Summary
介绍了使用在可见光范围内操作的简单分光光度计测量糖原代谢关键酶活性的技术。
Abstract
糖原是由从细菌到动物的各种生物体合成的葡萄糖储存形式。该分子包括α1，4-连接的葡萄糖残基的线性链，其分支通过添加α1，6-连接引入。了解糖原的合成和降解如何被调节以及糖原如何获得其特征性的支链结构需要研究糖原储存的酶。然而，最常用于研究这些酶活性的方法通常采用并非所有研究人员都可以使用的试剂或技术。在这里，我们讨论了一系列技术上简单，具有成本效益的程序，但仍能够为糖原储存的控制提供有价值的见解。这些技术需要使用在330至800nm范围内的分光光度计，并且假设用户将使用一次性塑料比色皿进行描述。然而，该程序易于扩展，并且可以修改以用于酶标仪，从而实现高度平行的分析。
Introduction
糖原在自然界中分布广泛，该化合物存在于细菌、许多原生生物、真菌和动物中。在微生物中，当营养物质有限时，糖原对细胞存活很重要，而在哺乳动物等高等生物中，糖原的合成和降解有助于缓冲血糖水平1，2，3。因此，糖原代谢的研究对微生物学和哺乳动物生理学等不同领域具有重要意义。了解糖原代谢需要研究糖原合成（糖原合酶和支化酶）和糖原降解（糖原磷酸化酶和脱支酶）的关键酶。糖原合酶、磷酸化酶、支化和脱支酶活性的金标准测定采用放射性同位素。例如，糖原合酶通常在停止的放射化学测定中通过将UDP-[14 C]葡萄糖（在动物和真菌酶的情况下）或ADP-[14C]葡萄糖（在细菌酶的情况下）掺入糖原4，5来测量。类似地，在将[14C]葡萄糖-1-磷酸中的葡萄糖掺入糖原6之后，沿糖原合成方向测量糖原磷酸化酶。通过测量该酶通过糖原磷酸化酶7刺激葡萄糖-1-磷酸中的[14C]葡萄糖掺入α1，4-连接链的能力来测定支化酶，并通过跟踪酶将[14C]葡萄糖掺入糖原的能力来确定脱支酶活性8.虽然放射性底物非常敏感，允许它们用于酶活性水平低的粗细胞提取物，但价格昂贵，并且受放射性同位素使用相关的监管要求的约束。这些障碍使许多工人无法使用某些检测方法。然而，在多年的过程中，已经描述了用于测量这些酶的各种令人印象深刻的分光光度法。一般来说，这些方法最终依赖于测量NADH / NADPH的产生或消耗，或糖原和碘之间有色复合物的产生。因此，它们很简单，可以使用仅配备钨或氙闪光灯的简单分光光度计进行。
糖原合酶的分光光度测定依赖于测量糖核苷酸供体释放的核苷二磷酸，因为葡萄糖被添加到生长的糖原链中9，10。下面协议第1节中描述的测量糖原合酶活性的程序是对Wayllace等人11概述的程序的修改，偶联方案如下所示：
（葡萄糖）n + UPD-葡萄糖→ （葡萄糖）n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + 磷酸烯醇丙酮酸 → 丙酮酸 + ATP
丙酮酸 + NADH + H+ →乳酸 + NAD+
糖原合酶将UDP-葡萄糖中的葡萄糖添加到糖原上。在此过程中产生的UDP通过核苷二磷酸激酶（NDP激酶）转化为UTP，在产生ADP的反应中。反过来，ADP作为丙酮酸激酶的底物，丙酮酸激酶使用磷酸烯醇丙酮酸作为磷酸供体磷酸化ADP。所得丙酮酸通过乳酸脱氢酶在消耗NADH的反应中转化为乳酸。因此，该测定可以以连续的方式进行，监测消耗NADH时340nm处吸光度的降低。它很容易与需要ADP-葡萄糖作为葡萄糖供体的酶一起使用。在这里，偶联步骤更简单，因为糖原合酶作用释放的ADP直接作用于丙酮酸激酶。
有多种分光光度法可用于测定糖原磷酸化酶活性。在经典版本中，酶向后驱动，朝糖原合成的方向，如下所示：
（葡萄糖）n + 葡萄糖-1-磷酸 → （葡萄糖）n+1 + Pi
在定时间隔下，除去反应混合物的等分试样，并定量释放的磷酸盐量12，13。在我们手中，由于在许多商业制备的葡萄糖-1-磷酸中存在易于测量的游离磷酸盐，以及磷酸化酶作用所需的高浓度葡萄糖-1-磷酸盐，因此该测定的使用有限。相反，我们常规采用另一种测定法，测量糖原被磷酸化酶13降解时释放的葡萄糖-1-磷酸盐。采用下图所示的偶联反应方案。
（葡萄糖）n + Pi → （葡萄糖）n-1 + 葡萄糖-1-磷酸
葡萄糖-1-磷酸 → 葡萄糖-6-磷酸
葡萄糖-6-磷酸 + NADP+ → 6-磷酸葡萄糖酸内酯 + NADPH + H+
葡萄糖-1-磷酸通过磷酸葡萄糖变位酶转化为葡萄糖-6-磷酸，然后将葡萄糖-6-磷酸氧化成6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时NADP+ 还原为NADPH。下面协议第2节中详述的程序源自Mendicino等人14 和Schreiber&Bowling15描述的方法。该测定可以很容易地以连续的方式进行，随着时间的推移，340nm处的吸光度增加，从而可以测定反应速率。
分光光度法测定脱支酶活性依赖于测量酶对磷酸化酶极限糊精16的作用释放的葡萄糖。该化合物是通过用糖原磷酸化酶彻底处理糖原制成的。由于糖原磷酸化酶的作用使4个葡萄糖残基远离α1，6支链点，因此极限糊精含有糖原，其外链已缩短至~4个葡萄糖残基。这里描述了磷酸化酶极限糊精的制备，使用源自Taylor等人17 和Makino & Omichi18开发的那些程序。
去分支是一个两步过程。双功能脱支酶的4-α-葡聚糖转移酶活性首先将三个葡萄糖残基从支点转移到附近α1，4-连接的葡萄糖链的非还原端。然后，残留在分支点的单个α1，6-连接葡萄糖残基被α1，6-葡萄糖苷酶活性19水解。该测定通常以停止的方式进行，在给定时间（或一系列时间）后释放的葡萄糖在偶联酶测定中测量如下：
（葡萄糖）n → （葡萄糖）n-1 + 葡萄糖
葡萄糖 + ATP → 葡萄糖-6-磷酸 + ADP
葡萄糖-6-磷酸 + NADP+ → 6-磷酸葡萄糖酸内酯 + NADPH + H+
测定产生的NADPH可以测量葡萄糖的产生量度。下文议定书第3节概述的程序以Nelson等人描述的程序为基础，16。与依赖于NADH / NADPH的消耗或生成的其他方法一样，该测定非常敏感。然而，淀粉酶或其他葡萄糖苷酶的存在（它们也可以从磷酸化酶限制糊精中释放游离葡萄糖）将引起显着干扰（见讨论）。
支化酶活性的比色测定依赖于α1，4-连接的葡萄糖链采用与碘结合的螺旋结构，形成有色复合物的事实20。形成的配合物的颜色取决于α1，4-连接链的长度。因此，直链淀粉由长而大部分未支链的α1，4-连接的葡萄糖组成，与碘形成深蓝色复合物。相反，糖原，其外链通常只有6至8个葡萄糖残基长，形成橙红色复合物。如果直链淀粉溶液与支化酶一起孵育，将支链引入直链淀粉会导致产生较短的α1，4-连接的葡萄糖链。因此，直链淀粉/碘复合物的最大吸收向较短的波长移动。这里讨论的程序源自Boyer&Preiss21 的详细程序，支化酶活性被量化为随着时间的推移在660nm处直链淀粉/碘复合物的吸收减少。
从上面的讨论中应该很容易看出，碘链和α1，4-葡萄糖链之间形成的复合物的颜色随链长而变化的事实意味着糖原/碘复合物的吸光度光谱应随糖原支化程度而变化。情况确实如此，具有较长外链的支链较少的糖原/糖原比支链更细/外链较短的糖原吸收波长更长的光。因此，碘染色反应可用于获得关于糖原支化程度的快速定性数据22。当糖原与碘的复合物不是特别强烈时，形成橙棕色。然而，通过加入饱和氯化钙溶液22可以增强颜色显影。这使该方法的灵敏度提高了约10倍，并允许随时分析微量糖原。下面协议第4节中描述的用于确定分支的测定法改编自Krisman22开发的程序。只需将糖原样品与比色皿中的碘溶液和氯化钙混合并收集330nm至800nm的吸收光谱即可进行。随着分支程度的降低，吸光度最大值向更长的波长移动。
总的来说，这里描述的方法提供了简单，可靠的方法来评估糖原代谢关键酶的活性，并获得有关糖原分支程度的定性数据。
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Protocol
1.糖原合酶活性的测定
- 如 表1 所示制备所需试剂的储备溶液（实验日之前）。
| 元件 | 方向 | |
| 50 毫米三分尺 pH 8.0 | 将 0.61 g Tris 碱溶解在 ~ 80 mL 水中。 冷却至4°C。 用HCl将pH调节至8.0，用水使体积达到100 mL。 | |
| 20 mM HEPES缓冲液 | 将 0.477 g HEPES 溶解在 ~ 80 mL 水中。 用NaOH将pH调节至7.0，并用水将体积补足至100 mL。 | |
| 132 mM Tris/32 mM KCl 缓冲液 pH 7.8 | 将 1.94 g Tris 碱和 0.239 g KCl 溶解在 ~90 mL 水中。 用HCl将pH调节至7.8，并用水将体积补足至100 mL。 | |
| 0.8% w/v 牡蛎糖原 | 称出80毫克牡蛎糖原，加入水中。 用水使最终体积达到 10 mL，轻轻加热/混合以完全溶解糖原。 | |
| 100 mM UDP-葡萄糖 | 将 0.31 g UDP-葡萄糖溶解在水中，使最终体积达到 1 mL。 分装储存，在-20°C冷冻。 稳定数月。 | |
| 50 毫米泛氧瘟 | 将 0.414 g ATP 溶解在 ~ 13 mL 水中。 用NaOH将pH调节至7.5，并用水将体积补足至15 mL。 以-20°C冷冻的等分试样储存。 稳定数月。 | |
| 100 mM 葡萄糖-6-磷酸 pH 7.8 | 将0.282克葡萄糖-6-磷酸溶解在~7至8毫升水中。 用氢氧化钠将pH值调节至7.8。 用水使体积高达 10 mL。 在-20°C下冷冻冷冻。 稳定至少六个月。 | |
| 40 mM磷酸烯醇丙酮酸 | 将 4 mg 磷酸烯醇丙酮酸溶解在 0.5 mL 的 20 mM HEPES 缓冲液 pH 7.0 中。 储存在-20°C。 稳定至少 1 周。 | |
| 0.5 米氯化锰2 | 将 9.90 g MnCl2 溶解在最终体积的 100 mL 水中。 | |
| 新民主党激酶 | 用足够的水重新配制冻干粉末，得到1U / μl溶液。 准备等分试样，在液氮中冷冻，并储存在-80°C。 稳定至少 1 年。 | |
表1：糖原合酶活性测定所需的储备溶液。
- 在测定当天，通过将4.5mgNADH溶解在1.5mL的50mM Tris-HCl，pH 8.0中来制备4mM NADH的新鲜工作溶液。存放在冰上，避光。
- 在冰上解冻UDP-葡萄糖，ATP，磷酸烯醇丙酮酸和NDP激酶的储备溶液。
- 将水浴预热至30°C。
- 通过加入 表2中列出的反应混合物试剂，在1.5 mL管中设置每种糖原合酶测定。
| 元件 | 体积（微升） |
| 160 mM Tris/32 mM KCl 缓冲液 pH 7.8 | 250 |
| 水 | 179 |
| 100 mM 葡萄糖-6-磷酸， pH 7.8 | 58 |
| 0.8 % w/v 牡蛎糖原 | 67 |
| 50 毫米泛氧瘟 | 80 |
| 4 毫米纳德 | 80 |
| 100 mM UDP-葡萄糖 | 28 |
| 40 mM磷酸烯醇丙酮酸 | 20 |
| 0.5 米氯化锰2 | 8 |
| 最终卷 | 770 |
表2：用于测定糖原合酶活性的组合物反应混合物。
注意：为了便于设置，可以制备含有足够多的上述每种试剂的预混液，以完成计划的测定次数。
- 准备一个空白反应，其中上述混合物中的NADH用水代替。转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中，并使用它来将分光光度计上的零点设置为 340 nm。
- 在 1.5 mL 管中取一个 770 μL 等分试样的反应混合物。加入 2 μL NDP 激酶和 2 μL 丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶混合物，轻轻混合，并在 30 °C 下孵育 3 分钟以预热反应混合物。
- 在 pH 7.8 的 20 mM Tris 缓冲液中加入 30 μL 含有糖原合酶的样品;混合，并将反应混合物转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中。
- 将比色皿放入分光光度计中，并以定时间隔记录340nm处的吸光度10至20分钟。绘制获得的吸光度随时间的变化。
注意：应进行用20mM Tris缓冲液替换糖原合酶样品的反应，以控制NADH的非酶氧化。根据样品的纯度，可能需要其他对照反应。有关详细信息，请参阅讨论。 - 确定反应速率（有关详细信息，请参阅 结果 ）。
2.糖原磷酸化酶活性的测定
- 按照 表3 （实验日前）所示制备储备溶液。
| 元件 | 方向 | |
| 125 mM 管 pH 6.8 | 将3.78克管道溶解在水中。 用氢氧化钠将pH值调节至6.8，并用水补足体积至100mL。 | |
| 8% w/v 牡蛎糖原 | 称出0.8克牡蛎糖原，加入水中。 用水使最终体积达到 10 mL，轻轻加热/混合以溶解糖原。 储存在-20°C冷冻。 | |
| 200 mM 磷酸钠 pH 6.8 | 溶解 2.63 g Na 2 HPO 4.7H 2 O 和 1.41g NaH2PO4。H2O在水中。 用水将体积增加到 100 mL。 | |
| 1 mM葡萄糖-1，6-二磷酸盐 | 将 2 毫克葡萄糖-1，6-二磷酸盐溶解在 4 毫升水中。 等分并储存在-20°C冷冻。 稳定至少几个月。 | |
| 10 毫米纳德普 | 将 23 毫克 NADP 溶解在 3 毫升水中。 等分并储存在-20°C冷冻。 稳定至少几个月。 | |
表3：糖原磷酸化酶活性测定所需的储备溶液。
- 将水浴预热至30°C
- 通过添加下面列出的反应混合物试剂，在 1.5 mL 管中设置每种糖原磷酸化酶测定（表 4）。
| 元件 | 体积（微升） |
| 125 mM 管道缓冲液 pH 6.8 | 160 |
| 水 | 70 |
| 8% w/v 牡蛎糖原 | 100 |
| 200 mM 磷酸钠 6.8 | 400 |
| 1 mM葡萄糖-1，6-二磷酸盐 | 20 |
| 10 毫米纳德普 | 20 |
| 最终卷 | 770 |
表4：用于测定糖原磷酸化酶活性的组合物反应混合物。
注意：为了便于设置，可以制备含有足够多的上述每种试剂的预混液，以完成计划的测定次数。
- 制备含有 表4 中所列组分的空白反应物，但额外加入30 μL pH 6.8的25 mM PIPES缓冲液（通过用水稀释125 mM PIPES缓冲液1/5制备）。转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中，用于将分光光度计上的零点设置为 340 nm。
- 在 1.5 mL 管中取一份 770 μL 等分试样的反应混合物。加入1μL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和1μL磷酸葡萄糖变位酶，轻轻混合，并在30°C孵育3分钟以预热反应混合物。
- 在 pH 6.8 的 25 mM PIPES 缓冲液中加入 30 μL 含有糖原磷酸化酶的样品。混合并将反应混合物转移到一次性甲基丙烯酸比色皿中。
- 将比色皿放入分光光度计中，并以定时间隔记录340nm处的吸光度10至20分钟。绘制获得的吸光度随时间的变化。
注意：应包括用25mM PIPES缓冲液替换糖原磷酸化酶的反应。根据糖原磷酸化酶样品的纯度，可能还需要其他对照（详见讨论）。 - 确定反应速率（详见代表性结果）。
3.糖原脱支酶活性的测定
- 按照 表5 （实验日之前）所示制备储备溶液。
| 元件 | 方向 | |
| 100 mM马来酸盐缓冲液 | 将1.61克马来酸溶解在~80毫升水中。 用NaOH将pH调节至6.6，用水使最终体积达到100 mL。 | |
| 300 mM 三乙醇胺盐酸盐/ 3 mM MgSO4 pH 7.5 | 溶解27.85克盐酸三乙醇胺和0.370克MgSO4。7H2O 在 ~ 400 mL 水中。 用 NaOH 将 pH 值调节至 7.5，并用水补足至 500 mL 的最终体积。 | |
| 150 毫米三磷酸腺啪啪/12 毫米三磷酸腺苷 | 将 1.24 g ATP 溶解在 ~ 10 mL 水中。 监测pH值并加入NaOH以在ATP溶解时保持~7.5的pH值。 加入0.138克NADP。 用NaOH将pH调节至~7.5，并用水补足至15mL的最终体积。在– 20°C下等分储存。 稳定数月。 | |
| 50 mM 磷酸钠缓冲液 pH 6.8 | 溶解 32.81 g Na 2 HPO 4.7H 2 O 和 17.61 g NaH2PO4。H2O在水中。 用水使体积达到 5 L 的最终体积。 | |
表5：糖原脱支酶活性测定所需的储备溶液。
- 制备磷酸化酶极限糊精
- 将 0.3 g 牡蛎糖原溶解在 10 mL 的 50 mM 磷酸钠缓冲液中，pH 6.8。
- 溶解足够的冻干磷酸化酶A粉末，在pH 6.8的50mM磷酸盐缓冲液中产生60U活性。
注意：根据购买的磷酸化酶A批次，所需的质量会有所不同，但通常在5至10mg粉末之间。
- 向糖原溶液中加入60U磷酸化酶A并转移到透析袋中。在室温下对1L 50mM磷酸钠缓冲液透析，pH 6.888小时。更换为新鲜透析缓冲液并继续孵育过夜。
- 再加入10U磷酸化酶A，换成新鲜透析缓冲液。8小时后，再次更换为新鲜透析缓冲液并继续孵育过夜。
- 将透析袋的内容物转移到离心管中并煮沸10分钟。在冰上冷却，然后以10，000× g 离心15分钟。
- 将上清液转移到透析袋中，对2L蒸馏水的三次变化透析8小时。
- 将透析袋的内容物转移到 50 mL 离心管中。测量体积并加入两体积冰冷的无水乙醇以沉淀极限糊精。让管子在冰上静置30分钟。
注意：加入乙醇后应立即开始形成白色沉淀，但如果没有，则添加一滴3M NaCl。 - 以15，000× g 离心15分钟，弃去上清液。用 66% v/v 乙醇冲洗极限糊精的白色沉淀两次，每次冲洗使用 ~30 mL。
- 将极限糊精转移到研钵中，让其完全风干。极限糊精干燥后，用研杵研磨成粉末，转移到合适的容器中储存;在4°C干燥。
- 为了用作脱支酶底物，在水中制备1% w/v溶液。
- 将水浴预热至30°C。
- 将加热块或水浴预热至95°C。
- 准备四个 1.5 mL 管，每个管含有 100 μL 马来酸盐缓冲液、80 μL 磷酸化酶极限糊精和 10 μL 水。这些试管将用于进行脱支酶测定。标记其中两个管反应和另外两个管对照。
- 每隔一段时间，向反应管中加入 10 μL 脱支酶样品，向对照管中加入 10 μL 用于制备支化酶样品的缓冲液。在30°C孵育。
- 在规定的时间点（例如，5分钟、10 分钟和 20 分钟孵育），从每个反应和控制管中取出 50 μL，并立即放入 95 °C 的加热块或水浴中。 加热3分钟。
- 以15，000× g 离心2分钟以除去沉淀的蛋白质。
注意：此时，如果需要，可以停止该过程。加热的样品可以在-20°C下冷冻储存，直到继续测量游离的葡萄糖（下面的步骤17）。 - 释放葡萄糖的测量
- 将 40 μL 上清液从加热样品转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中，并加入 833 μL 盐酸三乙醇胺/硫酸镁缓冲液、67 μL NADP/ATP 混合物和 60 μL 水。轻轻上下移液混合，注意不要引入气泡。
注意：为了便于设置，可以制备含有足够多的上述每种试剂的预混液，以完成计划的测定次数。 - 通过混合 100 μL 马来酸盐缓冲液、80 μL 磷酸化酶极限糊精和 20 μL 水制备空白反应。充分混合，并将 40 μL 转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中。加入833μL盐酸三乙醇胺/硫酸镁等，如步骤3.17.1中所述。
- 使用空白反应将分光光度计上的零点设置为 340 nm。
- 向每个比色皿中加入 0.5 μL 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。通过缓慢上下移液轻轻混合。在室温下孵育10分钟，然后记录340nm处的吸光度。
注意：吸收值应较低，表示样品几乎没有葡萄糖-6-磷酸污染。 - 向每个比色皿中加入 0.5 μL 己糖激酶。通过缓慢上下移液轻轻混合。在室温下孵育15分钟，然后在340nm处记录吸光度。
- 继续在室温下孵育5分钟。再次记录340nm处的吸光度。如果吸收从15分钟记录的吸收增加，继续孵育5分钟，然后再次检查吸收。记录获得的340nm处的最终吸收。
- 对于每个样品，从加入己糖激酶后获得的最终吸光度中减去加入葡萄糖-6-磷酸脱氢酶后记录的340nm处的吸光度。根据相应样品用脱支酶孵育的时间长度绘制获得的值。
- 将 40 μL 上清液从加热样品转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中，并加入 833 μL 盐酸三乙醇胺/硫酸镁缓冲液、67 μL NADP/ATP 混合物和 60 μL 水。轻轻上下移液混合，注意不要引入气泡。
4.糖原支化酶活性的测定
- 在实验日之前，首先将2.6 g KI溶解在10 mL水中来制备碘/ KI溶液。在通风橱中，称出0.26克碘并添加到KI溶液中。
注意：碘在与皮肤接触或吸入时是有害的。混合以溶解碘并储存在4°C，避光。同时准备125 mM PIPES缓冲液，pH 6.8（见 表3）。 - 开始实验时，制作酸化碘试剂的工作储备。
- 在 50 mL 管中取 45.7 mL 水，加入 150 μL 碘/KI 溶液，然后加入 150 μL 1 M HCl。
- 充分混合并储存在4°C，避光。在这些条件下，溶液至少稳定3天。
- 在实验当天，制作新鲜的10mg / mL直链淀粉溶液。
- 称出 50 mg 直链淀粉并转移到 15 mL 管中。
- 加入 200 μL 无水乙醇并轻轻摇晃。
- 加入 500 μL 2 M KOH 并轻轻摇晃。
注意：KOH会导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。使用适当的个人防护设备。 - 加入 0.5 mL 水，同时轻轻摇晃。如果直链淀粉不能完全溶解，请额外添加 0.5 mL 水。
- 用 1 M HCl 将 pH 值调节至 ~6.5 至 7.0。
注意：HCl可能会引起眼睛，皮肤和呼吸道刺激。使用适当的个人防护设备。 - 加水至终体积 5 mL。
- 通过0.2μm注射器端部过滤器进行灭菌，并在室温下储存。不要冷却或冷冻。
- 将水浴预热至30°C。
- 准备 12 个 1.5 mL 试管，每个管含有 1 mL 酸化碘试剂。放在长凳上。这些将用于阻止支化酶反应。
- 准备四个 1.5 mL 管，每个管含有 150 μL 直链淀粉、150 μL PIPES 缓冲液和 45 μL 水。这些试管将用于进行支化酶测定。标记其中两个管反应和另外两个管对照。
- 每隔一段时间，向反应管中加入 5 μL 支化酶样品，向对照管中加入 5 μL 用于制备支化酶样品的缓冲液。在30°C孵育。
- 在确定的时间点（例如，5、10 和 15 分钟孵育），从每个反应和对照管中提取 10 μL，并添加到含有 1 mL 酸化碘试剂的 1.5 mL 管中。再加入 140 μL 水并充分混合。转移到一次性比色皿上。
注意：样品应为蓝色，溶液应不含任何沉淀物。形成的颜色在室温下稳定至少2小时。 - 制备含有 1 mL 酸化碘试剂和 150 μL 水的样品。搅拌均匀并转移到比色皿中。使用此比色皿将分光光度计上的零点设置为 660 nm。
- 在660nm处读取十二个样品中每个样品的吸光度。当每个时间点不存在支化酶（对照）时，通过从吸光度中减去在支化酶存在下获得的吸光度（反应）来确定支化酶反应的速率。有关详细信息，请参阅代表性结果。
5. 糖原分支的定性评估
- 将74.5g无水氯化钙加入~40mL水中并搅拌制备饱和氯化钙溶液。再加一点水，继续搅拌。用水使体积达到 100 mL，并继续搅拌直至 CaCl2 完全溶解。
- 通过在 15 mL 管中将 50 μL KI/碘储备溶液（参见上面的步骤 4.1）与 13 mL 饱和 CaCl 2 溶液混合，制备碘/CaCl2 颜色试剂的工作储备液。充分混合并储存在4°C，避光。在这些条件下，溶液至少稳定1周。
- 分支的确定
- 在 1.5 mL 管中，将 650 μL 碘/CaCl2 颜色试剂原液与 100 μL 水混合并充分混合。将溶液转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中。
注意：比色皿中的溶液应透明且呈淡黄色。 - 放入分光光度计中，以波长扫描模式运行，收集330nm至800nm的背景光谱。
- 在 1.5 mL 管中，将 650 μL 工作碘/CaCl2 颜色试剂与 50 μg 牡蛎糖原混合。用水将最终体积降至 750 μL 并充分混合。将溶液转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中。
注意：比色皿中的溶液应该是透明的，呈深橙色/棕色。 - 放入分光光度计并收集330nm至800nm的吸收光谱。
- 用50μg支链淀粉和30μg直链淀粉重复步骤4.4.3至4.4.4。
注意：支链淀粉样品应为黄色/绿色，直链淀粉样品应为绿色/蓝色。两个样本都应该是清晰的。形成的有色配合物在室温下稳定，吸收光谱没有变化至少1小时。 - 为了获得未表征糖原样品的支链结构指示，将 25 μg 至 50 μg 糖原与 650 μL 工作碘/CaCl2 颜色试剂混合。如上所述，用水使体积达到 750 μL，充分混合，然后转移到甲基丙烯酸比色皿中。
注意：糖原样品应产生黄色/橙色至橙色/棕色，具体取决于存在的糖原的分支程度（外链长度）。同样，样品应该是透明的。有关详细信息，请参阅 代表性结果 。 - 收集吸收光谱。
- 在 1.5 mL 管中，将 650 μL 碘/CaCl2 颜色试剂原液与 100 μL 水混合并充分混合。将溶液转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中。
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Representative Results
糖原合酶活性的测定
图1 显示了使用纯化酶进行糖原合酶测定的代表性结果。在图A中，在轻微滞后之后，随着时间的推移，340nm处的吸收呈线性下降，持续约12分钟。 图1A 中的吸收变化率为~0.12吸光度单位/分钟。~0.010至~0.20吸光度单位/min之间的吸光度变化率是最佳的，应将糖原合酶的添加量调整为该范围内的产量。在图B中，显示了在测定中添加过多糖原合酶的结果。在这里，反应在前2分钟内完成。对照反应在这些情况下不含糖原合酶，随着时间的推移没有显示出可测量的吸光度降低。如讨论中所述，在该测定中使用组织匀浆是完全可行的，尽管需要额外的对照反应。
这里描述的方案使用牡蛎糖原作为底物，它与来自许多不同物种的糖原合酶配合良好。然而，应该注意的是，糖原合酶可能显示出相当可变的活性，具体取决于所使用的糖原类型。因此，建议在开始任何详细研究之前调查各种形式的糖原。
给出的方案包括反应混合物中的葡萄糖-6-磷酸酯，因为许多糖原合酶被该化合物9，23，24，25，26同位素激活。在存在和不存在葡萄糖-6-磷酸（用水构成反应体积）的情况下进行测定，可以计算-/ +葡萄糖-6-磷酸活性比，这是哺乳动物和真菌糖原合酶1，27磷酸化状态的有用指示。
从吸光度的变化中测定糖原合酶活性相当简单。NADH的消光系数取为6220 M-1 cm-1，允许根据吸光度变化率计算NADH浓度的变化率，如下所示：
0.12单位/分钟的吸收变化率对应于NADH浓度的0.12/6220 = 1.93 x 10-5mol/L/min的变化。比色皿中的体积为 0.8 mL，这意味着 NADH 量的变化为：1.93 x 10-5 x 0.8 x 10-3 = 3.46 x 10-8 mol/min。添加的酶体积为 60 μL，3.46 x 10-8 x （1000 / 60） = 5.76 x 10-7 mol NADH 消耗/分钟/mL 酶。
由于消耗的NADH与掺入糖原的葡萄糖之间存在一对一的关系，因此反应速率可以表示为5.76 x 10-7 摩尔葡萄糖掺入/分钟/mL。
当酶样品的蛋白质含量已知时，特定的酶活性可以表示为μmol葡萄糖掺入/min/mg蛋白或nmol葡萄糖掺入/min/mg蛋白质。
如引言中所述，该方案很容易适应于测量使用ADP-葡萄糖作为葡萄糖供体的糖原合酶的活性。这是通过在反应混合物中用ADP葡萄糖简单地替换UDP-葡萄糖来实现的。此外，反应混合物中省略了NDP激酶和ATP，因为在糖原合酶作用期间释放的ADP是丙酮酸激酶的直接底物。
图1：糖原合酶活性测定的代表性结果。 分光光度计设置为每分钟读取一个读数，总时间为20分钟。 图A显示了预期的短滞后阶段，然后吸光度随时间线性降低（实验）。对照反应中注意到的吸收没有减少。根据线性相中吸光度变化的斜率（5至16分钟）计算反应速率。图B显示了添加过多酶的结果。在这里，NADH在2分钟内耗尽。 请点击这里查看此图的大图。
糖原磷酸化酶活性的测定
图2显示了使用纯化酶的糖原磷酸化酶测定的代表性数据。使用此处使用的制剂，测定呈线性约3分钟。插图显示了从时间 0 到 2.5 分钟绘制的穿过点的回归线。该线的斜率显示吸光度变化率为0.022吸光度单位/分钟。大约 0.01 至 0.04 的吸光度增加速率是最佳的，因为如果存在过多的酶，测定将很快偏离线性。NADPH的形成速率是根据消光系数计算得出的，与NADH一样，消光系数为6220 M-1 cm-1。每形成1摩尔NADPH，糖原磷酸化酶的作用产生1摩尔葡萄糖-1-磷酸。因此，酶活性可以表示为单位时间内从糖原释放的葡萄糖-1-磷酸的量，遵循类似于上述的计算。
反应条件很容易适应那些对变构调节敏感的磷酸化酶。只需将必要的效应器包含在反应预混合物中，即可替代一些水。一个重要的警告是，必须证明效应器本身不会影响偶联酶、磷酸葡萄糖变位酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性。
最后，与上述糖原合酶一样，用作底物的糖原类型可能会影响反应速率。虽然牡蛎糖原与许多物种的磷酸化酶配合良好，但它可能并不总是最佳选择。
图2：糖原磷酸化酶活性测定的代表性结果。 分光光度计设置为每30秒读取一次读数，总时间为10分钟。在糖原磷酸化酶存在下记录的吸光度稳定增加（实验），而未添加磷酸化酶的反应保持在基线（对照）。插图显示了初始反应周期的扩大，显示了产物形成相对于时间的线性。 请点击此处查看此图的大图。
糖原脱支酶活性的测定
图3所示的数据是使用纯化的脱支酶测定的糖原脱支酶的代表。在每个时间点，在没有添加支化酶（对照）的情况下发生的吸收变化从存在支化酶（反应）的情况下发生的吸收变化中减去。然后绘制所得吸光度值。如上所述，通过回归分析从曲线的初始斜率计算NADPH浓度的变化率。在本例中，每单位时间NADPH的增加是线性的，持续10分钟，斜率为0.0079吸光度单位/分钟。虽然这些数据是完全可用的，但添加稍微少一点的酶会得到更浅的斜率，并允许更长的线性相位。或者，可以通过去除等分试样在2分钟和7分钟孵育时进行测量来获取额外的读数。脱支酶活性的测定非常简单，因为脱支酶的α1，6-葡萄糖苷酶活性每释放1摩尔葡萄糖，就会形成1mol的NADPH。因此，反应速率可以表示为磷酸化酶释放的葡萄糖量限制每单位时间糊精，遵循与上述糖原合酶和磷酸化酶测定相同的计算类型。
图3：糖原脱支酶活性测定的代表性结果。 磷酸化酶极限糊精样品用脱支酶处理5、10、20或40分钟。在偶联酶测定中作为NADP还原为NADPH产生的340nm处吸光度的增加，在每个时间点采集的样品中测量。反应呈线性相，持续至少10分钟。 请点击此处查看此图的大图。
糖原支化酶活性的测定
图4显示了糖原支化酶测定的数据。在每个指示的时间点，测量对照和反应样品的吸光度。从相应的对照样品中减去反应样品在660nm处的吸光度，并绘制吸光度差异随时间的变化。然后通过这些点绘制一条回归线（图A）。反应速率可以简单地表示为每单位时间660nm处吸光度的变化。在该测定中可能发生的最大吸光度变化仅为~0.4吸光度单位，代表支化酶对添加的直链淀粉的最大支化（图B）。此外，当反应管的吸光度比对照的吸光度下降超过~0.2个吸光度单位时，测定不再在线性范围内，并且无法估计反应速率（图B）。
在此过程中用作底物的直链淀粉如果冷却或冷冻然后解冻，将很容易开始离开溶液。因此，重要的是使直链淀粉底物溶液新鲜，并确保在使用前没有形成沉淀。
图4：糖原支化酶活性测定的代表性结果。 直链淀粉样品用支化酶处理。在所示时间点取出等分试样并加入酸化碘试剂中。然后在660nm处测量形成的直链淀粉/碘复合物的吸光度。所示数据表示缺乏支化酶的对照孵育和含有支化酶的反应之间的吸光度差异。图A显示由于脱支酶活性在660nm处的吸光度降低，其线性持续~20分钟。 图B说明了测定的窄动态范围，其中可以产生的吸光度的最大变化为~0.4吸光度单位，当吸收变化为~0.2吸光度单位时，线性丢失。 请点击此处查看此图的大图。
糖原分支程度的定性评估
将直链淀粉、支链淀粉、磷酸化酶极限糊精、从酵母中分离的糖原与碘/饱和氯化钙溶液结合，收集所得复合物的吸收光谱（图5）。使用上述方案中给出的糖原，支链淀粉和直链淀粉的质量，获得的最大吸光度读数应约为0.7至0.8，如此处所示（图A和B）。直链淀粉和支链淀粉的最大吸光度分别约为660nm和500nm以及385nm。此处包括磷酸化酶极限糊精，因为收集磷酸化酶极限糊精/碘复合物的吸光度谱可以快速检查在制备该脱支酶底物期间实现的磷酸化酶消化程度。来自大多数来源的糖原产生两个峰，一个在大约400 nm处，另一个峰在460 nm处（图5B）。糖原吸光度光谱的左移表明支化增加/外链长度减少。相反，向右移动表示分支减少/外链长度增加。
饱和氯化钙溶液致密，添加的糖原样品在添加时会在顶部形成一层。因此，需要仔细混合以获得均匀的溶液。此外，如果使用的碳水化合物样品在与氯化钙溶液混合之前没有完全溶解，则比色皿中会形成深色染色的聚集体。这些聚集体显然会阻碍吸收光谱的收集，在进行任何测量之前，确保比色皿中的溶液是透明的，这一点很重要。
图5：糖原分支定性评估的代表性结果。 将纯化的磷酸化酶限度糊精、支链淀粉、直链淀粉（图A）或糖原（图B）的样品与碘/饱和氯化钙溶液合并，所得复合物的吸收光谱测量范围为330 nm至800 nm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
一般来说，所介绍的所有方法的主要优点是成本低、简单、速度快，并且不依赖专用设备。与其他可用方法相比，它们共有的主要缺点是灵敏度。涉及生产或消费NADH/NADPH的程序的敏感性很容易估计。鉴于NADH / NADPH的消光系数为6.22 M-1 cm-1，简单的算术表明可以很容易地检测到~10-20μM浓度的变化。使用本文中描述的测定体积，这对应于测量~10-20 nmol范围内的数量的能力。可以说，这是相当敏感的。然而，可以调整放射性标记底物的比活性，使得灵敏度可以非常容易地提高到分光光度测定的极限之外。尽管支化酶测定和糖原分支的定性评估都依赖于碘和α1，4-连接的葡萄糖聚合物之间复合物的形成，但每种测定的输出是不同的，它们的灵敏度也同样不同。下面讨论所描述的每种测定的具体注意事项。
糖原合酶活性的测定
此处描述的偶联酶测定允许糖原合酶活性的连续测定，这对于动力学参数的测定是有用的。它也很容易扩展，并且已经描述了一种非常相似的程序用于微量滴定板，允许对酶活性进行高度平行的测量28。我们通常将该测定与纯化的重组糖原合酶29一起使用。然而，所描述的程序最初是为用于组织匀浆而开发的（例如，参见Danforth10 和Leloir等人9）。这里需要注意的是，组织匀浆在使用前必须适当稀释。稀释对于降低匀浆的浊度和匀浆中竞争酶/底物的干扰是必要的。此外，为了解释不依赖于糖原合酶活性的NADH消耗，应包括包含除UDP-葡萄糖以外的所有反应组分的空白反应。然后通过从该化合物存在下获得的 UDP-葡萄糖中减去没有 UDP-葡萄糖的 NADH 吸光度的变化率来确定糖原合酶活性。
糖原磷酸化酶活性的测定
与糖原合酶测定一样，磷酸化酶活性的分光光度法测量可以连续进行，而其他磷酸化酶测定是停止测定13。它也很容易适应用于微量滴定板或其他高通量应用15。同样，将其与组织匀浆一起使用需要适当的稀释以减少浊度/干扰反应。例如，葡萄糖-6-磷酸是一种相当丰富的代谢物，它在组织匀浆中的存在将导致通过独立于磷酸化酶活性的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联酶 产生 NADPH。使用组织匀浆时，应包括含有适当稀释的组织匀浆和除磷酸盐和糖原以外的所有其他测定组分的对照反应。然后通过从存在这些化合物的情况下减去在没有糖原/磷酸盐的情况下产生的NADPH来计算磷酸化酶活性。有关各种哺乳动物组织提取物的适当稀释程度的具体建议可以在Mezl等人中找到13。
糖原脱支酶活性的测定
尽管此处描述为停止测定，但该程序可以很容易地适应并以连续的方式进行16。由于该测定依赖于葡萄糖的产生，因此其在粗组织提取物中的使用必须考虑磷酸化酶中葡萄糖的释放限制脱支酶以外的酶糊精，以及通过这些酶对组织提取物中存在的内源性糖原的作用产生葡萄糖。内源性糖原的问题很容易通过不添加磷酸化酶限制糊精的对照反应来解决。其他α-葡萄糖苷酶活性的存在可以在平行反应中估计，其中麦芽糖而不是磷酸化酶限制糊精作为底物存在。
糖原支化酶活性的测定
在讨论的各种定量测定中，比色支化酶测定是迄今为止灵敏度最低的。实际上，据估计，灵敏度比放射化学方法低约50-100倍，其中通过添加支化酶来刺激糖原磷酸化酶反应21。与脱支酶测定类似，分支酶测定对污染性葡萄糖苷酶活性的存在也很敏感，因为直链淀粉的消化会影响碘结合。已经提出了一些解决方法，以允许在存在污染性葡萄糖苷酶活性的情况下使用类似于此处描述的测定30。然而，在我们看来，该测定最适合纯化或部分纯化的糖原支链酶的研究，其中这种干扰活性很小或不存在。
糖原分支程度的定性评估
糖原支化的详细分析相当费力，通常涉及酶消化、化学修饰和多种分离技术的组合来分析生成的产物31。虽然这里描述的比色测定显然不能产生关于糖原精细结构的可比信息，但它确实提供了或多或少支化的简单快速测量。此外，获得的光谱确实包含一些额外的信息。例如，如代表性结果所述，糖原样品通常在~400 nm和~460 nm处具有吸光度峰。~400nm处的峰显然代表糖原颗粒中的短外链，因为它在相对于野生型酵母32缺乏分支酶的酵母突变体中分离的糖原中增强。
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Disclosures
这项工作没有已知的利益冲突，也没有可能影响其结果的财政支持。
Acknowledgments
作者要感谢Karoline Dittmer和Andrew Brittingham的见解和许多有益的讨论。这项工作得到了爱荷华州整骨教育和研究基金（IOER 03-17-05和03-20-04）的部分资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amylopectin (amylose free) from waxy corn | Fisher Scientific | A0456 | |
| Amylose | Biosynth Carbosynth | YA10257 | |
| ATP, disodium salt | MilliporeSigma | A3377 | |
| D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt | MilliporeSigma | G6893 | |
| D-glucose-6-phosphate, sodium salt | MilliporeSigma | G7879 | |
| Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast | MilliporeSigma | 10127655001 | |
| Glycogen, Type II from oyster | MilliporeSigma | G8751 | |
| Hexokinase | MilliporeSigma | 11426362001 | |
| Methacrylate cuvettes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-128 | Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt | MilliporeSigma | N0505 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt | MilliporeSigma | 43420 | |
| Nucleoside 5'-diphosphate kinase | MilliporeSigma | N0379 | |
| Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt | MilliporeSigma | P7127 | |
| Phosphoglucomutase from rabbit muscle | MilliporeSigma | P3397 | |
| Phosphorylase A from rabbit muscle | MilliporeSigma | P1261 | |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | MilliporeSigma | P0294 | |
| UDP-glucose, disodium salt | MilliporeSigma | U4625 |
References
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