A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Ce protocole présente les procédures expérimentales pour effectuer le test d’empreinte d’adhérence afin d’imager les événements d’adhérence pendant l’adhésion rapide des cellules.
L’adhésion roulante, facilitée par des interactions médiées par la sélection, est une motilité passive très dynamique dans le recrutement des leucocytes sur le site de l’inflammation. Ce phénomène se produit dans les veinules postcapillaires, où le flux sanguin pousse les leucocytes dans un mouvement roulant sur les cellules endothéliales. Un laminage stable nécessite un équilibre délicat entre la formation de liaisons d’adhérence et leur dissociation mécanique, permettant à la cellule de rester attachée à la surface tout en roulant dans le sens de l’écoulement. Contrairement à d’autres processus d’adhérence se produisant dans des environnements relativement statiques, l’adhérence au roulement est très dynamique car les cellules de laminage se déplacent sur des milliers de microns à des dizaines de microns par seconde. Par conséquent, les méthodes de mécanobiologie conventionnelles telles que la microscopie à force de traction ne conviennent pas à la mesure des événements d’adhésion individuels et des forces moléculaires associées en raison de la courte échelle de temps et de la sensibilité élevée requises. Ici, nous décrivons notre dernière implémentation du test d’empreinte d’adhérence pour imager les interactions P-selectin: PSGL-1 dans l’adhésion laminée au niveau moléculaire. Cette méthode utilise des attaches de jauge de tension irréversibles à base d’ADN pour produire un historique permanent des événements d’adhésion moléculaire sous la forme de pistes de fluorescence. Ces pistes peuvent être imagées de deux manières: (1) assembler des milliers d’images limitées par diffraction pour produire un grand champ de vision, permettant l’extraction de l’empreinte d’adhérence de chaque cellule roulante sur des milliers de microns de longueur, (2) effectuer DNA-PAINT pour reconstruire des images super-résolution des pistes de fluorescence dans un petit champ de vision. Dans cette étude, le test d’empreinte d’adhérence a été utilisé pour étudier les cellules HL-60 roulant à différentes contraintes de cisaillement. Ce faisant, nous avons pu imager la distribution spatiale de l’interaction P-selectin: PSGL-1 et mieux comprendre leurs forces moléculaires grâce à l’intensité de la fluorescence. Ainsi, cette méthode fournit les bases de l’étude quantitative des différentes interactions cellule-surface impliquées dans l’adhésion au roulement au niveau moléculaire.
La cascade d’adhésion roulante décrit comment les cellules circulantes s’attachent et roulent le long de la paroi des vaisseaux sanguins1. Le laminage passif est principalement médié par les sélectines, une classe majeure de molécules d’adhésion cellulaire (MCA)1. Sous le flux de cisaillement du sang, les leucocytes exprimant le ligand 1 de la glycoprotéine P-sélectine (PSGL-1) forment des liaisons hautement transitoires avec la P-sélectine, qui peuvent être exprimées à la surface des cellules endothéliales enflammées. Ce processus est essentiel pour que les leucocytes migrent vers un site d’inflammation2. En outre, PSGL-1 est également un récepteur mécanosensible capable de déclencher l’étape d’adhésion ferme ultérieure de la cascade d’adhésion roulante lors de son engagement avec P-selectin3.
Les mutations génétiques affectant la fonction CAM peuvent affecter gravement le système immunitaire, comme dans la maladie rare du déficit en adhésion leucocytaire (LAD), où le dysfonctionnement des molécules d’adhésion médiant le roulement conduit à des individus gravement immunodéprimés4,5,6. En outre, il a été démontré que les cellules tumorales circulantes migrent à la suite d’un processus de roulement similaire, conduisant à des métastases7,8. Cependant, parce que le laminage cellulaire est rapide et dynamique, les méthodes expérimentales conventionnelles de mécanobiologie ne conviennent pas à l’étude des interactions moléculaires pendant le laminage cellulaire. Bien que les méthodes de manipulation à cellule unique et à molécule unique telles que la microscopie à force atomique et la pince optique aient pu étudier les interactions moléculaires telles que l’interaction dépendante de la force de la P-sélectine avec PSGL-1 au niveau de la molécule unique9, elles ne conviennent pas à l’étude des événements d’adhésion en direct pendant le roulement cellulaire. De plus, l’interaction caractérisée in vitro ne peut pas répondre directement à la question de l’adhésion moléculaire in vivo. Par exemple, quelle plage de tension moléculaire est biologiquement pertinente lorsque les cellules fonctionnent dans leur environnement natif? Les méthodes de calcul telles que la simulation de la dynamique des adhésifs10 ou le modèle simple à l’état d’équilibre11 ont capturé certains détails moléculaires et leur influence sur le comportement de roulement, mais dépendent fortement de la précision des paramètres et des hypothèses de modélisation. D’autres techniques telles que la microscopie à force de traction peuvent détecter les forces lors de la migration cellulaire, mais ne fournissent pas une résolution spatiale suffisante ou des informations quantitatives sur la tension moléculaire. Aucune de ces techniques ne peut fournir d’observations expérimentales directes de la dynamique temporelle, de la distribution spatiale et de l’hétérogénéité de magnitude des forces moléculaires, qui sont directement liées à la fonction et au comportement des cellules dans leur environnement natif.
Par conséquent, la mise en œuvre d’un capteur de force moléculaire capable de mesurer avec précision les interactions médiées par la sélection est cruciale pour améliorer notre compréhension de l’adhérence au roulement. Nous décrivons ici le protocole pour le test d’empreinte d’adhérence12 où des billes revêtues de PSGL-1 sont roulées sur une surface présentant des attaches de jauge de tension fonctionnalisées p-selectin (TGT)13. Ces TGT sont des capteurs de force irréversibles basés sur l’ADN qui entraînent un historique permanent des événements de rupture sous forme de lecture de fluorescence. Ceci est réalisé par la rupture du TGT (dsDNA), puis le marquage ultérieur du TGT rompu (ssDNA) avec un brin complémentaire marqué par fluorescence. L’un des principaux avantages de ce système est sa compatibilité avec l’imagerie à diffraction limitée et l’imagerie à super résolution. Le brin complémentaire marqué par fluorescence peut être lié de manière permanente (>12 pb) pour l’imagerie à diffraction limitée ou transitoirement lié (7-9 pb) pour l’imagerie à super-résolution par DNA PAINT. Il s’agit d’un système idéal pour étudier l’adhérence au laminage car les TGT sont rompus pendant le laminage actif, mais la lecture de fluorescence est analysée après le laminage. Les deux méthodes d’imagerie offrent également à l’utilisateur plus de liberté pour étudier l’adhérence au roulement. En règle générale, l’imagerie à diffraction limitée est utile pour extraire la force de rupture moléculaire par l’intensité de fluorescence13, tandis que l’imagerie à super-résolution permet une analyse quantitative de la densité des récepteurs. Avec la capacité d’étudier ces propriétés d’adhérence au laminage, cette approche fournit une plate-forme prometteuse pour comprendre le mécanisme de régulation de la force sur l’adhésion moléculaire des cellules de laminage sous écoulement de cisaillement.
1. Marquage et hybridation des oligonucléotides
2. PEGylation de surface
3. Préparation de la chambre d’écoulement
4. Préparation de la surface
REMARQUE : Reportez-vous à la Figure 1B pour le flux de travail global.
5. Expérience et imagerie
Le protocole ci-dessus décrit la procédure expérimentale du test d’empreinte d’adhérence. Le flux de travail général de l’expérience est illustré à la Figure 1, de l’assemblage de la chambre d’écoulement (Figure 1A) à la fonctionnalisation de surface (Figure 1B) et aux étapes d’expérimentation et d’imagerie (Figure 1C).
La figure 2 est un résultat représentatif de la caractérisation de la bioconjugation de l’ADNS ProtG-ssDNA. Les spectres UV/Vis de trois composants du produit final, à savoir le ProtG, le mal-aDNS et le tampon d’élution de l’imidazole, ont été collectés avant la conjugaison finale (figure 2A), chacun correspondant à une concentration connue. Ces spectres forment la base orthogonale pour s’adapter au spectre des produits de bioconjugation, où les trois paramètres inconnus sont leurs concentrations. Une fonction personnalisée dans MATLAB a été utilisée pour déterminer les concentrations. Les résultats montrent un rapport de près de 1:1 de ProtG à l’ADNSS (Figure 2A). C’est comme prévu parce que l’ADNSs n’a qu’une seule modification amine, et le ProtG a une seule cystéine conçue à son terminus C. Cette approche est plus avantageuse que l’approche précédemment rapportée19 utilisant un seul ADN modifié au thiol pour cibler la multitude d’amines primaires sur ProtG, où le rapport de conjugaison ne peut pas être facilement maintenu.
De plus, page native a été utilisée pour confirmer la bioconjugation (figure 2B). L’ADN est coloré par GelGreen et les protéines par le bleu de Coomassie, respectivement. Comme GelGreen colore l’ADNds plus fortement que l’ADNss, on s’attend à ce que toutes les bandes d’ADNSs soient plus faibles que la concentration molaire égale des bandes d’ADNds (voies 3, 4). Étant donné que le ProtG stock contient un résidu de cystéine C-terminal, une fraction des protéines forment des dimères par une liaison disulfure, comme on le voit dans la voie 5 (Figure 2B). Le ProtG réduit, en revanche, montre une seule bande (voie 6). Lors de l’utilisation directe du ProtG de base dans la conjugaison de l’ADN, le ProtG dimérisé au disulfure ne réagit pas à l’ADN et apparaît sous forme de bande sans aucune coloration GelGreen (voies 7, 8). La bande dimère ProtG disparaît dans le produit de conjugaison en utilisant ProtG réduit (voies 9, 10). Étant donné qu’un excès de mal-ssDNA en ProtG (1,5:1) est utilisé pendant la conjugaison, seules les bandes TGT sont visibles dans le produit de conjugaison final (voies 8, 10). Les bandes GelGreen brillantes coïncidant avec la bande monomère ProtG indiquent une conjugaison réussie et un bon rendement.
La figure 3 illustre des images de microscopie brute représentatives et le flux de travail pour les corriger en vue d’une assemblage et d’une analyse d’images ultérieurs. Le profil d’éclairage TIRF introduit à partir d’une fibre monomode est généralement plus lumineux au milieu du champ de vision et plus faible autour des bords (Figure 3A, B). Pour compenser l’éclairage inégal et aplatir les images pour une analyse quantitative, le profil d’éclairage a été déterminé en faisant la moyenne de milliers d’images individuelles (Figure 3B). Les images aplaties ont été produites en soustrayant le bruit de la caméra des profils bruts et d’éclairage, puis en normalisant par le profil d’éclairage (Figure 3C). L’effet de l’aplatissement de l’image est clairement illustré lorsque les images sont assemblées pour former une grande image. L’intensité de l’image dans les régions d’arrière-plan sans aucune trace de cellule montre des motifs périodiques clairs correspondant aux images non corrigées (Figure 3D). Le même champ de vision assemblé à partir d’images aplaties produit un arrière-plan plat (Figure 3E). Avoir un arrière-plan plat est essentiel pour interpréter les fluctuations d’intensité le long d’une piste de cellule. Dans un premier temps, un profil d’écoulement de montée en puissance similaire à celui illustré à la figure 3F est utilisé pour déterminer la plage de contrainte de cisaillement appropriée à l’expérience, garantissant à la fois un laminage stable des cellules et des pistes de cellules fluorescentes claires. Une empreinte d’adhérence typique d’une seule cellule sous ce profil d’écoulement est illustrée à la figure 3G, où l’intensité augmente à mesure que la contrainte de cisaillement augmente jusqu’à ce que la cellule ne puisse plus supporter le laminage à une contrainte de cisaillement élevée et se détacher de la surface, marquant l’extrémité d’une seule voie.
La figure 4 illustre les résultats expérimentaux potentiels, qu’il s’agisse de résultats expérimentaux représentatifs sous-optimaux ou optimaux. La figure 4A illustre un résultat sous-optimal où les pistes fluorescentes ont un faible rapport signal/bruit. Ceci est probablement causé par une faible densité de surface des sondes entièrement conjuguées ou un faible débit. La figure 4B illustre un autre résultat sous-optimal où les pistes fluorescentes sont trop denses pour résoudre et isoler les pistes individuelles en vue d’une analyse ultérieure. La figure 4C est un exemple de bon résultat où les pistes individuelles peuvent être résolues sur une longue distance et dégagées en arrière-plan. La figure 4D est un exemple de l’image TIRF à diffraction limitée (moitié gauche) par rapport à la même piste imagée par DNA-PAINT (moitié droite). L’ADN-PAINT dans cette configuration produit une précision NeNA (analyse basée sur le plus proche voisin) de 28,8 nm.
Figure 1 : Flux de travail expérimental du test d’empreinte d’adhérence. (A) Assemblage de la cellule d’écoulement et de la chambre d’écoulement. (B) Passivation et fonctionnalisation de surface. Chaque étape d’incubation est marquée par la durée, suivie d’une étape de lavage. (C) Expérience de laminage cellulaire et imagerie. Les cellules roulant sur la surface vont décompresser l’ADN où se forment les interactions d’adhésion, laissant l’ADNS sur la surface qui marque l’emplacement de chaque événement d’adhésion. La surface est étiquetée avec l’imageur permanent ssDNA pour une imagerie de zone étendue, nécessitant une coloration de 2 minutes avant le lavage. Pour l’imagerie DNA-PAINT à super-résolution, le brin de l’imageur est conservé dans le tampon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Caractérisation de la bioconjugation. (A) Absorbance UV-VIS du produit de bioconjugation purifié Ni-NTA (bleu) et ajustement de la courbe (rouge) pour déterminer le rapport de conjugaison. Les spectres d’absorption du ProtG (magenta), du mal-ssDNA (vert) et de l’imidazole (gris) ont été utilisés comme composants pour créer le meilleur ajustement (rouge) au spectre de produits (bleu). Le résidu de l’ajustement est représenté par la ligne pointillée noire. Cela nous permet de déterminer la concentration de ProtG et d’ADNSS dans le produit de bioconjugation purifié et leur rapport molaire. (B) PAGE native des composants dans la procédure de bioconjugation. La première voie montre une échelle d’ADN de faible poids moléculaire (25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500, 766 bp). L’image du gel est de fausse couleur, avec gelgreen colorant l’ADN en vert et coloration à la protéine bleu Coomassie (inversée) en magenta. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Traitement de l’image et résultats représentatifs de l’imagerie de zones étendues. (A) Des milliers d’images BRUTES de la FRBR carrent une vaste zone. (B) Profil d’éclairage dérivé des images brutes. (C) Correction des images en aplatissant le profil d’éclairage. (D) Image cousue à partir de tuiles d’image brutes. Le profil d’éclairage inégal peut être vu comme des motifs périodiques dans l’image. Les cases bleues et rouges indiquent les sections d’image où les profils d’intensité moyenne sont projetés (traces bleues et rouges). Les valeurs d’intensité moyenne (unité arbitraire) représentent celles des images 8 bits (0-255). (E) Même zone que (D) mais cousue à l’aide d’images aplaties. Les projections ne montrent pas de modèles périodiques à grande échelle. (F) Le profil de contrainte de cisaillement à utiliser dans les expériences pour déterminer la gamme de contraintes de cisaillement qui entraînent le laminage des cellules et les pistes de fluorescence d’élasticité. (G) Un échantillon de piste fluorescente provenant d’une seule cellule sous le profil d’écoulement illustré en (F). La cellule se déplace de gauche à droite, l’intensité de fluorescence augmente à mesure que la contrainte de cisaillement augmente jusqu’à ce que la cellule ne puisse plus supporter le roulement et se détache de la surface. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Résultats sous-optimaux et optimaux représentatifs. (A) Un exemple de pistes fluorescentes avec un contraste insuffisant. (B) Un exemple de densité de voie fluorescente excessive. (C) Un exemple de densité et de contraste optimaux de la voie. Les trois images ont été acquises dans le même état, aplaties et cousues. Les cases rouges de chaque image représentent la zone où les projections d’intensité (à droite) ont été prises. (D) Une piste fluorescente montrée en imagerie à diffraction limitée (moitié gauche) et ADN-PAINT (moitié droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Problème | Raison possible | Solution |
| Le ruban époxy n’est pas coupé correctement | Couche époxy trop épaisse | Fluidifiez la couche époxy autant que possible avec la lame du rasoir |
| Puissance et vitesse du graveur laser non optimisées | Optimisez la puissance et la vitesse du graveur laser | |
| Bulles collées sur les côtés de la chambre d’écoulement | Introduction initiale incorrecte de liquide | Poussez les solutions tampons à travers un canal à haut débit pour laver les bulles |
| Les bulles traversent la chambre d’écoulement | Introduction incorrecte de liquide à l’entrée et à la sortie | Assurez-vous qu’une gouttelette de liquide se trouve sur le tuyau d’entrée pour assurer le contact liquide-liquide entre l’extrémité de la pipette et l’entrée |
| Les bulles de la seringue sont entrées dans la conduite d’écoulement | Inclinez la pompe à seringue pour vous assurer que les bulles sont piégées à l’extrémité du piston | |
| Le liquide ne peut pas entrer dans les canaux | Entrées vissées trop serrées | Ajustez pour optimiser l’étanchéité. Le tube d’entrée doit simplement toucher l’ouverture du canal lorsqu’il est vissé correctement. |
| Fuite de canal | L’époxy n’a pas complètement durci | Refaire les canaux, assurer en utilisant 5 min d’époxy à durcissement rapide et laisser durcir pendant au moins 1 h |
| Les entrées ne scellent pas correctement | Ajuster pour optimiser l’étanchéité | |
| Cellules bloquées | Mauvaise PEGylation conduisant à une liaison non spécifique | Idéalement, refaites PEG. En outre, peut essayer d’incuber des agents bloquants supplémentaires (BSA & Tween-20) et ajouter des agents bloquants au tampon de lavage. |
| Passivation de surface détruite par de grandes bulles d’air traversant le canal | Assurez-vous qu’aucune bulle ne traverse le canal | |
| Problème avec les cellules | Utilisez HL-60 2 semaines après le redémarrage de la culture cellulaire congelée. Confirmez le laminage de la cellule sur la surface de contrôle avec uniquement P-selectin. | |
| Les cellules n’ont pas ou ont des interactions clairsemées avec la surface | Densité de P-sélectine trop faible, en raison d’une mauvaise fonctionnalisation de surface et/ou d’une mauvaise bioconjugation | Tout d’abord, utilisez ProtG-biotine au lieu de ProtG-TGT comme contrôle pour déterminer si le problème est dû à la bioconjugation ou à la densité de biotine de surface. Après avoir assuré la qualité de la bioconjugation et la densité de biotine de surface, augmentez la concentration et le temps d’incubation de TGT-ProtG et de P-selectin-Fc. |
| Les cellules roulent mais ne produisent pas de traces fluorescentes | Interactions d’adhérence trop faibles pour rompre le TGT | Augmenter le débit pendant l’expérience de laminage pour augmenter la force d’interaction. Nous recommandons un profil d’écoulement initial de montée en puissance (Figure 3F) pour trouver le débit optimal qui produit à la fois des pistes de laminage et de fluorescence stables (Figure 3G) |
| Une surface de mauvaise qualité entraîne une fluorescence de fond élevée et un contraste insuffisant pour voir les traces | Vérifier la passivation de surface |
Tableau 1 : Dépannage. Le tableau répertorie les raisons et les solutions possibles pour les problèmes survenant lors de l’exécution de ce test
Fichier de codage supplémentaire 1 : Le script MATLAB écrit sur mesure pour décomposer le spectre du produit final en fonction des trois spectres collectés précédemment (ProtG, SMCC-strand, tampon d’élution de billes Ni-NTA) afin de déterminer l’efficacité de conjugaison et le rapport de ProtG à ssDNA. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Ce protocole présente les procédures expérimentales pour effectuer le test d’empreinte d’adhérence afin d’imager les événements d’adhérence pendant l’adhésion rapide des cellules.
Ces travaux ont été soutenus par la Fondation canadienne de l’innovation (FCI 35492), la Subvention de découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (RGPIN-2017-04407), le Fonds Nouvelles frontières en recherche (NFRFE-2018-00969), la Fondation Michael Smith pour la recherche en santé (SCH-2020-0559) et le Fonds Eminence de l’Université de la Colombie-Britannique.
| Guide de perçage à 4 canaux | Imprimé | sur mesure | en 3D avec filament ABS |
| Lame à 4 trous | Percée | sur mesure Lame de microscope propre à l’aide d’un Dremel avec des forets recouverts de diamant sur un guide de perçage à 4 canaux dont la disposition correspond aux centres des 8-32 trous filetés sur la pince en aluminium. | |
| Acétone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Intercalaire acrylique | Sur | mesure | Découpez deux blocs de feuilles acryliques de dimension 40 mm x 30 mm x 2,5 mm. Sur chaque bloc, percez deux trous de 3 mm qui sont alignés avec précision avec les 4 à 40 trous du support en aluminium. |
| Porte-copeaux en aluminium | Fabriqué sur | mesure | Bloc d’aluminium anodisé usiné en un support en forme de C avec les dimensions extérieures de 640 mm x 500 mm x 65 mm et les dimensions d’ouverture de 400 mm x 380 mm x 65 mm. Les entrées et les sorties sont taraudées avec un filetage 8-32. |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Solution antibiotique/antimycosique | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Billes de polystyrène enduit de ProtG | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Albumine sérique bovine | VWR | 332 | |
| Tampon, DNA PAINT | 0.05 % Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, tampon EDTA 1 mM | ||
| , T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, HBSS mobile | avec 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0,1 % de tampon BSA | ||
| , Wash | 10 mM Tris, 50 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2 et 2 mM de CaCl2, 0,05 % Tween 20 | ||
| Chlorure de calcium | VWR | BDH9224 | |
| Fioles de culture cellulaire | VWR | 10062-868 | |
| Acide sulfurique concentré | VWR | BDH3072-2,5LG | 95-98 % |
| Pince à épiler pour lamelles | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Foret diamanté mèches | Technologie abrasive | C5250510 | 0,75 mm forage au diamant |
| ADN ADN, amine-ssDNA (brin supérieur) | IDT ADN | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (brin inférieur) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, brin imageur pour DNA-PAINT | IDT DNA | Oligo personnalisé | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| ADN, brin imageur pour marquage permanent | IDT ADN | oligo personnalisé | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Ruban adhésif double face | Scotch | 237 | 3/4 pouce de largeur, ruban permanent double face |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0,5 M EDTA, pH 8,0 |
| Époxy | Gorilla | 42001 | Temps de durcissement de 5 minutes |
| Sérum de veau fœtal (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Acide acétique glacial | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Verre, lamelles de protection | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Verre, Lame de microscope | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Verre, Pot de coloration | VWR | 74830-150 | Pot de coloration Wheaton (900620) |
| Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) | Hémocytomètre Lonza | 04-315Q | |
| Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | ||
| Cellules HL-60 | ATCC | CCL-240 | |
| Support de diapositive de chambre d’humidité | Imprimé en | 3D surmesure | avec filament ABS |
| Peroxyde d’hydrogène | VWR | BDH7690-1 | 30 % |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Entrées/sorties | Sur | mesure | Percez huit vis de réglage 8-32 à l’aide de forets au cobalt. Insert 1,5 cm ; Tube en polyéthylène (Tygon, D.I. 1/32 » D.E. 3/32 ») dans chaque vis de réglage creuse |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Chlorure de magnésium | VWR | BDH9244 | |
| Billes magnétiques Ni-NTA | Invitrogen | 10103D | |
| Tubes d’expédition | EMS | EMS71406-10 | |
| Méthanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Colonnes de gel | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotine | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Hydroxyde de potassium | VWR | 470302-132 | |
| Protéine, Protéine G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag et C-terminal protéine cystéine |
| , P-selectin-Fc | R& D System | 137-PS | Protéine P-sélectine humaine recombinante/CD62P Fc Chimère, |
| protéine CF, streptavidine | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pompe Seringue | Appareil de Harvard | 704801 | |
| Bicarbonate de sodium | Ward' s Science | 470302-444 | |
| Chlorure de sodium | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Seringue | Hamilton | 81520 | Seringues avec luer lock en PTFE, 5 mL |
| Aiguilles de seringue | BD | 305115 | Precision Glide 26 g, longueur 5/8 pouce |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tube Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| , adaptateur | Tygon | ABW00001 | formulation 3350, D.E. 1/32 » ; D.E. 3/32 » |
| Tubes, polyéthylène | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) D.E. 0,38 mm ; D.E. 1,09 mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
