Summary
L’objectif global de cet article est de décrire comment effectuer une injection intracellulaire ovo de matériaux exogènes dans des embryons de poulet. Cette approche est très utile pour étudier la biologie du développement des embryons de poulet.
Abstract
En tant que système modèle classique de biologie embryonnaire, l’embryon de poulet a été utilisé pour étudier le développement embryonnaire et la différenciation. L’administration de matériaux exogènes dans des embryons de poulet présente un grand avantage pour l’étude de la fonction des gènes, de la reproduction transgénique et de la préparation de chimères pendant le développement embryonnaire. Nous montrons ici la méthode d’injection intravasculaire inovo par laquelle des matériaux exogènes tels que des vecteurs plasmidiques ou des cellules germinales primordiales modifiées (PGC) peuvent être transférés dans des embryons de poulet donneurs à des stades précoces de développement. Les résultats montrent que l’injection intravasculaire à travers l’aorte dorsale et la tête permet aux matériaux injectés de diffuser dans l’embryon entier à travers le système circulatoire sanguin. Dans le protocole présenté, l’efficacité de l’introduction de plasmides exogènes et de vecteurs lentiviraux, ainsi que la colonisation des PGC exogènes injectés dans la gonade receveuse, ont été déterminées en observant la fluorescence dans les embryons. Cet article décrit les procédures détaillées de cette méthode, fournissant ainsi une excellente approche pour étudier la fonction des gènes, la biologie embryonnaire et du développement, et la production de poulet gonade-chimérique. En conclusion, cet article permettra aux chercheurs d’effectuer en injection ovo-intravasculaire de matériaux exogènes dans des embryons de poulet avec beaucoup de succès et de reproductibilité.
Introduction
Les embryons de poulet sont largement utilisés depuis des siècles dans des applications développementales, immunologiques, pathologiques et biologiques 1,2,3. Ils présentent de nombreux avantages inhérents par rapport aux autres modèles animaux dans l’étude de la toxicologie et de la biologie cellulaire4. Les embryons de poulet sont facilement accessibles et peuvent être manipulés in vitro et directement observés à n’importe quel stade de développement, ce qui fournit un système pratique de modèle de recherche sur les embryons.
En général, les méthodes actuelles d’administration d’embryons de poulet telles que l’électrotransfection et l’injection de cavité sous-germinale ont des limites telles que l’exigence d’un équipement spécialisé et d’un programme conçu, et l’inefficacité due à la présence de jaune et d’albumine 5,6,7. Nous montrons ici une méthode de manipulation simple et efficace pour délivrer des matériaux exogènes dans des embryons de poulet. Cela peut être un outil puissant utilisé dans l’étude de la biologie du développement. Les matières injectées se propagent à l’embryon entier par circulation sanguine. Au cours du développement précoce des embryons de poulet, les PGC pourraient migrer dans le sang, coloniser la crête génitale, puis se développer en gamètes, ce qui constitue un moyen précieux de délivrer des matériaux exogènes8. Maintenant, cette méthode a été largement utilisée dans l’étude de la fonction des gènes, de la biologie embryonnaire et du développement, et de la production de poulet chimérique et transgénique 9,10,11.
L’injection intravasculaire inovo dans des embryons de poulet est une méthode bien établie et couramment utilisée 12,13,14. Dans cet article, nous montrons une description complète de ce protocole, y compris les matériaux d’injection, les sites, la posologie et les résultats représentatifs.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant le soin et l’utilisation d’animaux étaient conformes aux directives de l’Institut national de la santé des États-Unis (NIH Pub. n° 85-23, révisée en 1996) et les protocoles sur les embryons de poulet ont été approuvés par le Comité de gestion des animaux de laboratoire et d’éthique des animaux expérimentaux de l’Université de Yangzhou, en Chine (n° 201803124).
1. Collecte et préparation des ovules fécondés
REMARQUE: Contrairement aux mammifères, le poulet a des millions de follicules dans un seul ovaire, mais seuls quelques-uns de ces follicules sont assez matures pour ovuler. Chaque follicule contient un ovocyte ou une cellule germinale. Dès que le follicule mûrit et libère son jaune, il est incorporé dans l’entonnoir de la trompe de Fallope. Lorsque le follicule pénètre dans l’abdomen jugulaire de l’oviducte, le sperme se lie à l’œuf dans le corps de la poule et le calcium dans le corps de la poule forme une coquille qui enveloppe l’œuf fécondé, formant un œuf à carapace molle dans le corps. La coquille de calcium s’épaissit progressivement jusqu’à ce que l’œuf soit produit.
- Recueillez les œufs fécondés auprès d’un vendeur ou d’une institution locale, qui peuvent être conservés à 16 ° C pendant 1 semaine.
REMARQUE: La température de stockage élevée aidera l’embryon à se développer, tandis que la basse température diminuera la viabilité de l’embryon. Les embryons ne se développeront pas si le temps de stockage est trop long. - Frottez la coquille d’œuf doucement et lentement avec de l’éthanol à 75% avant de transférer les œufs dans l’incubateur.
- Placez les œufs sur le côté, soigneusement sur une grille dans un incubateur à 37,8 °C et 60% d’humidité. Après 60 h d’incubation (stade HH 17), les embryons développeront des vaisseaux sanguins visibles et le cœur commencera à battre15.
REMARQUE: Après 2 jours d’incubation, de petits points primordiaux, au stade précoce du cœur, apparaissent. Ce processus est appelé perlage de cerise. À ~ 2,5 jours, le cœur et d’autres segments du corps sont formés avec des vaisseaux visibles.
2. Préparation avant injection
- Préparez des capillaires en verre qui seront utilisés comme aiguilles. Avant l’injection, tirez des capillaires en verre de 90 mm d’un diamètre extérieur de 1 mm et d’un diamètre intérieur de 0,6 mm à l’aide de l’extracteur. Casser les pointes à l’aide de pinces (l’angle du capillaire en verre est généralement de 45°) et stériliser les capillaires sous la lumière UV pendant 2 h.
- Préparez des matériaux exogènes tels que des plasmides, des lentivirus emballés et des PGC.
- Mélanger doucement le plasmide pEGFP-N1 (un plasmide exprimant le GFP amélioré, 1μg/μL) avec le liposome à un rapport de 1:3 (m/v). Ajouter de l’eau pour obtenir une concentration finale d’ADN de 10 ng/μL. Laisser reposer le mélange d’ADN à 37 °C pendant 20 min avant l’injection.
- Décongeler les virus sur la glace avant l’injection. Le titre du lentivirus utilisé pour l’injection doit être supérieur à 5 x 106 Tu/mL.
- Diluer les PGC gonivaux parentaux ou modifiés (E4.5, HH stade 24) à 2 000-5 000 cellules/μL.
REMARQUE: Ici, nous avons montré la procédure d’injection en utilisant le bleu de trypan.
3. Fenêtrage
- Avant d’exposer les embryons, stérilisez-les en essuyant doucement et doucement la surface des coquilles d’œufs avec 75% d’alcool à l’aide d’une boule de coton, en veillant à stériliser soigneusement le bord émoussé des œufs.
- Après la stérilisation, tapotez doucement l’extrémité émoussée avec une pince pour créer une petite fenêtre (0,5 cm x 0,5 cm) sur la surface de la coquille d’œuf pour exposer l’embryon. Retirez la membrane embryonnaire, puis placez l’œuf sur le support sous le microscope à dissection.
4. Injection
- Recherchez les vaisseaux sanguins sous le microscope et ajustez la mise au point du microscope à dissection pour localiser l’embryon, puis trouvez le vaisseau sanguin prêt à être injecté.
- Remplissez l’aiguille en verre avec la solution exogène (plasmide, lentivirus ou PGC) à l’aide d’une pipette lentement, en évitant les bulles d’air dans l’aiguille.
- Dirigez l’aiguille avec une solution exogène vers le vaisseau sanguin, l’aiguille étant parallèle au vaisseau sanguin injecté.
- Insérez doucement l’aiguille remplie dans le récipient et allumez la pompe pour éjecter la solution (généralement le volume injecté est d’environ 1-5 μL) sous le microscope. La pression de la pompe à air doit être suffisamment basse pour empêcher la destruction des vaisseaux, car la pression d’air excessivement élevée endommagerait les vaisseaux sanguins conduisant à un débit à grande vitesse.
- Une fois la solution exogène injectée dans le récipient, assurez-vous que la couleur du récipient se transforme en couleur de la solution et redonne au rouge en 2-5 s, indiquant que la solution exogène est livrée avec succès au vaisseau. À ce stade, la solution pénètre dans l’artère et, avec le battement du cœur, est renvoyée à l’embryon par l’artère, puis à la veine.
REMARQUE: Il existe deux sites d’injection vasculaire (Figure 1B): l’un est la tête, où la solution exogène est injectée de la veine dans la tête de l’embryon et dans le cœur par le flux sanguin, puis circule vers l’embryon entier avec le cœur battant (Figure 1B, Flèche 1). Un autre est à travers l’aorte dorsale du sang embryonnaire; la solution exogène est injectée et se propage à l’embryon entier (Figure 1B. Flèche 2) avec le battement du cœur embryonnaire.
- Une fois la solution exogène injectée dans le récipient, assurez-vous que la couleur du récipient se transforme en couleur de la solution et redonne au rouge en 2-5 s, indiquant que la solution exogène est livrée avec succès au vaisseau. À ce stade, la solution pénètre dans l’artère et, avec le battement du cœur, est renvoyée à l’embryon par l’artère, puis à la veine.
- Après l’injection, retirez l’œuf du stéréomicroscope et déposez 200 μL de solution de pénicilline à l’intérieur de la coquille de l’œuf. Coupez un morceau de ruban adhésif médical de 3 cm de long et scellez la fenêtre. Grattez doucement le ruban adhésif avec des ciseaux pour extraire les bulles d’air, puis coupez un autre morceau pour sceller l’ouverture.
- Étiquetez et replacez l’œuf injecté dans l’incubateur et incubez jusqu’au stade de développement ou d’éclosion requis.
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Representative Results
Nous montrons ici l’injection in ovo intravasculaire d’embryons de poulet. Un processus schématique de l’injection intravasculaire est illustré à la figure 1; dans notre étude, nous avons utilisé diverses solutions exogènes pour tester et vérifier l’injection.
Pour mieux visualiser les matériaux injectés, Trypan Blue (0,4%) a été injecté comme traceur dans l’embryon. On a observé que le traceur (bleu) diffusait vers l’embryon entier par circulation sanguine par l’aorte dorsale ou par injection de tête (figure 2). Les matériaux injectés à deux sites différents ont pu se propager à l’embryon entier, indiquant la diffusion par la circulation sanguine. La visualisation de la couleur bleue confirme le succès de l’injection.
Le vecteur pEGFP-N1 a été enveloppé avec PEI pour atteindre une concentration de 1 μg/μL, tandis que le vecteur lentiviral pLVX-EGFP a été enveloppé avec PEI et dilué après titrage pour atteindre une concentration virale de 5 x 106 Tu/μL. Les embryons de 2,5 jours (HH stade 14-15) ont été injectés avec pEGFP-N1 ou pLVX-EGFP enveloppé. À 4,5 jours (stade HH 24), les embryons ont été observés à l’aide de la microscopie à fluorescence stéréoscopique. Une fluorescence verte a été observée dans l’embryon indiquant l’expression du vecteur après injection. Les résultats montrent que les plasmides encapsulés par liposomes (PEI) et le lentivirus emballé ont été exprimés dans l’embryon de poulet 2 jours après l’injection (Figure 3). Les résultats de l’injection de plasmides et de vecteurs lentiviraux ont prouvé l’expression génique exogène dans l’embryon, ce qui implique l’application possible dans le transfert de gènes.
Les PGC ont été isolés de la crête génitale des embryons (E4.5, HH stade 24) et cultivés pour la purification comme dans la publication précédente16. Les PGC injectés ont été marqués avec la protéine fluorescente rouge (RFP). À E6,0 jours (stade HH 28), la gonade des embryons receveurs a été isolée et observée. Les résultats ont montré que les PGC donneurs (points rouges) étaient capables d’entrer efficacement dans les gonades du receveur et de les coloniser (Figure 4).
Figure 1 : Schéma de l’injection intravasculaire. A) Le calendrier de l’injection intravasculaire; (B) Deux sites d’injection indiqués par des flèches noires, la tête (1) et l’aorte dorsale (2); (C) Le processus d’injection intravasculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Diffusion du colorant calque dans différents sites d’injection. Haut: aorte dorsale; En bas : Tête. Barre d’échelle = 50 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Expression de la GFP chez les embryons 2 jours après l’injection de vecteur lentiviral et de plasmide encapsulé. Barre d’échelle = 100 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : Visualisation des PGC injectés marqués par fluorescence rouge dans l’embryon de poulet receveur. (E6.0, HH stade 28) gonade. Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthode d’injection inovo-intravasculaire d’embryons de poulet est optimisée pour que des matériaux exogènes (vecteurs, viraux ou PGC) soient transférés dans l’embryon. Sur la base de cette méthode, nous avons construit des modèles d’embryons de poulet avec une surexpression ou une interférence génétique stable (SpinZ, JUN, UBE2I, etc.) 17,18,19. Ces modèles bien établis prouvent la faisabilité de cette approche. De plus, nous avons non seulement transféré des PGC isolés à la gonade embryonnaire du receveur, mais nous avons également produit avec succès la progéniture viable avec une gonade embryonnaire transplantée avec des PGC induits, ce qui implique la grande application de cette méthode dans le futur20.
L’étape critique de la méthode est l’injection. Les matières exogènes doivent être injectées directement dans les vaisseaux sanguins, ni trop profond ni trop peu profond. Ainsi, cela nécessite une expérience de travail avec des embryons de poulet et des compétences d’injection élevées qui pourraient être facilement obtenues par la pratique. Par rapport à l’injection de cellules d’air, une efficacité et une précision d’injection élevées sont plus facilement obtenues en utilisant cette méthode. En plus des limites du coût élevé et des étapes compliquées, l’électrotransfection n’est pas appliquée lorsqu’une grande fenêtre est faite, car elle peut conduire à un faible taux de survie.
En tant que méthode de manipulation génétique chez les embryons de poulet, la méthode présente également certaines limites. Environ la moitié des œufs étaient morts pendant l’incubation après l’injection avec un taux de survie de 40% à 60%. Pendant ce temps, l’efficacité de l’administration est un autre facteur important à considérer, en particulier pour l’injection de PGC (dans notre cas, l’efficacité de l’injection de plasmide et de lentivirus est d’environ 50% à 60% et celle de l’injection de PGC est d’environ 30% à 40%). À l’avenir, le protocole pourrait être optimisé et le taux de survie pourrait être considérablement augmenté, améliorant encore le champ d’application de cette méthode.
En conclusion, ce protocole démontre que l’injection intravasculaire d’embryons de poulet inovo est spécifique pour les matériaux exogènes (vecteurs ou PGC) à transférer dans les embryons. De plus, cette méthode peut être facilement apprise et appliquée dans de nombreux domaines.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31972547). Nous apprécions la révision de Jing Wang et la voix off de Malik Donlic à la Washington State University, aux États-Unis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
References
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