएस के साथ एक हिस्से का मूल्यांकन करने की लागत टेम्पलेट डीएनए की पीढ़ी की तुलना में छोटी है ($ 0.05 / प्रतिक्रिया22 बनाम $ 78 प्रति टेम्पलेट), हालांकि यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि थोक अभिकर्मकों और लाइसिस उपकरण के लिए स्टार्टअप लागत कम से कम कई हजार डॉलर है। ध्वनिक तरल हैंडलर का उपयोग केवल 0.5 μL40 तक छोटी मात्रा को सक्षम करके लागत में मामूली सुधार करता है; अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रतिक्रियाओं को तैयार करने के लिए समय की कमी है (~ 10 मिनट बनाम 1 घंटे तक, प्रतिक्रियाओं की संख्या के आधार पर), खासकर जब बड़ी संख्या में प्रतिक्रियाओं को तैयार करना इनक्यूबेशन से पहले विस्तारित समय के लिए तैयार प्रतिक्रिया की चिंताओं को बढ़ाता है।

तेजी से और लागत प्रभावी होने के बावजूद, सीएफपीएस प्रोटोटाइप विवो फ़ंक्शन में पर्याप्त रूप से भविष्यवाणी करता है, इस पर सीमाएं देखी जानी बाकी हैं। उदाहरण के लिए, सीएफपीएस प्रणाली के उत्पादन के दौरान मेजबान जीनोम को हटाने के कारण जीनोमिक डीएनए के साथ किसी भी क्रॉस-रिएक्टिविटी का पता नहीं लगाया जाएगा। इसके अलावा, घटक सांद्रता कोशिकाओं51 की तुलना में सीएफपीएस में परिमाण के 1-2 आदेश कम हो सकते हैं, जो विभिन्न मैक्रोमोलेक्यूलर भीड़ की स्थिति के परिणामस्वरूप कुछ भागों के व्यवहार को प्रभावित करने की संभावना है। इसके अलावा, विवो फ़ंक्शन में भविष्यवाणी करने के लिए रैखिक डीएनए की क्षमता सीमित हो सकती है, उदाहरण के लिए, जब डीएनए माध्यमिक संरचना एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। एक अंतिम सीमा यह है कि कार्यों के परीक्षण से पहले संरचनाएं अनुक्रम-सत्यापित नहीं होती हैं। ऐसे मामले हो सकते हैं जहां विशेषता वाला हिस्सा वास्तव में इच्छित सैद्धांतिक अनुक्रम के साथ संरेखित नहीं है। इन सभी सीमाओं को विवो एप्लिकेशन में इस विधि द्वारा स्क्रीन किए गए भागों के उप-समूह को मान्य करके कम किया जा सकता है।

हमने मूल रूप से हाइब्रिड टी 7-टेटओ प्रमोटर32 पर ऑपरेटर की स्थिति को बदलने के प्रभावों की जांच करने के लिए इस पद्धतिको विकसित किया था। हमने प्रोटोकॉल को यहां अधिक सामान्य प्रारूप में प्रस्तुत किया है, जैसे कि उन्हें प्रमोटरों, ऑपरेटरों, राइबोसोम बाइंडिंग अनुक्रमों, इन्सुलेटर और टर्मिनेटर पर लागू किया जा सकता है। इन आनुवंशिक भागों को पीसीआर द्वारा प्रत्येक डिजाइन के लिए प्राइमरों का उपयोग करके रिपोर्टर जीन के 5'या 3'अंत में जोड़ा जा सकता है, जिससे परीक्षण के लिए प्रत्येक संस्करण के संश्लेषण या क्लोनिंग की आवश्यकता को कम किया जा सकता है। परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पाद एक रिपोर्टर प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से मूल्यांकन के लिए टेम्पलेट डीएनए के रूप में काम करते हैं। हमारे काम में, यहां प्रदान किए गए आत्मीयता शुद्धिकरण प्रोटोकॉल का उपयोग टेटआर और जीएएमएस के लिए किया गया था। इसी प्रक्रिया का उपयोग अन्य दमनकारी, एक्टिवेटर्स, पोलीमरेज़, सिग्मा कारकों और रुचि के आनुवंशिक हिस्से से जुड़े अन्य प्रोटीनों की अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण के लिए किया जा सकता है, हालांकि वांछित प्रोटीन व्यक्त करने के लिए संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है। सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं में इन प्रोटीनों का शुद्धिकरण और अनुमापन एक विशेष आनुवंशिक भाग के अधिक विस्तृत लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है। अंत में, कई वैकल्पिक सीएफपीएस प्रोटोकॉल मौजूद हैं और प्रत्येक को कार्यप्रणाली के भागों की स्क्रीनिंग भाग के लिए उत्तरदायी होना चाहिए। एक उदाहरण के रूप में, हम इस प्रोटोकॉल में डायलिसिस चरण को शामिल नहीं करते हैं, जिसे दूसरों ने देशी जीवाणु प्रमोटरोंसे अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण पाया है। सीएफपीएस के अंतर्निहित घटक घटकों की सांद्रता को बदलना भी संभव है। तरल हैंडलिंग का उपयोग थ्रूपुट को बढ़ाकरऔर आवश्यक सामग्रियों को कम करके असंख्य स्थितियों का परीक्षण करने की क्षमता को बढ़ाता है।

एक क्षेत्र जिसे महत्वपूर्ण समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है, वह ध्वनिक तरल हैंडलर का अनुकूलन है। ध्वनिक तरल हैंडलर डिस्पेंसिंग को स्थानांतरित किए जाने वाले प्रत्येक घटक के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए और डेटा एकत्र करने से पहले उचित वितरण और प्रजनन क्षमता को सत्यापित करने के लिए नियंत्रण चलाने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। आदर्श स्रोत प्लेट प्रकार और तरल वर्ग सेटिंग वितरित किए जाने वाले विशिष्ट तरल और इसके घटकों पर निर्भर करेगी। डीएनए को वितरित करने के लिए अमाइन-लेपित प्लेटों का उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि अमाइन कोटिंग डीएनए के साथ बातचीत कर सकती है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुछ घटकों की उच्च सांद्रता को वितरित करने की क्षमता ध्वनिक तरल हैंडलर मॉडल पर निर्भर हो सकती है। सफल बूंद गठन की कल्पना करने के लिए पन्नी प्लेट सील पर वितरण करके एक परीक्षण तरल हस्तांतरण आयोजित किया जा सकता है; हालाँकि, यह परीक्षण सीमित जानकारी प्रदान करता है और विभिन्न सेटिंग्स से बूंदें समान दिखाई दे सकती हैं। पानी में घुलनशील डाई का उपयोग, जैसे टारट्राज़िन, का उपयोग किसी दिए गए सेटिंग या वर्कफ़्लो के साथ सही मात्रा को अधिक सटीक रूप से सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है ( प्रतिनिधि परिणाम देखें)। तरल हस्तांतरण की इष्टतम प्रोग्रामिंग भी उत्पन्न डेटा की सटीकता और स्थिरता को प्रभावित कर सकती है; एक स्रोत से एक गंतव्य तक >1 μL के स्थानांतरण के लिए, हमने पाया है कि व्यवस्थित अच्छी तरह से अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए ≤1 μL के अनुक्रमिक हस्तांतरण को प्रोग्राम किया जाना चाहिए (चित्रा 4)। अंत में, सैद्धांतिक और वास्तविक स्रोत अच्छी तरह से मृत मात्रा स्रोत प्लेट प्रकार, तरल वर्ग सेटिंग और विशिष्ट तरल के घटकों के आधार पर नाटकीय रूप से भिन्न हो सकती है; एक प्रोग्राम चलाने से पहले अच्छी तरह से वॉल्यूम का आकलन करने के लिए ध्वनिक तरल हैंडलर सर्वेक्षण फ़ंक्शन का उपयोग करने से यह पता लगाने में मदद मिल सकती है कि उपकरण किसी विशेष तरल को कितनी सटीक रूप से मापने में सक्षम है।

विभिन्न उपयोगकर्ताओं, सामग्री के बैच, प्लेट रीडर और प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों की तुलना करते समय सीएफपीएस प्रतिक्रिया प्रदर्शन भिन्न हो सकताहै। ऐसे उदाहरणों के लिए जहां आनुवंशिक सर्किट को प्रोटोटाइप करते समय ऐसी तुलना की आवश्यकता होती है, हम प्रयोगात्मक सेटअप में परिणामों को सामान्य करने में मदद करने के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया प्लेट में मानक संवैधानिक प्रमोटरों के साथ आंतरिक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं को शामिल करने की सलाह देते हैं। डीएनए तैयार करने की विधि भी सीएफपीएस गतिविधि में प्रमुख योगदान दे सकती है; इथेनॉल वर्षा चरण को शामिल करने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, इष्टतम प्रतिक्रिया संरचना अर्क34 के बैच से भिन्न हो सकती है। इष्टतम मैग्नीशियम ग्लूटामेट और पोटेशियम ग्लूटामेट सांद्रता, विशेष रूप से, बैच42 या प्रमोटर या रिपोर्टर प्रोटीन के साथ भिन्न दिखाई गईहै। प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इष्टतम स्थितियों को निर्धारित करने के लिए प्रत्येक घटक की कई सांद्रता प्रति आनुवंशिक निर्माण और प्रति सेल अर्क तैयारी में स्क्रीनिंग द्वारा इन घटकों की सांद्रता को अनुकूलित किया जाना चाहिए। अंत में, लगातार सीएफपीएस प्रतिक्रिया प्रदर्शन के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं में प्रत्येक अभिकर्मक घटक की तैयारी में पूरी तरह से मिश्रण, सावधानीपूर्वक पाइपिंग और स्थिरता शामिल है।

अलग-अलग भागों के लक्षण वर्णन से परे, एक ही विधि का उपयोग उन भागों के संयोजन को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है जो जटिल सर्किट बनाते हैं, जैसे कि लॉजिक सर्किट16 या ऑसिलेटर52,53। इस पद्धति को महामारी विज्ञान निदान 54,55,56,57 या खतरे का पता लगाने और परिमाणीकरण 3,58,59 में अनुप्रयोगों के लिए बायोसेंसर की स्क्रीनिंग और अनुकूलन के लिए भी लागू किया जा सकता है। एआई-संचालित तकनीकों जैसे कि सक्रिय शिक्षण34 के अनुप्रयोग को जटिल जैविक डिजाइन स्थानों की तेजी से खोज को चलाने के लिए इस विधि की उच्च-थ्रूपुट प्रकृति के साथ भी जोड़ा जा सकता है। अंततः, हम सिंथेटिक जीव विज्ञान में नए आनुवंशिक डिजाइनों के लिए त्वरित विकास समय का समर्थन करने वाले इस दृष्टिकोण की कल्पना करते हैं।

Disclosures

आरएमएम की टिएरा बायोसाइंसेज में वित्तीय हिस्सेदारी है, जो एक निजी कंपनी है जो प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्क्रीनिंग के लिए इस लेख में वर्णित सेल-मुक्त प्रौद्योगिकियों का उपयोग करती है।

अन्य लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम विज्ञान और प्रौद्योगिकी प्राथमिकताओं की उन्नति के लिए रक्षा सचिव के एप्लाइड रिसर्च के कार्यालय द्वारा संभव बनाया गया था। हम उपयोग किए गए एसएफजीएफपी के स्टॉक प्रदान करने के लिए स्कॉट वाल्पर (नौसेना अनुसंधान प्रयोगशाला) और सेल-मुक्त प्रणालियों के साथ प्रोटोटाइप और ध्वनिक तरल हैंडलिंग के संबंधित समस्या निवारण से संबंधित फलदायी चर्चाओं के लिए ज़ैचरी सन और एबेल चियाओ (टिएरा बायोसाइंसेज) को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2x YT medium Sigma-Aldrich Y2377-250G Alternative to making 2xYT media
Agar Bacto 214010 For plating cells
Chromatography column (5 cm diameter) BIO-RAD 731-1550 Used for protein purification.
Destination plate Thermo Scientific Nunc plate 142761 For CFPS reactions
DMSO Sigma-Aldrich D2650 For dialysis buffer
DpnI NEB R0176L For digestion of plasmid templates
DTT Roche 20871723 S30 Buffer B
E. coli BL21(DE3) Rosetta2 Novagen 70954 Cell line used for production of lysate and purified proteins
Echo acoustic liquid handler Labcyte 525 Acoustic liquid handler
French pressure cell Thermo Spectronic FA-078 For lysing cells for CFPS
Imidazole Sigma-Aldrich 56750 For buffers
Impermeable plastic sealable lid Thermo 232702 Plate seal
IPTG RPI I56000-25.0 Used for protein induction.
K-Glu Sigma-Aldrich g1501-500G S30 Buffer B
Labcyte Echo source plate Labcyte PL-05525 For use with Echo acoustic liquid handler
Mg-Glu Sigma-Aldrich 49605-250G S30 Buffer B
NaCl Sigma-Aldrich S7653-250G For buffers
NaHPO4 Sigma-Aldrich 71505 For dialysis buffer
NaOH Mallinckrodt Chemicals 7708-10 For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899
Ni-NTA resin Invitrogen R901-15 For production of purified proteins
PCR H2O Ambion AM9937 PCR of linear templates
Plate Reader BioTek H10 Plate reader used
Q5 PCR Master Mix NEB M0494S PCR of linear templates
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28606 PCR of linear templates
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28004 PCR of linear templates
QSonica Ultrasonic Processor Qsonica Q700 Cell disruption during protein purification
RTS Amino Acid Sampler biotechrabbit BR1401801 Updated supplier from Sun et al.
Tris MP 819623 S30 Buffer B
Tris-Cl Sigma-Aldrich T5941 For buffers
Tryptone Fluka T7293 For making 2xYT media
Yeast Extract Bacto 212750 For making 2xYT media

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McManus, J. B., Bernhards, C. B.,… More

McManus, J. B., Bernhards, C. B., Sharpes, C. E., Garcia, D. C., Cole, S. D., Murray, R. M., Emanuel, P. A., Lux, M. W. Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems. J. Vis. Exp. (174), e62816, doi:10.3791/62816 (2021).

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