I Ovo Intravaskulær injektion i kyllingembryoner

Summary

Det overordnede mål med dette papir er at beskrive, hvordan man udfører intracellulær injektion af eksogene materialer i kyllingembryoner. Denne tilgang er meget nyttig til at studere kyllingembryoners udviklingsbiologi.

Abstract

Som et klassisk modelsystem for embryobiologi er kyllingembryoet blevet brugt til at undersøge embryonal udvikling og differentiering. Levering af eksogene materialer til kyllingembryoner har en stor fordel for at studere genfunktion, transgen avl og kimærpræparation under embryonal udvikling. Her viser vi metoden til in ovo intravaskulær injektion, hvorved eksogene materialer såsom plasmidvektorer eller modificerede urkimceller (PGC'er) kan overføres til donorkyllingembryoner på tidlige udviklingsstadier. Resultaterne viser, at den intravaskulære injektion gennem dorsal aorta og hoved tillader injicerede materialer at diffundere ind i hele embryoet gennem blodcirkulationssystemet. I den præsenterede protokol blev effekten af eksogen plasmid og lentiviral vektorintroduktion og koloniseringen af injicerede eksogene PGC'er i modtagerens gonad bestemt ved at observere fluorescens i embryonerne. Denne artikel beskriver detaljerede procedurer for denne metode og giver derved en fremragende tilgang til at studere genfunktion, embryo- og udviklingsbiologi og gonad-kimær kyllingeproduktion. Afslutningsvis vil denne artikel gøre det muligt for forskere at udføre i ovo intravaskulær injektion af eksogene materialer i kyllingembryoner med stor succes og reproducerbarhed.

Introduction

Kyllingembryoner har været meget udbredt i århundreder i udviklingsmæssige, immunologiske, patologiske og andre biologiske anvendelser ^1,2,3. De har mange iboende fordele i forhold til andre dyremodeller i studiet af toksikologi og cellebiologi⁴. Kyllingeembryoner er let tilgængelige og kan manipuleres in vitro og observeres direkte på ethvert udviklingsstadium, hvilket giver et praktisk embryoforskningsmodelsystem.

Generelt har de nuværende kyllingembryoleveringsmetoder såsom elektrotransfektion og subgerminalhulrumsinjektion begrænsninger såsom kravet om specialudstyr og et designet program og ineffektivitet på grund af tilstedeværelsen af æggeblomme og albumen ^5,6,7. Her viser vi en enkel og effektiv håndteringsmetode til levering af eksogene materialer til kyllingembryoner. Dette kan være et kraftfuldt værktøj, der anvendes til studiet af udviklingsbiologi. De injicerede materialer spredes til hele embryoet via blodcirkulationen. Under den tidlige udvikling af kyllingeembryoner kunne PGC'erne migrere gennem blod, kolonisere kønsryggen og derefter udvikle sig til kønsceller, som giver en værdifuld mulig vej til at levere eksogene materialer⁸. Nu er denne metode blevet anvendt i vid udstrækning i studiet af genfunktion, embryo- og udviklingsbiologi og kimær og transgen kyllingeproduktion ^9,10,11.

In ovo intravaskulær injektion i kyllingembryoner er en veletableret og almindeligt anvendt metode 12,13,14. I dette papir viser vi en omfattende beskrivelse af denne protokol, herunder injektionsmaterialer, steder, dosering og repræsentative resultater.

Protocol

Alle procedurer, der involverer pleje og brug af dyr, var i overensstemmelse med US National Institute of Health retningslinjer (NIH Pub. nr. 85-23, revideret 1996), og kyllingeembryoprotokollerne blev godkendt af Laboratory Animal Management and Experimental Animal Ethics Committee ved Yangzhou University, Kina (nr. 201803124).

1. Opsamling og tilberedning af befrugtede æg

BEMÆRK: I modsætning til pattedyr har kyllingen millioner af follikler i en enkelt æggestok, men kun få af disse follikler er modne nok til ægløsning. Hver follikel indeholder en oocyt eller kimcelle. Så snart follikelen modnes og frigiver sin æggeblomme, er den indarbejdet i æggelederens tragt. Når follikelen kommer ind i oviduktens jugulære mave, binder sæd til ægget i hønens krop, og calciumet i hønens krop danner en skal, der omslutter det befrugtede æg og danner et blødskallet æg i kroppen. Calciumskallen tykner gradvist, indtil ægget produceres.

1. Saml befrugtede æg fra en lokal leverandør eller institution, som kan opbevares ved 16 ° C i 1 uge.
   BEMÆRK: Den høje opbevaringstemperatur hjælper embryoet med at udvikle sig, mens den lave temperatur vil reducere embryoets levedygtighed. Embryonerne vil ikke udvikle sig, hvis opbevaringstiden er for lang.
2. Skrub æggeskallen blødt og langsomt med 75% ethanol, inden æggene overføres til inkubatoren.
3. Placer æggene sidelæns, pænt på et stativ i en inkubator ved 37,8 ° C og 60% fugtighed. Efter 60 timers inkubation (HH trin 17) vil embryoner udvikle synlige blodkar, og hjertet begynder at slå¹⁵.
   BEMÆRK: Efter 2 dages inkubation vises små primordiale prikker, det tidlige stadium af hjertet. Denne proces kaldes cherrybeading. Efter ~ 2,5 dage dannes hjerte- og andre kropssegmenter med synlige kar.

2. Forberedelse før injektion

1. Forbered glaskapillærer, der vil blive brugt som nåle. Før injektionen trækkes 90 mm glaskapillærer med en ydre diameter på 1 mm og en indvendig diameter på 0,6 mm ved hjælp af trækkeren. Bryd spidser ved hjælp af tang (vinklen på glaskapillær er normalt 45 °) og steriliser kapillærerne under UV-lys i 2 timer.
2. Forbered eksogene materialer såsom plasmider, emballerede lentivirus og PGC'er.
   1. Bland forsigtigt plasmidet pEGFP-N1 (et forbedret GFP-ekspressionsplasmid, 1μg/μL) med liposomet i forholdet 1:3 (m/v). Tilsæt vand for at opnå en endelig DNA-koncentration på 10 ng/μL. Lad DNA-blandingen sidde ved 37 °C i 20 minutter før injektion.
   2. Optø vira på is før injektion. Titeren af lentivirus, der anvendes til injektion, skal være over 5 x 10⁶ Tu/ ml.
   3. Fortynd forældre- eller modificerede gonad PGC'er (E4.5, HH-trin 24) til 2.000-5.000 celler / μL.
      BEMÆRK: Her har vi vist injektionsproceduren ved hjælp af trypanblå.

3. Vindue

1. Før du udsætter embryonerne, steriliseres dem ved forsigtigt og blødt at tørre overfladen af æggeskallerne med 75% alkohol ved hjælp af en bomuldskugle, hvilket sikrer at sterilisere æggens stumpe kant grundigt.
2. Efter steriliseringen skal du forsigtigt trykke på den stumpe ende med tang for at skabe et lille vindue (0,5 cm x 0,5 cm) på æggeskaloverfladen for at udsætte embryoet. Fjern embryomembranen, og læg derefter ægget på holderen under dissektionsmikroskopet.

4. Injektion

1. Kig efter blodkar under mikroskopet og juster dissektionsmikroskopets fokus for at lokalisere embryoet, og find derefter blodkarret klar til injektion.
2. Fyld glasnålen med den eksogene opløsning (plasmid, lentivirus eller PGC'er) ved hjælp af en pipette langsomt, og undgå luftboblernålen.
3. Ret nålen med eksogen opløsning mod blodkarret, hvor nålen parallelt med blodkarret injiceres.
4. Indsæt forsigtigt den fyldte nål i beholderen, og tænd pumpen for at skubbe opløsningen ud (normalt er det injicerede volumen ~ 1-5 μL) under mikroskopet. Luftpumpetrykket skal være lavt nok til at forhindre ødelæggelse af kar, da det for høje lufttryk ville beskadige blodkar, der fører til højhastighedsstrømning.
   1. Når den eksogene opløsning er injiceret i beholderen, skal det sikres, at beholderens farve bliver til opløsningsfarven og genvinder til rød i 2-5 s, hvilket indikerer, at den eksogene opløsning med succes leveres til beholderen. På dette tidspunkt kommer opløsningen ind i arterien, og med hjertets slag cirkuleres tilbage til embryoet gennem arterien og derefter til venen.
      BEMÆRK: Der er to injektionssteder til vaskulær injektion (figur 1B): det ene er hovedet, hvor den eksogene opløsning injiceres fra venen i embryoets hoved og ind i hjertet gennem blodgennemstrømningen og derefter cirkulerer til hele embryoet med hjertet slår (figur 1B, pil 1). En anden er gennem den dorsale aorta af embryoblod; den eksogene opløsning injiceres og spredes til hele embryoet (figur 1B. Pil 2) med det embryonale hjertes slag.
5. Efter injektion fjernes ægget fra stereomikroskopet og slipper 200 μL Penicillinopløsning inde i æggeskallen. Skær et 3 cm langt stykke medicinsk tape og forsegl vinduet. Skrab forsigtigt båndet med en saks for at presse eventuelle luftbobler ud, og skær derefter et andet stykke for at forsegle åbningen på tværs.
6. Mærk og læg det injicerede æg tilbage i inkubatoren og inkuber indtil det krævede udviklingsstadium eller ruge.

Representative Results

Vi viser her in ovo intravaskulær injektion af kyllingembryoner. En skematisk proces for den intravaskulære injektion er vist i figur 1; I vores undersøgelse brugte vi forskellige eksogene opløsninger til at teste og verificere injektion.

For bedre at visualisere de injicerede materialer blev Trypan Blue (0,4%) injiceret som sporstof i embryoet. Sporstoffet (blåt) blev observeret at diffundere til hele embryoet via blodcirkulationen ved enten dorsal aorta eller hovedinjektion (figur 2). Materialer injiceret på to forskellige steder var i stand til at sprede sig til hele embryoet, hvilket indikerer diffusionen gennem blodcirkulationen. Visualiseringen af den blå farve bekræfter injektionens succes.

pEGFP-N1-vektoren blev pakket ind med PEI for at opnå en koncentration på 1 μg/μL, mens den lentivirale vektor pLVX-EGFP blev pakket ind med PEI og fortyndet efter titrering for at opnå en viruskoncentration på 5 x 10⁶ Tu/μL. De 2,5 dages embryoner (HH-trin 14-15) blev injiceret med indpakket pEGFP-N1 eller pLVX-EGFP. Efter 4,5 dage (HH-trin 24) blev embryonerne observeret ved hjælp af stereoskopisk fluorescensmikroskopi. Grøn fluorescens blev observeret i embryoet, der indikerer vektorekspressionen efter injektion. Resultaterne viser, at indkapslede plasmider med liposomer (PEI) og emballeret lentivirus blev udtrykt i kyllingeembryoet 2 dage efter injektionen (figur 3). Resultaterne af plasmid- og lentiviral vektorinjektion viste det eksogene genekspression i embryoet, hvilket indebærer den mulige anvendelse i genoverførsel.

PGC'erne blev isoleret fra embryonernes genitale højderyg (E4.5, HH stadium 24) og dyrket til oprensning som i den foregående publikation¹⁶. De injicerede PGC'er blev mærket med det røde fluorescerende protein (RFP). Ved E6,0 dage (HH-stadium 28) blev gonaden af recipientembryoner isoleret og observeret. Resultaterne viste, at donor-PGC'erne (røde punkter) var i stand til effektivt at komme ind og kolonisere modtagerens gonord (figur 4).

Figur 1: Skemaet for den intravaskulære injektion. A) tidslinjen for den intravaskulære injektion B) To injektionssteder, der er angivet med sorte pile, hovedet (1) og den dorsale aorta (2) (C) Processen med den intravaskulære injektion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Diffusion af sporingsfarvestoffet på forskellige injektionssteder. Øverst: dorsal aorta; Nederst: Hoved. Skalabjælke = 50 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Ekspression af GFP i embryoner 2 dage efter lentiviral vektor og indkapslet plasmidinjektion. Skalabjælke = 100 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Visualisering af injicerede røde fluorescensmærkede PGC'er i modtagerens kyllingembryo. (E6.0, HH trin 28) gonad. Skalabjælke = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Metoden til in ovo intravaskulær injektion af kyllingembryoner er optimeret til eksogene materialer (vektor, viral eller PGC'er), der skal overføres til embryoet. Baseret på denne metode konstruerede vi kyllingeembryomodeller med stabil genoverekspression eller interferens (SpinZ, JUN, UBE2I osv.) 17,18,19. Disse veletablerede modeller viser gennemførligheden af denne tilgang. Derudover overførte vi ikke kun isolerede PGC'er til modtagerens embryo gonad, men producerede også med succes det levedygtige afkom med embryo gonad transplanteret med inducerede PGC'er, hvilket indebærer den store anvendelse af denne metode i fremtiden²⁰.

Det kritiske trin i metoden er injektionen. De eksogene materialer skal injiceres direkte i blodkarrene, ikke for dybe eller for overfladiske. Det kræver således erfaring med at arbejde med kyllingeembryoner og høje injektionsfærdigheder, som let kunne opnås gennem praksis. Sammenlignet med luftcelleinjektionen opnås høj injektionseffektivitet og nøjagtighed lettere ved hjælp af denne metode. Ud over begrænsningerne ved høje omkostninger og komplicerede trin anvendes elektrotransfektion ikke, når der laves et stort vindue, da det kan føre til en lav overlevelsesrate.

Som en metode til genmanipulation i kyllingembryoner har metoden også nogle begrænsninger. Omkring halvdelen af æggene var døde under inkubationen efter injektion med en overlevelsesrate på 40%-60%. I mellemtiden er leveringseffektiviteten en anden vigtig faktor at overveje, især for PGC-injektion (i vores tilfælde er effektiviteten af plasmid- og lentivirusinjektion ~ 50% -60%, og PGC-injektion er ~ 30% -40%). I fremtiden kan protokollen optimeres, og overlevelsesraten kan øges betydeligt, hvilket yderligere forbedrer anvendelsesområdet for denne metode.

Afslutningsvis viser denne protokol, at in ovo kyllingembryoets intravaskulære injektion er specifik for eksogene materialer (vektorer eller PGC'er), der skal overføres til embryonerne. Desuden kan denne metode let læres og anvendes på mange områder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescence macro-microscope	OLYMPUS	MVX10
Glass Capillaries	Narishige	G1
Lipofectamine 2000	Invitrogen	12566014	liposome
pEGFP-N1 vector	Clontech	#6085-1
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit	Sigma	PKH26GL
pLVX-EGFP lentivirus vector	Addgene	128652
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
Puller	Narishige	PC-100
Trypan Blue Stain	Gibco	15250061