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Article de méthode

Imagerie de l’adhésion moléculaire dans le laminage cellulaire par essai d’empreinte d’adhérence

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DOI :

10.3791/63013

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27 septembre 2021

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1Department of Chemistry, The University of British Columbia, 2Biochemistry and Molecular Biology, The University of British Columbia, 3Faculty of Medicine, The University of British Columbia

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole présente les procédures expérimentales pour effectuer le test d’empreinte d’adhérence afin d’imager les événements d’adhérence pendant l’adhésion rapide des cellules.

Résumé

L’adhésion roulante, facilitée par des interactions médiées par la sélection, est une motilité passive très dynamique dans le recrutement des leucocytes sur le site de l’inflammation. Ce phénomène se produit dans les veinules postcapillaires, où le flux sanguin pousse les leucocytes dans un mouvement roulant sur les cellules endothéliales. Un laminage stable nécessite un équilibre délicat entre la formation de liaisons d’adhérence et leur dissociation mécanique, permettant à la cellule de rester attachée à la surface tout en roulant dans le sens de l’écoulement. Contrairement à d’autres processus d’adhérence se produisant dans des environnements relativement statiques, l’adhérence au roulement est très dynamique car les cellules de laminage se déplacent sur des milliers de microns à des dizaines de microns par seconde. Par conséquent, les méthodes de mécanobiologie conventionnelles telles que la microscopie à force de traction ne conviennent pas à la mesure des événements d’adhésion individuels et des forces moléculaires associées en raison de la courte échelle de temps et de la sensibilité élevée requises. Ici, nous décrivons notre dernière implémentation du test d’empreinte d’adhérence pour imager les interactions P-selectin: PSGL-1 dans l’adhésion laminée au niveau moléculaire. Cette méthode utilise des attaches de jauge de tension irréversibles à base d’ADN pour produire un historique permanent des événements d’adhésion moléculaire sous la forme de pistes de fluorescence. Ces pistes peuvent être imagées de deux manières: (1) assembler des milliers d’images limitées par diffraction pour produire un grand champ de vision, permettant l’extraction de l’empreinte d’adhérence de chaque cellule roulante sur des milliers de microns de longueur, (2) effectuer DNA-PAINT pour reconstruire des images super-résolution des pistes de fluorescence dans un petit champ de vision. Dans cette étude, le test d’empreinte d’adhérence a été utilisé pour étudier les cellules HL-60 roulant à différentes contraintes de cisaillement. Ce faisant, nous avons pu imager la distribution spatiale de l’interaction P-selectin: PSGL-1 et mieux comprendre leurs forces moléculaires grâce à l’intensité de la fluorescence. Ainsi, cette méthode fournit les bases de l’étude quantitative des différentes interactions cellule-surface impliquées dans l’adhésion au roulement au niveau moléculaire.

Introduction

La cascade d’adhésion roulante décrit comment les cellules circulantes s’attachent et roulent le long de la paroi des vaisseaux sanguins1. Le laminage passif est principalement médié par les sélectines, une classe majeure de molécules d’adhésion cellulaire (MCA)1. Sous le flux de cisaillement du sang, les leucocytes exprimant le ligand 1 de la glycoprotéine P-sélectine (PSGL-1) forment des liaisons hautement transitoires avec la P-sélectine, qui peuvent être exprimées à la surface des cellules endothéliales enflammées. Ce processus est essentiel pour que les leucocytes migrent vers un site d’inflammation2. En outre, PSGL-1 est également un récepteur mécanosensible capable de déclencher l’étape d’adhésion ferme ultérieure de la cascade d’adhésion roulante lors de son engagement avec P-selectin3.

Les mutations génétiques affectant la fonction CAM peuvent affecter gravement le système immunitaire, comme dans la maladie rare du déficit en adhésion leucocytaire (LAD), où le dysfonctionnement des molécules d’adhésion médiant le roulement conduit à des individus gravement immunodéprimés4,5,6. En outre, il a été démontré que les cellules tumorales circulantes migrent à la suite d’un processus de roulement similaire, conduisant à des métastases7,8. Cependant, parce que le laminage cellulaire est rapide et dynamique, les méthodes expérimentales conventionnelles de mécanobiologie ne conviennent pas à l’étude des interactions moléculaires pendant le laminage cellulaire. Bien que les méthodes de manipulation à cellule unique et à molécule unique telles que la microscopie à force atomique et la pince optique aient pu étudier les interactions moléculaires telles que l’interaction dépendante de la force de la P-sélectine avec PSGL-1 au niveau de la molécule unique9, elles ne conviennent pas à l’étude des événements d’adhésion en direct pendant le roulement cellulaire. De plus, l’interaction caractérisée in vitro ne peut pas répondre directement à la question de l’adhésion moléculaire in vivo. Par exemple, quelle plage de tension moléculaire est biologiquement pertinente lorsque les cellules fonctionnent dans leur environnement natif? Les méthodes de calcul telles que la simulation de la dynamique des adhésifs10 ou le modèle simple à l’état d’équilibre11 ont capturé certains détails moléculaires et leur influence sur le comportement de roulement, mais dépendent fortement de la précision des paramètres et des hypothèses de modélisation. D’autres techniques telles que la microscopie à force de traction peuvent détecter les forces lors de la migration cellulaire, mais ne fournissent pas une résolution spatiale suffisante ou des informations quantitatives sur la tension moléculaire. Aucune de ces techniques ne peut fournir d’observations expérimentales directes de la dynamique temporelle, de la distribution spatiale et de l’hétérogénéité de magnitude des forces moléculaires, qui sont directement liées à la fonction et au comportement des cellules dans leur environnement natif.

Par conséquent, la mise en œuvre d’un capteur de force moléculaire capable de mesurer avec précision les interactions médiées par la sélection est cruciale pour améliorer notre compréhension de l’adhérence au roulement. Nous décrivons ici le protocole pour le test d’empreinte d’adhérence12 où des billes revêtues de PSGL-1 sont roulées sur une surface présentant des attaches de jauge de tension fonctionnalisées p-selectin (TGT)13. Ces TGT sont des capteurs de force irréversibles basés sur l’ADN qui entraînent un historique permanent des événements de rupture sous forme de lecture de fluorescence. Ceci est réalisé par la rupture du TGT (dsDNA), puis le marquage ultérieur du TGT rompu (ssDNA) avec un brin complémentaire marqué par fluorescence. L’un des principaux avantages de ce système est sa compatibilité avec l’imagerie à diffraction limitée et l’imagerie à super résolution. Le brin complémentaire marqué par fluorescence peut être lié de manière permanente (>12 pb) pour l’imagerie à diffraction limitée ou transitoirement lié (7-9 pb) pour l’imagerie à super-résolution par DNA PAINT. Il s’agit d’un système idéal pour étudier l’adhérence au laminage car les TGT sont rompus pendant le laminage actif, mais la lecture de fluorescence est analysée après le laminage. Les deux méthodes d’imagerie offrent également à l’utilisateur plus de liberté pour étudier l’adhérence au roulement. En règle générale, l’imagerie à diffraction limitée est utile pour extraire la force de rupture moléculaire par l’intensité de fluorescence13, tandis que l’imagerie à super-résolution permet une analyse quantitative de la densité des récepteurs. Avec la capacité d’étudier ces propriétés d’adhérence au laminage, cette approche fournit une plate-forme prometteuse pour comprendre le mécanisme de régulation de la force sur l’adhésion moléculaire des cellules de laminage sous écoulement de cisaillement.

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Protocole

1. Marquage et hybridation des oligonucléotides

  1. Réduction des liaisons disulfure de protéine G
    1. Dissoudre 10 mg de protéine G (ProtG) dans 1 mL d’eau ultrapure.
      REMARQUE: La protéine G ici est modifiée avec un seul résidu de cystéine à l’extrémité C et une étiquette poly-histidine N-terminus.
    2. Échange tampon ≥20 μL de ProtG (10 mg/mL) en 1x PBS (pH 7,2) avec une colonne P6.
    3. Mesurer la concentration en protéines après échange de tampon.
      REMARQUE: Concentration typique de 7-8 mg / mL.
    4. Préparer 120 mM de Tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) en dissolvant 3 mg de TCEP dans 90 μL de 1x PBS (pH 7,2) suivi de 10 μL de 0,5 M EDTA.
      REMARQUE: TCEP doit être fraîchement préparé.
    5. Ajouter 4 μL de TCEP de 120 mM (480 nmol) à 20 μL de ProtG (4-5 nmol).
      REMARQUE: Visez un rapport molaire d’environ 100: 1 TCEP à la protéine.
    6. Laissez la réaction se poursuivre pendant 30 min à température ambiante (RT).
    7. Enlevez l’excès de TCEP du ProtG réduit avec une colonne P6 (tampon échangé en 1x PBS, pH 7,2).
    8. Mesurez la concentration du ProtG réduit avec un spectrophotomètre UV/Vis et enregistrez les spectres.
      REMARQUE: Concentration typique de 3,5-4,5 mg / mL.
  2. Réaction d’ADNSs marqué aux amines avec Sulfo-SMCC
    1. Dissoudre l’ADNSs amine marqué (amine-ADNS) dans de l’eau sans nucléase à une concentration de 1 mM. Vérifiez la concentration du brin à l’aide d’un spectrophotomètre UV/Vis.
    2. Préparer une solution de sulfo-SMCC de 11,5 mM (un réticulant hétéro-bifonctionnel avec ester de sulfo-NHS et maléimide) fraîche en dissolvant 2 mg de sulfo-SMCC dans 400 μL d’eau ultrapure et de vortex à mélanger.
    3. Ajouter 6 μL de 1 mM d’amine-SsDNA (6 nmol) à 5,2 μL de 11,5 mM de sulfo-SMCC (60 nmol) et 88,8 μL de 1x PBS (pH 7,2). Vortex pendant 5 s suivi d’une centrifugation à 8600 x g pendant 3 min.
    4. Laissez la réaction se poursuivre pendant 30 min à RT.
    5. Éliminer l’excès de sulfo-SMCC de l’ADNs-amine conjugué au CCSM (mal-ADNS) à l’aide d’une colonne P6 (tampon échangé en 1x PBS, pH 7,2).
    6. Mesurez la concentration du mal-ssDNA avec un spectrophotomètre UV/Vis et enregistrez les spectres.
      REMARQUE: Concentration typique de 35-45 μM.
  3. Conjugaison ProtG-ssDNA
    1. Ajouter 21 μL de ProtG réduit de 4,5 mg/mL (3 nmol) au mal-ssDNA (~4-5 nmol).
      REMARQUE: Les volumes et les concentrations sont ici des valeurs typiques. Ajuster en fonction de la mesure expérimentale individuelle. Assurez-vous toujours d’une quantité excessive de mal-ssDNA par rapport à ProtG dans un rapport de ~ 1,5: 1.
    2. Vortex pendant 5 s et laisser la réaction se dérouler pendant 3 h à RT.
  4. Purification et caractérisation de l’ADNS ProtG-ssDNA
    1. Purifier le ProtG-ssDNA conjugué grâce à son isolement avec des billes magnétiques d’acide nickel-nitrilotriacétique (Ni-NTA).
    2. Retirer l’excès d’imidazole (tampon d’élution Ni-NTA) du produit à l’aide d’une colonne P6 (tampon échangé en 1x PBS, pH 7,2).
      NOTE: Cette étape est essentielle pour quantifier la conjugaison, car l’imidazole a une absorption significative à 280 nm.
    3. Utilisez un spectrophotomètre UV/Vis pour enregistrer les spectres du produit ProtG-ssDNA ainsi que le tampon d’élution Ni-NTA (1x).
      REMARQUE: L’absorbance typique de ProtG-ssDNA à 260 nm et 280 nm est de 0,8 et 0,6, respectivement.
    4. Pour déterminer l’efficacité de conjugaison et le rapport de ProtG à ssDNA, utilisez le script MATLAB écrit sur mesure (fichier de codage supplémentaire 1) pour décomposer le spectre du produit final en fonction des trois spectres collectés précédemment (ProtG, BRIN SMCC, tampon d’élution de billes Ni-NTA).
      REMARQUE : En bref, le code fonctionne comme décrit dans les étapes 1.4.5 à 1.4.8. La concentration typique est de 4 μM de ProtG-ssDNA avec ProtG et ssDNA à un rapport molaire d’environ 1:1 (Figure 2A).
    5. Entrez ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA bead elution buffer et les spectres ProtG-ssDNA UV/Vis dans le script MATLAB
    6. Effectuer une minimisation non linéaire multidimensionnelle sans contrainte pour reconstruire les spectres ProtG-ssDNA à partir des spectres sources (spectres tampon d’élution protG, BRIN SMCC et Tampon d’élution de perle Ni-NTA)
      REMARQUE: La fonction de minimisation produit trois facteurs de transformation, un pour chaque spectre source.
    7. Reconstruisez les spectres ProtG-ssDNA en multipliant les spectres par leur facteur correspondant et en combinant les spectres sources transformés.
    8. Multiplier la concentration initiale du Brin ProtG et du brin SMCC par les facteurs de transformation correspondants pour déterminer les concentrations du brin SMCC et du ProtG dans le produit ProtG-ssDNA.
    9. (FACULTATIF) Exécutez PAGE natif conformément à la Figure 2B pour vous assurer que chaque composant et étape fonctionne comme prévu.
  5. Hybridation TGT
    1. Hybrider ProtG-ssDNA (brin supérieur) avec le brin inférieur biotinylé à un rapport molaire de 1,2:1 avec des concentrations de 240 nM et 200 nM respectivement dans le tampon T50M5 (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2) pour hybrider la construction TGT complète. Laisser hybrider à RT ≥1 h.

2. PEGylation de surface

  1. Nettoyage des surfaces
    1. Nettoyez une fiole d’Erlenmeyer et deux pots de coloration pour chaque 8 couvercles. Remplissez chaque récipient avec une solution KOH de 1 M et soniquez pendant 1 h à RT. Lavez soigneusement chaque récipient avec de l’eau ultrapure et séchez-le avec du N2 ou dans un four.
      REMARQUE: Remplissez le KOH en haut pour toucher le couvercle, afin qu’ils soient également nettoyés.
    2. Rincez soigneusement chaque couvercle avec de l’eau ultrapure et placez-les dans l’un des pots de coloration nettoyés.
      REMARQUE: Assurez-vous qu’ils ne sont pas collés les uns aux autres ou à la paroi des pots de coloration.
    3. Dans une hotte, préparer fraîchement une solution de piranha en ajoutant 30 mL de peroxyde d’hydrogène (30%) à 90 mL d’acide sulfurique concentré (95%-98%) dans un bécher de 250 mL.
      ATTENTION : L’acide sulfurique concentré est très corrosif. Ajouter le peroxyde d’hydrogène très lentement à l’acide sulfurique et faire tourbillonner soigneusement pour mélanger.
    4. Immergez complètement les couvercles dans le pot de coloration avec la solution de piranha. Laissez les couvercles dans le piranha pendant 30 minutes dans la hotte.
      ATTENTION : Refroidir la solution de piranha à une température maximale de 80 °C avant de la verser pour éviter de fissurer le pot de coloration.
    5. Jeter la solution de piranha dans un bécher de 1000 ml et neutraliser avec le KOH de 1 M du nettoyage du verre.
    6. (FACULTATIF) Répétez le nettoyage du piranha (étapes 2.1.3-2.1.5) avec une solution de piranha fraîche.
    7. Rincez les couvercles avec de grandes quantités d’eau ultrapure pour éliminer toute solution résiduelle de piranha. Secouez doucement le pot de coloration à chaque levée pour faciliter l’élimination (10 rinçages sont recommandés).
    8. Rincez les couvercles avec du méthanol 3 fois pour éliminer l’eau de la surface du couvercle et garder les couvercles immergés dans le méthanol.
  2. Silanisation de surface
    1. Préparer une solution d’aminosilane à 1 % en mélangeant soigneusement 94 mL de méthanol, 1 mL d’aminosilane et 5 mL d’acide acétique glacial dans la fiole d’Erlenmeyer nettoyée et séchée. Verser dans le deuxième pot de coloration nettoyé et séché14.
    2. Transférer les couvercles immergés sous la solution de méthanol dans le pot de coloration contenant une solution d’aminosilane à 1% et garder le pot couvert.
      REMARQUE: Ne laissez pas les couvercles sécher pendant le transfert à l’aminosilane pour limiter l’exposition de la surface du verre à l’air.
    3. Incuber le pot de coloration contenant des couvercles dans de l’aminosilane pendant 1 h à 70 °C dans un four15.
    4. Jetez soigneusement la solution d’aminosilane dans un récipient à déchets séparé et rincez les couvercles dans le pot de coloration avec du méthanol 5 fois pour éliminer la solution d’aminosilane.
    5. Rincez les couvercles dans le pot de coloration avec de l’eau ultrapure 5 fois et séchez-les avec du N2.
    6. Cuire les couvercles séchés dans le pot de coloration dans un four à 110 °C pendant 20 min. Laissez les couvercles refroidir à RT, puis placez-les sur le rack PEGylation.
      REMARQUE: Couvrez le pot de coloration avec un couvercle pendant la cuisson pour minimiser les dépôts particuliers et chimiques sur la surface15.
  3. Préparation de la solution PEG
    1. Décongeler le PEG (polyéthylène glycol) et le PEG-biotine en RT pendant environ 30 min.
      REMARQUE: Cette étape minimise la condensation de l’humidité qui peut dégrader l’ester NHS sur PEG.
    2. Faire tampon PEG en ajoutant 84 mg de bicarbonate de sodium à 10 mL d’eau ultrapure. Cette formulation doit fournir un tampon à pH 8,4.
    3. Pour 8 coverslips, chacun avec un côté PEGylated avec 20:1 PEG:PEG-biotine: mesurez 100 mg de PEG et 5 mg de PEG-biotine pour ajouter à 400 μL de tampon PEG. Vortex la solution pendant 30 s et centrifuger pendant 1 min à la vitesse maximale (≥18000 x g).
      REMARQUE: Cette étape est sensible au temps, car l’hydrolyse de l’ester SVA NHS commence immédiatement et a une demi-vie de 34 minutes à pH 8,0, avec une demi-vie plus courte à pH 8,4.
  4. Incubation de PEG et stockage par couvercle
    1. Installez la chambre d’humidité et placez les couvercles à l’intérieur.
    2. Ajouter 90 μL de solution de PEG à un couvercle dans la chambre d’humidité et placer un deuxième couvercle sur le dessus de la solution de PEG à l’aide d’une pince à pince à couvercle pour répartir uniformément la solution de PEG.
    3. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans la solution tombée sur le couvercle. Abaissez une extrémité du deuxième couvercle sur le premier couvercle et laissez tomber lentement l’autre extrémité afin qu’il n’y ait pas de bulles prises en sandwich entre les couvercles.
      REMARQUE: Les bulles entraîneront une mauvaise peGylated de certaines zones.
    4. Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les couvercles aient du PEG (c.-à-d. 8 couvercles = 4 sandwichs PEG). Incuber les solutions PEG pendant la nuit (~12 h) à RT dans une chambre d’humidité dans l’obscurité16.
    5. Séparez les paires de couvercles et placez-les dans un pot à taches. Notez les côtés PEGylated.
    6. Rincez soigneusement les couvercles à l’eau ultrapure et séchez-les avec du N2.
      REMARQUE: Tenez les couvercles avec une pince à épiler et soufflez du N2 sur la surface vers la pince à épiler pour empêcher les contaminants de sécher sur la surface.
    7. Marquez le côté non PEGylated avec un point dans un coin à l’aide d’un marqueur permanent ou d’un stylo diamanté.
    8. Placez 2 couvercles PEGylated dans des tubes postaux avec les côtés PEGylated face à face pour aider à identifier le côté PEGylated avant utilisation.
    9. Aspirez le tube pendant 5 min et remplissez-le avec du N2. Scellez le tube avec un parafilm.
    10. Conservez les couvercles PEGylated à -20 °C dans les tubes postaux scellés jusqu’à 6 mois.
      REMARQUE: Réchauffez les tubes de stockage à RT avant l’assemblage de la puce. La condensation sur les couvercles pendant l’étanchéité provoquera des fuites.

3. Préparation de la chambre d’écoulement

  1. Assemblage de puces
    1. Étaler finement une petite quantité d’époxy des deux côtés du ruban adhésif double face avec une lame de rasoir.
      REMARQUE: Trop d’époxy peut se propager dans le canal pendant l’assemblage.
    2. Découpe au laser du ruban enduit d’époxy pour créer 4 canaux. Créez la puce d’écoulement en prenant en sandwich le ruban époxy entre une glissière à 4 trous et un couvercle PEG (Figure 1A).
    3. À l’aide d’une pointe de pipette, appliquez une légère pression sur toute la longueur des canaux pour créer une bonne étanchéité. Durcir l’époxy pendant ≥1 h.
      REMARQUE: Ne cisaillez pas le verre pour éviter de glisser contre l’époxy.
  2. Assemblée de la Chambre
    1. Alignez la puce de manière à ce que l’ouverture de chaque canal soit positionnée au centre de l’adaptateur (Figure 1A). Placez deux entretoises en acrylique transparent sur le dessus de la puce, appliquez une pression ferme au milieu du bloc et vissez deux vis 4-40 aux extrémités de chaque entretoise.
      REMARQUE: Ne forcez pas la vis ou appuyez trop fort sur les entretoises, sinon la puce pourrait se fissurer.
    2. De l’autre côté du support, vissez les entrées dans les trous filetés. Surveillez l’état d’étanchéité à travers le bloc acrylique transparent.
    3. Lorsque le tube entre en contact avec l’ouverture de la puce, scellez la connexion en tordant doucement le tube dans le sens des aiguilles d’une montre.
      REMARQUE: Les entrées trop serrées peuvent provoquer un blocage de l’écoulement, tandis que les contacts lâches provoqueront des fuites.

4. Préparation de la surface

REMARQUE : Reportez-vous à la Figure 1B pour le flux de travail global.

  1. Agents bloquants pour empêcher la liaison non spécifique
    1. Utilisez une pipette pour faire couler 200 μL de tampon de lavage (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 et 2 mM CaCl2, 0,05 % Tween 20) dans la chambre pour vérifier les fuites. Si des bulles se forment dans le canal, poussez agressivement 200 μL supplémentaires pour éliminer les bulles.
      REMARQUE: Les grosses bulles d’air non enlevées à cette étape peuvent déloger et détruire la fonctionnalisation de la surface plus tard.
    2. Ajouter 40 μL de BSA (1 % p/v) à la chambre d’écoulement pour éviter toute liaison non spécifique et incuber pendant 10 min.
    3. Assurez-vous d’ajouter suffisamment de volume pendant chaque période d’incubation pour remplir les chambres d’écoulement et former des gouttelettes aux entrées et aux sorties. Ajustez les volumes d’incubation en conséquence et effectuez toutes les incubations dans une chambre d’humidité.
    4. Ajouter 40 μL de Tween 20 (5 % v/v) à la chambre d’écoulement. Incuber pendant 10 min pour réduire davantage la liaison non spécifique.
    5. (FACULTATIF) Vérifiez que la surface n’est passivée adéquatement en faisant couler des billes de polystyrène à travers le canal. Ajouter 40 μL de billes de polystyrène revêtues de ProtG (0,01 % p/v) et imager à l’aide d’un microscope à fond noir avec objectif 10x. Si les perles n’adhèrent pas à la surface, passez à l’étape suivante.
    6. Lavez le canal avec 200 μL de tampon de lavage pour éliminer tous les agents de passivation.
  2. Fonctionnalisation de la surface de la chambre
    1. Ajouter 40 μL de streptavidine (100 μg/mL) dans la chambre d’écoulement et incuber pendant 20 min. Ensuite, lavez avec 200 μL de tampon de lavage.
    2. Ajouter 40 μL de ProtG-TGT hybridé (100 nM) à la chambre d’écoulement et incuber pendant 20 min. Ensuite, lavez avec un tampon de lavage de 200 μL.
    3. Ajouter 40 μL de brin supérieur ProtG-TGT (100 nM) pendant 20 min pour compléter tout brin inférieur TGT non hybridé sur la surface. Laver avec 200 μL de tampon de lavage.
    4. Ajouter 40 μL de P-selectin-Fc (10 μg/mL) dans la chambre d’écoulement et incuber pendant 60 min. Ensuite, lavez avec 200 μL de tampon de lavage.
      REMARQUE: La durée d’incubation est critique.

5. Expérience et imagerie

  1. Configuration du système de flux
    1. Remplissez une seringue en verre de 5 mL avec le tampon de laminage (HBSS avec 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 0,1% BSA). Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la seringue en tapotant les côtés de la seringue pour déloger les bulles et en les poussant vers l’extérieur lorsqu’elles flottent vers la pointe.
    2. Insérez une aiguille stérile (26 G, longueur de 5/8 pouce) dans un tube en polyéthylène d’environ 200 mm (I.D: 0,38 mm; O.D: 1,09 mm) et connectez l’aiguille à la seringue en verre.
      REMARQUE: Assurez-vous qu’aucun air n’est emprisonné n’importe où dans le connecteur de l’aiguille.
    3. Fixez la seringue sur la pompe à seringue et inclinez la pompe à seringue de manière à ce que le côté du piston soit surélevé pour empêcher les bulles d’air de pénétrer dans le canal. Insérez l’extrémité du tube dans l’entrée de la chambre d’écoulement.
      REMARQUE: Assurez-vous du contact liquide-liquide lors de la connexion en déposant des gouttelettes sur les entrées et en ayant des gouttelettes à l’extrémité du tuyau de la seringue. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air ne pénètre dans le canal en laissant une petite goutte se former à l’extrémité du tube de la seringue avant de l’insérer dans l’entrée.
    4. Insérez une extrémité d’un autre 200 mm du tube en polyéthylène dans la sortie, et l’autre extrémité immergée dans un bécher à déchets.
  2. Configuration pour le roulement de cellules
    1. Cultiver des cellules HL-60 dans des flacons de culture ventilés de 25 cm2 dans des milieux IMDM complétés par 20% de sérum bovin fœtal et 1% d’antibiotiques à 37 °C avec 5% de CO2. Maintenir des densités cellulaires comprises entre 1 x 105-2 × 106 cellules/mL.
    2. (FACULTATIF) Différencier les cellules HL-60 dans un milieu IMDM complet contenant 1,25% de DMSO à une densité initiale de 2 x 105 cellules/mL. Incuber les cellules pour être plus actives pendant 5-6 jours.
    3. Prélever un échantillon (1-2 mL) de la suspension cellulaire et centrifuger (200 x g, 3 min) pour granuler les cellules.
    4. Retirez le milieu et remettez doucement les cellules en suspension dans 500 μL du tampon de laminage. Répétez l’étape de lavage deux fois pour éliminer les débris cellulaires.
    5. Mesurez la densité cellulaire avec un hémocytomètre. Remettre en suspension les pastilles de cellules avec un tampon de laminage à une densité de 2 x 105 cellules/mL.
    6. Débranchez soigneusement le tube des entrées/sorties et pipettez 40 μL de la suspension de la cellule dans la chambre d’écoulement. Reconnectez le tube comme décrit précédemment, assurez-vous qu’aucune bulle n’est introduite dans le canal d’écoulement.
    7. Commencez l’expérience de laminage cellulaire en démarrant la pompe à seringue aux débits souhaités.
      REMARQUE : L’intensité des pistes fluorescentes dépend de la contrainte de cisaillement, et une contrainte de cisaillement de cellule plus faible/vitesse de cellule produira généralement des pistes de gradation (Figure 4A). Évitez une densité de cellules élevée à la surface ou une durée de laminage excessive pour assurer la séparation des voies à cellule unique (Figure 4B, C).
    8. Utilisez un microscope à fond noir avec un objectif 10x pour vous assurer que le roulement des cellules est observé.
    9. Une fois l’expérience terminée, retirez les cellules du canal en injectant le tampon de laminage à 100 mL / h jusqu’à ce que la surface soit exempte de cellules.
  3. Imagerie de pistes locales par « Accumulation de points basée sur l’ADN pour l’imagerie en topographie à l’échelle nanométrique » (DNA-PAINT)
    1. Ajouter 40 μL de brin imageur ADN-PAINT (500 pM) dans le tampon DNA-PAINT (0,05 % Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) au canal.
    2. Effectuer une microscopie à fluorescence totale par réflexion interne (TIRF) à l’aide d’une lentille d’objectif TIRF à immersion dans l’huile 100x. Acquérez plus de 40000 images avec un temps d’exposition de 25 ms par image à un gain de multiplication d’électrons (EM) de 300 à l’aide d’une caméra EMCCD (Electron-multiplying charge-coupled device).
    3. Utilisez le progiciel Picasso17 pour localiser et restituer les images en super-résolution (Figure 4D) en suivant les étapes 5.3.4 à 5.3.5.
    4. Chargez le film DNA-PAINT dans le programme Localize pour déterminer la localisation de chaque fluorophore dans chaque image.
      REMARQUE: Optimisez la longueur latérale de la boîte et les paramètres Min. Net Gradient jusqu’à ce que seuls les fluorophores soient suivis avec précision. Min. Le paramètre Net Gradient peut souvent aller au-dessus de 100000 pour obtenir un suivi optimal. Réglage de l’ajustement: MLE, méthode gaussienne intégrée produit le meilleur résultat. Enfin, si le film est trop long, divisez-le en piles de 10000 images afin que le suivi de l’aperçu dans Localize fonctionne correctement avant de les recombiner dans un fichier hdf5 final.
    5. Ensuite, chargez le fichier hdf5 résultant dans le programme Render pour effectuer la correction et le rendu de la dérive.
      REMARQUE: Effectuez plusieurs corrections de dérive via Undrift par RCC pour améliorer le résultat final.
  4. Imagerie de longues pistes par étiquetage permanent
    1. Ajoutez le brin d’imageur permanent et incubez pendant 120 s dans le tampon T50M5. Lavez le canal en injectant 200 μL de tampon de lavage.
    2. Enregistrez une image avec le laser d’excitation désactivé pour obtenir le bruit de fond de la caméra. Imagez une grande surface dans un motif de grille par microscopie TIRF.
      REMARQUE: Le chevauchement d’image sur image de ≥10% est recommandé pour les coutures ultérieures.
    3. Programmez le microscope pour qu’il scanne sur une surface de 400 x 50 images (20000 images au total). En utilisant le programme FIJI, divisez les données brutes en fichiers tiff individuels, chacun contenant un maximum de 10000 images.
    4. Aplatissez toutes les images à l’aide du profil d’éclairage (Figure 3A-C) en suivant les étapes 5.4.5 à 5.4.7.
    5. Soustrayez le bruit de la caméra de fond de chaque image. Obtenez la projection moyenne de la pile (profil d’éclairage) de chaque image soustraite en arrière-plan.
    6. Normalisez le profil d’éclairage par sa valeur maximale. Divisez chaque image soustraite d’arrière-plan par le profil d’éclairage normalisé.
    7. Redimensionnez les images corrigées à la plage appropriée pour la profondeur de bits correspondante.
    8. Utilisez MIST18 pour assembler les images (Figure 3D,E).

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Résultats

Le protocole ci-dessus décrit la procédure expérimentale du test d’empreinte d’adhérence. Le flux de travail général de l’expérience est illustré à la Figure 1, de l’assemblage de la chambre d’écoulement (Figure 1A) à la fonctionnalisation de surface (Figure 1B) et aux étapes d’expérimentation et d’imagerie (Figure 1C).

La figure 2 est un résulta...

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Discussion

Le test d’empreinte d’adhérence permet de visualiser les événements d’adhésion moléculaire entre PSGL-1 et P-selectin pendant l’adhésion au roulement cellulaire. Ce processus est initié par la capture médiée par la sélection P suivie d’un laminage sous contrainte de cisaillement fluidique. Les problèmes potentiels au cours de l’expérience impliquent généralement un mauvais roulement cellulaire ou des pistes fluorescentes manquantes, même lorsque les cellules roulent bien. Ces problèmes résultent souvent de contrôles de q...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus par la Fondation canadienne de l’innovation (FCI 35492), la Subvention de découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (RGPIN-2017-04407), le Fonds Nouvelles frontières en recherche (NFRFE-2018-00969), la Fondation Michael Smith pour la recherche en santé (SCH-2020-0559) et le Fonds Eminence de l’Université de la Colombie-Britannique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Guide de perçage à 4 canauxImpriméen 3D avec filament ABS
Lame à 4 trousPercéesur mesure Lame de microscope propre à l’aide d’un Dremel avec des forets recouverts de diamant sur un guide de perçage à 4 canaux dont la disposition correspond aux centres des 8-32 trous filetés sur la pince en aluminium.
AcétoneVWRBDH1101-4LP
Intercalaire acryliqueSurDécoupez deux blocs de feuilles acryliques de dimension 40 mm x 30 mm x 2,5 mm. Sur chaque bloc, percez deux trous de 3 mm qui sont alignés avec précision avec les 4 à 40 trous du support en aluminium.
Porte-copeaux en aluminiumFabriqué surBloc d’aluminium anodisé usiné en un support en forme de C avec les dimensions extérieures de 640 mm x 500 mm x 65 mm et les dimensions d’ouverture de 400 mm x 380 mm x 65 mm. Les entrées et les sorties sont taraudées avec un filetage 8-32.
AminosilaneAlfaAesarL14043CAS 1760-24-3
Solution antibiotique/antimycosiqueCytiva HyCloneSV3007901Pen/Strep/Fungiezone
Billes de polystyrène enduit de ProtGSpherotechPGP-60-5
Albumine sérique bovineVWR332
Tampon, DNA PAINT0.05 % Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, tampon EDTA 1 mM
, T50M510mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Buffer, HBSS mobileavec 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0,1 % de tampon BSA
, Wash10 mM Tris, 50 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2 et 2 mM de CaCl2, 0,05 % Tween 20
Chlorure de calciumVWRBDH9224
Fioles de culture cellulaireVWR10062-868
Acide sulfurique concentréVWRBDH3072-2,5LG95-98 %
Pince à épiler pour lamellesTechni-Tool758TW150
Foret diamanté mèchesTechnologie abrasiveC52505100,75 mm forage au diamant
ADN ADN, amine-ssDNA (brin supérieur)IDT ADNCustom oligoCCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA, biotin-ssDNA (brin inférieur)IDT DNACustom oligo/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCTGCGTCGCCCGG
DNA, brin imageur pour DNA-PAINTIDT DNAOligo personnaliséGAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
ADN, brin imageur pour marquage permanentIDT ADNoligo personnaliséCCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
Ruban adhésif double faceScotch2373/4 pouce de largeur, ruban permanent double face
EDTAThermofisher155750200,5 M EDTA, pH 8,0
ÉpoxyGorilla42001Temps de durcissement de 5 minutes
Sérum de veau fœtal (FBS)Avantor97068-085
GelGreenBiotium41005
Acide acétique glacialVWRBDH3094-2.5LG
Verre, lamelles de protectionFisher Scientific12-548-5P
Verre, Lame de microscopeVWR48300-02675 mm x 25 mm x 1 mm
Verre, Pot de colorationVWR74830-150Pot de coloration Wheaton (900620)
Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS)Hémocytomètre Lonza04-315Q
Sigma-AldrichZ359629-1EA
Cellules HL-60ATCCCCL-240
Support de diapositive de chambre d’humiditéImprimé enavec filament ABS
Peroxyde d’hydrogèneVWRBDH7690-130 %
ImidazoleSigma-AldrichI2399
Entrées/sortiesSurPercez huit vis de réglage 8-32 à l’aide de forets au cobalt. Insert 1,5 cm  ; Tube en polyéthylène (Tygon, D.I. 1/32 » D.E. 3/32 ») dans chaque vis de réglage creuse
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)Lonza12-722F
Chlorure de magnésiumVWRBDH9244
Billes magnétiques Ni-NTAInvitrogen10103D
Tubes d’expéditionEMSEMS71406-10
MéthanolVWRBDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6 Colonnes de gelBiorad7326200In SSC Buffer
PEGLaysan BioMPEG-SVA-5000
PEG-biotineLaysan BioBiotin-PEG-SVA-5000
Hydroxyde de potassiumVWR470302-132
Protéine, Protéine GAbcamab155724N-terminal His-Tag et C-terminal protéine cystéine
, P-selectin-FcR& D System137-PSProtéine P-sélectine humaine recombinante/CD62P Fc Chimère,
protéine CF, streptavidineCedarlaneCL1005-01-5MG
Pompe SeringueAppareil de Harvard704801
Bicarbonate de sodiumWard' s Science470302-444
Chlorure de sodiumVWR97061-274
Sulfo-SMCCThermofisher22322
SeringueHamilton81520Seringues avec luer lock en PTFE, 5 mL
Aiguilles de seringueBD305115Precision Glide 26 g, longueur 5/8 pouce
TCEPSigma-AldrichC4706-2G
Tube TrisVWRBDH4502-500GP
, adaptateurTygonABW00001formulation 3350, D.E. 1/32 » ; D.E. 3/32 »
Tubes, polyéthylèneBD Intramedic427406Intramedic (PE20) D.E. 0,38 mm ; D.E. 1,09 mm
Tween-20Sigma-Aldrich93773
sur mesure mesure mesure 3D sur mesure mesure

Références

  1. McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
  2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  3. Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
  4. Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
  5. van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
  6. Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
  7. Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
  8. Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
  9. Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
  10. Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006(2014).
  11. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
  12. Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502(2017).
  13. Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
  14. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
  15. Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
  16. Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).
  17. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  18. Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988(2017).
  19. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  20. Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
  21. Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507(2019).
  22. Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
  23. Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
  24. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001(2020).

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