Summary
L'obiettivo generale di questo articolo è quello di descrivere come eseguire l'iniezione intracellulare ovo di materiali esogeni in embrioni di pollo. Questo approccio è molto utile per studiare la biologia dello sviluppo degli embrioni di pollo.
Abstract
Come sistema modello classico di biologia embrionale, l'embrione di pollo è stato utilizzato per studiare lo sviluppo e la differenziazione embrionale. La consegna di materiali esogeni in embrioni di pollo ha un grande vantaggio per lo studio della funzione genica, dell'allevamento transgenico e della preparazione della chimera durante lo sviluppo embrionale. Qui mostriamo il metodo di iniezione intravascolare in ovo in cui materiali esogeni come vettori plasmidici o cellule germinali primordiali modificate (PGC) possono essere trasferiti in embrioni di pollo donatori nelle prime fasi dello sviluppo. I risultati mostrano che l'iniezione intravascolare attraverso l'aorta dorsale e la testa consente ai materiali iniettati di diffondersi nell'intero embrione attraverso il sistema circolatorio del sangue. Nel protocollo presentato, l'efficacia dell'introduzione di plasmidi esogeni e vettori lentivirali e la colonizzazione di PGC esogeni iniettati nella gonade ricevente sono state determinate osservando la fluorescenza negli embrioni. Questo articolo descrive le procedure dettagliate di questo metodo, fornendo così un approccio eccellente allo studio della funzione genica, della biologia dell'embrione e dello sviluppo e della produzione di pollo gonad-chimeric. In conclusione, questo articolo consentirà ai ricercatori di eseguire in ovo iniezione intravascolare di materiali esogeni in embrioni di pollo con grande successo e riproducibilità.
Introduction
Gli embrioni di pollo sono stati ampiamente utilizzati per secoli in applicazioni di sviluppo, immunologiche, patologiche e altre applicazioni biologiche 1,2,3. Hanno molti vantaggi intrinseci rispetto ad altri modelli animali nello studio della tossicologia e della biologia cellulare4. Gli embrioni di pollo sono facilmente accessibili e possono essere manipolati in vitro e osservati direttamente in qualsiasi fase dello sviluppo, il che fornisce un pratico sistema di modelli di ricerca sugli embrioni.
In generale, gli attuali metodi di consegna dell'embrione di pollo come l'elettrotrasfezione e l'iniezione subgerminale-cavità hanno limitazioni come la necessità di attrezzature specialistiche e un programma progettato e l'inefficienza dovuta alla presenza di tuorlo e albume 5,6,7. Qui mostriamo un metodo di manipolazione semplice ed efficiente per la consegna di materiali esogeni in embrioni di pollo. Questo può essere un potente strumento utilizzato nello studio della biologia dello sviluppo. I materiali iniettati si diffondono all'intero embrione attraverso la circolazione sanguigna. Durante lo sviluppo precoce degli embrioni di pollo, i PGC potrebbero migrare attraverso il sangue, colonizzare la cresta genitale e quindi svilupparsi in gameti, che forniscono un prezioso percorso possibile per fornire materiali esogeni8. Ora, questo metodo è stato ampiamente utilizzato nello studio della funzione genica, della biologia dell'embrione e dello sviluppo e della produzione chimerica e transgenica di pollo 9,10,11.
Nell'iniezione intravascolare di ovo negli embrioni di pollo è un metodo ben consolidato e comunemente usato 12,13,14. In questo documento, mostriamo una descrizione completa di questo protocollo, inclusi materiali di iniezione, siti, dosaggio e risultati rappresentativi.
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono la cura e l'uso di animali sono conformi alle linee guida del National Institute of Health degli Stati Uniti (NIH Pub. No. 85-23, rivisto nel 1996) e ai protocolli sugli embrioni di pollo sono stati approvati dal Comitato per la gestione degli animali da laboratorio e l'etica degli animali sperimentali dell'Università di Yangzhou, Cina (n. 201803124).
1. Raccolta e preparazione degli ovuli fecondati
NOTA: A differenza dei mammiferi, il pollo ha milioni di follicoli in una singola ovaia, ma solo alcuni di questi follicoli sono abbastanza maturi da ovulare. Ogni follicolo contiene un ovocita o una cellula germinale. Non appena il follicolo matura e rilascia il suo tuorlo, viene incorporato nell'imbuto della tuba di Falloppio. Quando il follicolo entra nell'addome giugulare dell'ovidotto, lo sperma si lega all'uovo nel corpo della gallina e il calcio nel corpo della gallina forma un guscio che avvolge l'uovo fecondato, formando un uovo dal guscio morbido nel corpo. Il guscio di calcio si ispessisce gradualmente fino a produrre l'uovo.
- Raccogli le uova fecondate da un venditore o da un'istituzione locale, che possono essere conservate a 16 ° C per 1 settimana.
NOTA: l'alta temperatura di conservazione aiuterà l'embrione a svilupparsi, mentre la bassa temperatura diminuirà la vitalità dell'embrione. Gli embrioni non riusciranno a svilupparsi se il tempo di conservazione è troppo lungo. - Strofinare il guscio d'uovo dolcemente e lentamente con etanolo al 75% prima di trasferire le uova nell'incubatrice.
- Posizionare le uova lateralmente, ordinatamente su un rack in un'incubatrice a 37,8 °C e al 60% di umidità. Dopo 60 ore di incubazione (stadio HH 17), gli embrioni svilupperanno vasi sanguigni visibili e il cuore inizierà a battere15.
NOTA: Dopo 2 giorni di incubazione, compaiono piccoli punti primordiali, lo stadio iniziale del cuore. Questo processo è chiamato cherrybeading. A ~ 2,5 giorni, il cuore e altri segmenti del corpo si formano con vasi visibili.
2. Preparazione prima dell'iniezione
- Preparare capillari di vetro che verranno utilizzati come aghi. Prima dell'iniezione, tirare capillari di vetro da 90 mm con un diametro esterno di 1 mm e un diametro interno di 0,6 mm utilizzando l'estrattore. Rompere le punte usando una pinza (l'angolo del capillare di vetro di solito è di 45 °) e sterilizzare i capillari sotto la luce UV per 2 ore.
- Preparare materiali esogeni come plasmidi, lentivirus confezionati e PGC.
- Mescolare delicatamente il plasmide pEGFP-N1 (un plasmide che esprime GFP potenziato, 1μg / μL) con il liposoma in un rapporto 1: 3 (m / v). Aggiungere acqua per ottenere una concentrazione finale di DNA di 10 ng/μL. Lasciare riposare la miscela di DNA a 37 °C per 20 minuti prima dell'iniezione.
- Scongelare i virus sul ghiaccio prima dell'iniezione. Il titolo di lentivirus usato per l'iniezione deve essere superiore a 5 x 106 Tu/mL.
- PGC parentali o gonadi modificate diluite (E4.5, stadio HH 24) a 2.000-5.000 cellule/μL.
NOTA: Qui abbiamo mostrato la procedura di iniezione con tripano blu.
3. Finestre
- Prima di esporre gli embrioni, sterilizzarli pulendo delicatamente e delicatamente la superficie dei gusci d'uovo con alcool al 75% usando un batuffolo di cotone, assicurandosi di sterilizzare accuratamente il bordo smussato delle uova.
- Dopo la sterilizzazione, picchiettare delicatamente l'estremità smussata con una pinza per creare una piccola finestra (0,5 cm x 0,5 cm) sulla superficie del guscio d'uovo per esporre l'embrione. Rimuovere la membrana dell'embrione e quindi posizionare l'uovo sul supporto sotto il microscopio di dissezione.
4. Iniezione
- Cerca i vasi sanguigni al microscopio e regola la messa a fuoco del microscopio di dissezione per localizzare l'embrione, quindi trova il vaso sanguigno pronto per l'iniezione.
- Riempire l'ago di vetro con la soluzione esogena (plasmide, lentivirus o PGC) usando una pipetta lentamente, evitando bolle d'aria nell'ago.
- Puntare l'ago con soluzione esogena sul vaso sanguigno, con l'ago parallelo al vaso sanguigno iniettato.
- Inserire delicatamente l'ago riempito nel recipiente e accendere la pompa per espellere la soluzione (di solito il volume iniettato è ~ 1-5 μL) al microscopio. La pressione della pompa dell'aria dovrebbe essere abbastanza bassa da impedire la distruzione dei vasi, poiché la pressione dell'aria eccessivamente elevata danneggerebbe i vasi sanguigni portando a un flusso ad alta velocità.
- Una volta che la soluzione esogena viene iniettata nel recipiente, assicurarsi che il colore del recipiente si trasformi nel colore della soluzione e si riprenda in rosso in 2-5 s, indicando che la soluzione esogena viene consegnata con successo alla nave. A questo punto la soluzione entra nell'arteria, e con il battito del cuore viene fatta circolare di nuovo all'embrione attraverso l'arteria, e poi alla vena.
NOTA: Ci sono due siti di iniezione per l'iniezione vascolare (Figura 1B): uno è la testa, dove la soluzione esogena viene iniettata dalla vena nella testa dell'embrione e nel cuore attraverso il flusso sanguigno, quindi circola all'intero embrione con il battito cardiaco (Figura 1B, Freccia 1). Un altro è attraverso l'aorta dorsale del sangue embrionale; la soluzione esogena viene iniettata e si diffonde all'intero embrione (Figura 1B. Freccia 2) con il battito del cuore embrionale.
- Una volta che la soluzione esogena viene iniettata nel recipiente, assicurarsi che il colore del recipiente si trasformi nel colore della soluzione e si riprenda in rosso in 2-5 s, indicando che la soluzione esogena viene consegnata con successo alla nave. A questo punto la soluzione entra nell'arteria, e con il battito del cuore viene fatta circolare di nuovo all'embrione attraverso l'arteria, e poi alla vena.
- Dopo l'iniezione, rimuovere l'uovo dallo stereomicroscopio e far cadere 200 μL di soluzione di penicillina all'interno del guscio d'uovo. Tagliare un pezzo di nastro medico lungo 3 cm e sigillare la finestra. Raschiare delicatamente il nastro con le forbici per spremere eventuali bolle d'aria e quindi tagliare un altro pezzo per sigillare l'apertura.
- Etichettare e riposizionare l'uovo iniettato nell'incubatrice e incubare fino allo stadio di sviluppo o di schiusa richiesto.
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Representative Results
Mostriamo qui l'iniezione intravascolare in ovo di embrioni di pollo. Un processo schematico dell'iniezione intravascolare è mostrato nella Figura 1; nel nostro studio, abbiamo utilizzato varie soluzioni esogene per testare e verificare l'iniezione.
Per visualizzare meglio i materiali iniettati, Trypan Blue (0,4%) è stato iniettato come tracciante nell'embrione. È stato osservato che il tracciante (blu) si diffonde all'intero embrione attraverso la circolazione sanguigna mediante aorta dorsale o iniezione della testa (Figura 2). I materiali iniettati in due siti diversi sono stati in grado di diffondersi all'intero embrione, indicando la diffusione attraverso la circolazione sanguigna. La visualizzazione del colore blu conferma il successo dell'iniezione.
Il vettore pEGFP-N1 è stato avvolto con PEI per raggiungere una concentrazione di 1 μg/μL, mentre il vettore lentivirale pLVX-EGFP è stato avvolto con PEI e diluito dopo la titolazione per ottenere una concentrazione virale di 5 x 106 Tu/μL. Gli embrioni a 2,5 giorni (stadio HH 14-15) sono stati iniettati con pEGFP-N1 o pLVX-EGFP avvolti. A 4,5 giorni (stadio HH 24), gli embrioni sono stati osservati utilizzando la microscopia a fluorescenza stereoscopica. Nell'embrione è stata osservata una fluorescenza verde che indica l'espressione vettoriale dopo l'iniezione. I risultati mostrano che i plasmidi incapsulati da liposomi (PEI) e lentivirus confezionati sono stati espressi nell'embrione di pollo 2 giorni dopo l'iniezione (Figura 3). I risultati dell'iniezione di plasmidi e vettori lentivirali hanno dimostrato l'espressione genica esogena nell'embrione, implicando la possibile applicazione nel trasferimento genico.
Le PGC sono state isolate dalla cresta genitale degli embrioni (E4.5, stadio HH 24) e coltivate per la purificazione come nella precedente pubblicazione16. Le PGC iniettate sono state etichettate con la proteina fluorescente rossa (RFP). A E6.0 giorni (stadio HH 28), la gonade degli embrioni riceventi è stata isolata e osservata. I risultati hanno mostrato che i PGC donatori (punti rossi) erano in grado di entrare e colonizzare efficacemente le gonadi del ricevente (Figura 4).
Figura 1: Lo schema dell'iniezione intravascolare. (A) La tempistica dell'iniezione intravascolare; (B) Due siti di iniezione indicati da frecce nere, la testa (1) e l'aorta dorsale (2); (C) Il processo dell'iniezione intravascolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Diffusione del colorante tracciante in diversi siti di iniezione. In alto: aorta dorsale; In basso: Testa. Barra della scala = 50 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Espressione di GFP negli embrioni 2 giorni dopo il vettore lentivirale e l'iniezione di plasmidi incapsulati. Barra della scala = 100 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Visualizzazione di PGC marcate con fluorescenza rossa iniettata nell'embrione di pollo ricevente. (E6.0, HH stadio 28) gonade. Barra della scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo di iniezione intravascolare in ovo di embrioni di pollo è ottimizzato per il trasferimento di materiali esogeni (vettori, virali o PGC) nell'embrione. Sulla base di questo metodo, abbiamo costruito modelli di embrioni di pollo con sovraespressione o interferenza genica stabile (SpinZ, JUN, UBE2I, ecc.) 17,18,19. Questi modelli consolidati dimostrano la fattibilità di questo approccio. Inoltre, non solo abbiamo trasferito PGC isolati alla gonade embrionale del ricevente, ma abbiamo anche prodotto con successo la prole vitale con gonadi embrionali trapiantate con PGC indotte, il che implica la grande applicazione di questo metodo nei futuri20.
Il passo critico del metodo è l'iniezione. I materiali esogeni devono essere iniettati direttamente nei vasi sanguigni, non troppo profondi o troppo superficiali. Pertanto, richiede esperienza di lavoro con embrioni di pollo e elevate capacità di iniezione che potrebbero essere facilmente ottenute attraverso la pratica. Rispetto all'iniezione di cellule d'aria, l'elevata efficacia e precisione dell'iniezione sono più facilmente raggiungibili utilizzando questo metodo. Oltre alle limitazioni dei costi elevati e dei passaggi complicati, l'elettrotrasfezione non viene applicata quando viene realizzata una grande finestra, in quanto può portare a un basso tasso di sopravvivenza.
Come metodo per la manipolazione genica negli embrioni di pollo, il metodo ha anche alcune limitazioni. Circa la metà delle uova erano morte durante l'incubazione dopo l'iniezione con un tasso di sopravvivenza del 40% -60%. Nel frattempo, l'efficienza di consegna è un altro fattore importante da considerare, specialmente per l'iniezione di PGC (nel nostro caso, l'efficienza dell'iniezione di plasmidi e lentivirus è ~ 50% -60% e quella dell'iniezione di PGC è ~ 30% -40%). In futuro, il protocollo potrebbe essere ottimizzato e il tasso di sopravvivenza potrebbe essere aumentato considerevolmente, migliorando ulteriormente il campo di applicazione di questo metodo.
In conclusione, questo protocollo dimostra che l'iniezione intravascolare di embrione di pollo in ovo è specifica per materiali esogeni (vettori o PGC) da trasferire negli embrioni. Inoltre, questo metodo può essere facilmente appreso e applicato in molti campi.
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Disclosures
Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (31972547). Apprezziamo il copyediting di Jing Wang e la voce fuori campo di Malik Donlic alla Washington State University, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
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