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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Detectando wolbachia strain wAlbb em linhas celulares Aedes albopictus

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63662
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1
1Guizhou Medical University, 2Guizhou Health Vocational College
* These authors contributed equally

Summary

Quatro métodos foram usados para detectar wolbachia intracelular, que se complementou e melhorou a precisão de detecção da infecção wolbachia da Aa23 e Aa23-T derivadas de Aa23 e Aa23-T curadas da infecção nativa wolbachia usando antibióticos.

Abstract

Como um endossímbionte abrigado maternamente, Wolbachia infecta grandes proporções de populações de insetos. Estudos relataram recentemente a regulamentação bem sucedida da transmissão do vírus RNA usando mosquitos transfectados por Wolbachia. As principais estratégias para controlar vírus incluem a manipulação da reprodução do hospedeiro por incompatibilidade citoplasmática e a inibição de transcrições virais por meio de priming imunológico e competição por recursos derivados do hospedeiro. No entanto, os mecanismos subjacentes das respostas dos mosquitos transfectados wolbachia à infecção viral são mal compreendidos. Este artigo apresenta um protocolo para a identificação in vitro da infecção por Wolbachia nos níveis nucleicos de ácido e proteína em células Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 para melhorar a compreensão das interações entre Wolbachia e seus vetores de insetos. Através do uso combinado de reação em cadeia de polimerase (PCR), PCR quantitativo, mancha ocidental e métodos analíticos imunológicos, um protocolo morfológico padrão foi descrito para a detecção de células infectadas por Wolbachia que é mais precisa do que o uso de um único método. Essa abordagem também pode ser aplicada à detecção da infecção por Wolbachia em outras taxas de insetos.

Introduction

O mosquito tigre asiático Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), que é um vetor chave do vírus da dengue (DENV) na Ásia e em outras partes do mundo1, é um hospedeiro natural de dois tipos de bactérias intracelulares, Wolbachia (wAlbA e wAlbB), que estão distribuídas por toda a linha germe e tecido somático 2,3. A linha celular Aa23 derivada de embriões A. albopictus consiste em pelo menos dois tipos de células morfológicas, ambos suportam a infecção4 e podem ser curados da infecção nativa da Wolbachia usando antibióticos (Aa23-T). Dado que o Aa23 mantém apenas wAlbB, é um modelo útil para o estudo das interações hospedeira-endossímbionte 4,5,6.

Wolbachia é transmitida maternamente e infecta cerca de 65% das espécies de insetos 8,9 e 28% das espécies demosquitos 10. Infecta uma variedade de tecidos e forma uma relação simbiótica íntima com o hospedeiro, geralmente induzindo incompatibilidade citoplasmática (IC)11 e substituição populacional manipulando o sistema reprodutivohospedeiro 12,13. Essas respostas hospedeiras têm sido observadas em populações naturais de simuladores de Drosophila14 e em A. aegypti em uma gaiola de laboratório e ensaio de campo15. Uma importante manipulação não reproducente provocada pela Wolbachia é induzida resistência hospedeira a uma variedade de patógenos, incluindo DENV, vírus Chikungunya (CHIKV) e vírus do Nilo Ocidental (WNV)16,17, que podem ser mediados por um sistema imunológico inato melhorado do simbionte18,19, competição entre Wolbachia e vírus para recursos essenciais de hospedagem20, e manipulação de vias de defesa viralhospedeira 21 .

Este protocolo foi desenvolvido para estudar esses mecanismos subjacentes das respostas antivirais induzidas pela Wolbachia. Utiliza quatro métodos de detecção da infecção por Wolbachia intracelular de células Aa23. Esses métodos fornecem uma forte base teórica para estudos de infecção por Wolbachia intracelular de outras espécies hospedeiras. O primeiro método, PCR-uma técnica poderosa que permite a amplificação enzimática de regiões específicas do DNA sem utilizar procedimentos convencionais de clonagem - foi usado para detectar DNA wolbachia e determinar a presença/ausência da infecção wolbachia 22. O segundo método mede a densidade de cópia de DNA de Wolbachia usando PCR quantitativo (qPCR) para detecção e medição confiável de produtos gerados durante cada ciclo pcr que é diretamente proporcional à quantidade de modelo antes do PCR23. O terceiro método detecta a presença de proteínas wolbachia intracelulares, utilizando uma das ferramentas mais poderosas para detectar proteínas específicas em misturas complexas, combinando o alto poder de separação da eletroforese, a especificidade dos anticorpos e a sensibilidade das reações enzimáticas cromogênicas. O método final é um ensaio de imunofluorescência (IFA) que combina imunologia, bioquímica e microscopia para detectar a proteína da superfície de Wolbachia (wsp) através de uma reação de anticorpos de antígeno para confirmar a absorção celular de Wolbachia e determinar sua localização celular.

Este artigo descreve os quatro métodos listados acima para verificar a existência de Wolbachia nas células, que podem ser usados para detectar se a exógena Wolbachia foi transfeinada com sucesso e a Wolbachia na célula foi limpa. Depois de determinar se wolbachia está presente nas células ou não, uma variedade de diferentes análises podem ser realizadas, incluindo genômica, proteômica ou metabolômica. Este protocolo demonstra a detecção de Wolbachia através de células Aa23, mas também pode ser usado em outras células.

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Protocol

1. Materiais e reagentes

  1. Use soluções e mídias sem pirógenos para cultura celular (veja a Tabela de Materiais).
  2. Use água ultrauso para preparar todas as soluções.
  3. Tenha cuidado ao selecionar o soro bovino fetal (FBS) para a cultura celular, seguindo um processo de verificação de lotes.
    NOTA: Como os lotes da FBS estão sujeitos a alterações regulares, é impossível declarar os números relevantes do catálogo e dos lotes neste protocolo.
  4. Selecione as cepas de células Aa23 derivadas de ovos A. albopictus , correspondentes ao Aa23-T livre de Wolbachia.

2. Cultura celular

  1. Prepare frascos de cultura celularde 25 cm 2 com 4 mL do meio de Schneider com 10% de FBS.
  2. Incubar os frascos a 28 °C sob uma atmosfera de CO2 de 5% para 5 a 7 dias 7,24.
  3. Observe células Aa23 e Aa23-T não manchadas nos frascos usando microscopia leve a 100x de ampliação (Figura 1).

3. Extração de DNA

  1. Cultura as células por 5-7 dias até 70-80% confluência por frasco (passo 2). Colher as células com tubulação manual de 1 mL de meio de cultura resuspended por centrifugação por 5 min a 100 × g em um microcentrifuge.
  2. Remova o supernatante por aspiração e armazene a pelota de célula resultante a -20 °C.
  3. Resuspenja as pelotas em 0,40 mL de salina tamponada com fosfato (PBS), coloque 50 μL da solução em um tubo de microcentrifuuga, adicione 5 μL de proteinase K (20 mg/mL) e incubar a 55 °C por 1 h. Por fim, aqueça estes tubos a 99 °C por 15 minutos para obter o DNA bruto e armazená-lo a -20 °C.

4. Detecção de ácido nucleico wolbachia

  1. Análise do PCR
    1. Execute PCR em um volume total de reação de 20 μL, contendo 8 μL de ddH2O, 10 μL de polimerase Taq (ver a Tabela de Materiais), 1 μL de modelo de DNA (a partir da etapa 3), 0,5 μL de primers dianteiros e invertidos (10 μM): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') e wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, respectivamente.
    2. Use as seguintes condições de PCR: desnaturação inicial a 95 °C por 5 min, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 94 °C, ressarem a 55 °C e extensão a 72 °C; em seguida, uma prorrogação final a 72 °C por 7 min.
    3. Detecte o DNA em um gel de 1% de agarose (1% w/v agarose em PBS) usando um imager de gel.
  2. análise qPCR
    1. Analise a cópia do genoma de Wolbachia para três réplicas biológicas (n = 6) do DNA extraído (etapa 3) usando primers wsp 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') e QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22, normalizados com primers de proteína ribossômica S6 (RPS6) para frente e para trás (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' e 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3', respectivamente)3.
    2. Gere uma curva padrão para wAlbB e RPS6.
      1. Extrair DNA do PMD-18T (vetor especial para clonagem eficiente de produtos PCR (clonagem de TA)) plasmídeo recombinante contendo fragmentos genéticos wsp e rps6 (Arquivo Suplementar) e medir a concentração de DNA plasmídeo (ver a Tabela de Materiais).
      2. Converta a concentração de DNA plasmídeo para copiar a concentração numépide usando Eq (1).
        Número da cópia plasmid = Equation 1 (1)
      3. Diluir o número da cópia plasmida de 101 a 108 com água ultrapura e definir 3 réplicas para cada gradiente de concentração.
      4. Realize a amplificação qPCR usando TB Green e um sistema PCR em tempo real (veja a Tabela de Materiais) e regissue os resultados de cada reação. Use o valor ct para desenvolver uma curva padrão. Analise o DNA em um volume total de reação de 20 μL, compreendendo 7 μL de ddH2O, 10,4 μL de TB Verde (ver a Tabela de Materiais), 1 μL de modelo de DNA (fornecido pelo Passo 3) e 0,8 μL de primers dianteiros e invertidos (10 μM). Use as seguintes condições de reação: denaturação inicial a 95 °C por 5 min, seguida por 40 ciclos de desinaturação a 95 °C para 10 s, e ressarem a 60 °C para 35 s.
      5. Calcule os números de cópia genética WSP e RPS6 nas células de acordo com a curva padrão estabelecida e a densidade relativa de Wolbachia pelo número de cópia do wsp/RPS6. Analise os dados usando um teste de amostras independentes.
  3. Análise de manchas ocidentais da proteína Wolbachia
    1. Extração de proteínas
      1. Colete 2 × 10células Aa23 e Aa23-T da placa de seis poços (a partir do passo 2) em um tubo de microcentrífuga, lave-as três vezes com PBS e centrífugas a 100 × g por 5 min a 4 °C.
      2. Prepare 1 mL de lise com tampão de lise RIPA (50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1% desoxicosolato de sódio, 0,1% sulfato de dodecil de sódio [SDS], pirofosfato de sódio de 2 mM, 25 mM β-glicerofosfato, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 0,5 μg/mL leupeptin) e PMSF (concentração final 1 mM).
      3. Adicione 200 μL de tampão de lise à pelota celular e mantenha por 30 minutos no gelo. Centrifugar os lises a 12.000 × g por 10 min a 4 °C e remover o sobrenante.
    2. Ensaio a concentração de wsp do supernante usando um kit de ensaio de proteína de ácido bicinchonínico (BCA) (ver a Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante.
    3. Carregar quantidades iguais de proteína em um gel de 15% SDS-PAGE [10% água destilada; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8,8; 1% (10% SDS), 1% (10% de amônio persulfato), 0,04% TEMED].
    4. Transfira a proteína para membranas nitrocelulosese, bloqueie as membranas com 5% de leite desnatado por 2 h26,27 à temperatura ambiente e depois lave as membranas três vezes com TBST (1 mL de Tween 20 em 1 L de TBS) (ver a Tabela de Materiais).
    5. Incubar as membranas durante a noite a 4 °C com 100 μL de anticorpo policlonal anti-wsp (preparado internamente, ver Arquivo Suplementar)), preparado pela diluição do anticorpo primário com 5% de leite desnatado (1:12.000).
    6. Lave o anticorpo primário três vezes com TBST.
    7. Incubar as membranas em 100 μL de peroxidase de rabanete (HRP) anticorpo secundário conjugado em um agitador por 1 h à temperatura ambiente.
    8. Lave as membranas três vezes com TBST, e misture 20 μL de solução A (HRP Substrate Luminol Reagent) e 20 μL de solução B (HRP Substrate Peroxide Reagent) no kit de detecção de quimiominascência em uma razão de 1:1. Mergulhe toda a membrana na solução de luminescência ao mesmo tempo, e observe os sinais usando um sistema de imagem multifuncional.
  4. Localização de imunofluorescência da proteína Wolbachia
    1. Incubar 5 ×10 células Aa23 e Aa23-T a 28 °C em uma placa de Petri confocal laser com uma espessura de 0,17 mm na parte inferior, sob uma atmosfera de 5% de CO2 por 3 a 4 dias 7,24. Espere até que a célula esteja 60%-70% de confluência e lave as células três vezes com PBS.
    2. Fixar as células por 20 min a 4 °C em 1 mL de paraformaldeído de 4% (w/v) em PBS.
    3. Lave as células fixas usando PBST (0,2% v/v Triton X-100 em PBS) por 5 min e lave as células novamente duas vezes com PBS.
    4. Incubar os slides por 1 h a 37 °C em 1 mL de 3% (w/v) albumina de soro bovino na PBS.
    5. Incubar os slides durante a noite em 100 μL de anticorpo policlonal anti-wsp de rato (preparado internamente) e soro de rato (1:1.000 diluição em PBS) em uma caixa molhada (pode manter a umidade e evitar que a umidade evapore) a 4 °C.
    6. Remova os slides da caixa molhada e devolva-os à temperatura ambiente; lave-os três vezes com PBS e remova o PBS.
      NOTA: A partir do passo 4.4.7 em diante, todas as operações devem ser protegidas à luz.
    7. Incubar os slides com 100 μL de um anticorpo anti-rato de cabra Alexa Fluor 488 conjugado (1:2.000 diluição em PBS) a 37 °C por 30 min.
    8. Incubar os slides de amostra com 50 μL de 4',6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI diluído em PBS a 10 μg/mL, liga fortemente ao DNA) a 37 °C por 5 min e depois lavá-los três vezes com PBS.
    9. Observe a imunostaining sob um microscópio confocal.
      1. Ligue a energia e o laser.
      2. Ligue as lâmpadas normais e de mercúrio do microscópio.
      3. Inicie o sistema e execute o software de operação. Coloque uma gota de óleo de cedro nos slides da amostra, coloque os slides da amostra no estágio do microscópio e mova o palco para a posição apropriada.
      4. Clique no botão de observação da lâmpada de mercúrio no software, abra o obturador da lâmpada de mercúrio e observe a amostra sob um microscópio invertido para se concentrar.
      5. Use o painel de controle manual para selecionar fluorescência verde e azul para tirar fotos de fluorescência sob ampliação de 100x.
      6. Desligue o botão de observação da lâmpada de mercúrio e comece a adquirir imagens.
      7. Para garantir uma boa qualidade de imagem, prescan pelo tamanho da varredura (512 pixels x 512 pixels). Ajuste o tamanho da varredura para obter imagens claras (1.024 pixels x 1.024 pixels).
      8. Realize a redução de ruído se o ruído de fundo for muito alto.
      9. Pare de digitalizar e salve as imagens.
      10. Desligue a lâmpada de mercúrio e os lasers.
      11. Limpe o objetivo com 75% de álcool e abaixe o objetivo para a posição mais baixa.
      12. Desligue o obturador e a energia do microscópio.
      13. Depois que o instrumento esfriar, cubra-o com a tampa de pó.

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Representative Results

Antes da córdia ser detectada, as células Aa23 e Aa23-T foram observadas sob um microscópio leve para determinar quaisquer diferenças morfológicas entre as duas linhas celulares. As células Aa23 e Aa23-T têm pelo menos duas morfologias celulares, mas nenhuma diferença morfológica óbvia entre os dois tipos de células (Figura 1). Aqui, as células Aa23 foram usadas como um sistema modelo para detectar a infecção por Wolbachia usando quatro métodos. A amplificação positiva do gene Wolbachiawsp utilizando os primers diagnósticos 81F/691R foi possível em células Aa23 (Faixas 1 e 2), mas não em células Aa23-T (Pistas 3 e 4) (Figura 2A). A análise da densidade de Wolbachia nas linhas celulares usando qPCR mostrou uma razão wsp/rps6 de 2,4 em células Aa23, mas nenhuma Wolbachia em células Aa23-T (Figura 2B). A análise de manchas ocidentais dos extratos de proteína mostrou um forte sinal de wsp para Aa23 e nenhum sinal para Aa23-T (Figura 3A),enquanto o ensaio indireto de imunofluorescência detectou a proteína wsp (Figura 3B) em células Aa23 (verde), enquanto apenas o DNA manchado com DAPI (azul) foi detectado em células Aa23-T.

Figure 1
Figura 1: Microscopia leve de células Aa23 e Aa23-T não manchadas. A morfologia heterogênea indica que mais de um tipo de célula está presente em ambas as linhas celulares, como indicado pelas setas. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Detecção da infecção por Wolbachia em células no nível de ácido nucleico. (A) Análise pcr de células Aa23 e Aa23-T resolvidas em um gel de 1% de agarose. Amplificação positiva do PCR do gene Wolbachiawsp utilizando os primers diagnósticos, 81F/691R, observados em células Aa23 (Faixas 1 e 2), mas não em células Aa23-T (Pistas 3 e 4). (B) Wolbachia wsp densidade de cópias de células Aa23 e Aa23-T. A densidade foi maior em células Aa23 e indetectável em células Aa23-T. O número da cópia foi normalizado usando Aedes albopictus rps6; os dados são ± médios SEM, n = 6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Detecção da infecção por Wolbachia em células no nível da proteína. (A) Imunoblotting com anticorpo wsp em células Aa23 (Pista 1), com uma faixa óbvia perto de 25 kDa; Aa23-T (Pista 2), que foi tratada com tetraciclina. (B) Rotulagem de imunofluorescência de células mostrando a localização de Wolbachia (verde); as células foram sondadas com anticorpo anti-wsp policlonnal (Wolbachia), seguido por anticorpos conjugados Alexa Fluor 488-conjugados e núcleos (azul) manchados com DAPI. O soro do rato foi usado como controle negativo porque o anticorpo anti-wsp não foi purificado, e o anticorpo policlonal foi derivado do rato. As células Aa23 (Aa23-anti-wsp) infectadas com Wolbachia são indicadas com uma seta branca. Barras de escala = 10 μm. Abreviação: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilôndole; M = marcador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar: Geração plasmida e preparação de anticorpos anti-wsp. Clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

A detecção da infecção por Wolbachia intracelular é essencial para o estudo das interações wolbachia-hospedeira e a confirmação da transfecção bem sucedida de células com novas cepas. Neste protocolo, quatro métodos foram utilizados para detectar com sucesso a infecção por Wolbachia intracelular nos níveis nucleicos de ácido e proteína. Estes quatro métodos experimentais corroboraram e melhoraram a precisão de detecção da infecção por Wolbachia das células.

O PCR foi utilizado para detectar a presença da infecção por Wolbachia de células no nível de ácido nucleico. No entanto, como não quantifica os níveis de infecção28,29, o qPCR foi usado para quantificar a densidade de cópia de DNA28,30. Como a precisão dos métodos pcr pode ser afetada pela baixa eficiência de amplificação e falsos positivos, é importante garantir uma boa qualidade do DNA, especialmente para a detecção de qPCR, onde reagentes e modelos devem ser colocados no gelo para evitar a desnaturação, e as operações devem ser realizadas de acordo com os métodos padrão. A baixa eficiência de amplificação tende a ser causada pela degradação do reagente no sistema de reação, quantidades insuficientes de modelo e/ou comprimento excessivo de fragmentos de primer estendidos28. Falsos positivos são geralmente causados pela contaminação de reagentes e modelos, altos níveis de concentração de primer e/ou estruturas mais fracas e primer de grampos. Portanto, é importante garantir que os reagentes sejam de alta qualidade, os primers sejam otimizados com base na literatura e softwares apropriados utilizados para o design de primer.

Dois métodos descritos acima detectam infecção por Wolbachia intracelular no nível do ácido nucleico; os outros dois detectam infecção por Wolbachia intracelular no nível da proteína. A mancha ocidental foi usada para determinar a infecção por Wolbachia intracelular das células Aa23 e Aa23-T no nível da proteína. Os problemas associados a este método estão relacionados à preparação da amostra, incubação de anticorpos e detecção31. As etapas críticas no processo de detecção de manchas ocidentais incluem o uso de amostras frescas e totalmente diluídas e os anticorpos secundários corretos, que devem ser validados e diluídos de acordo com as instruções de uma diluição de 1:12.000. De acordo com os requisitos experimentais, esse método também pode ser combinado com outros métodos de imunização. Portanto, a imunofluorescência foi utilizada para localização da infecção intracelular por Wolbachia31 , pois isso não é detectado diretamente usando análises de PCR, qPCR ou manchas ocidentais. Existem alguns passos críticos a serem observados sobre a imunofluorescência. Primeiro, garantir a qualidade ideal das amostras celulares e evitar contaminação. A contaminação das células por inseto de cola preta, que também pode ser manchada, afetará seriamente a interpretação dos resultados. Em segundo lugar, a densidade celular nos pratos confocal a laser deve ser de ~60-70%. Finalmente, lavar com PBS após a incubação da amostra é fundamental para obter imagens claras de fluorescência.

Usando métodos quantitativos e visuais relativos e absolutos para detectar a infecção por Wolbachia intracelular nos níveis nucleicos de ácido e proteína, este protocolo é mais abrangente e preciso do que o uso de qualquer método único. Além disso, a construção de uma curva padrão dupla (para wsp e RPS6) resulta em requisitos menos rigorosos para o sistema PCR e eficiência de amplificação e eliminação parcial do erro experimental no processamento final de dados, o que reduz consideravelmente o trabalho experimental. No entanto, houve algumas limitações para este protocolo. Em primeiro lugar, o anticorpo anti-wsp é preparado internamente e ainda não foi comercializado. Em segundo lugar, embora não houvesse bandas extras devido ao anticorpo anti-wsp policlonal não purificado na mancha ocidental, indicando pureza de anticorpos, o grupo de controle negativo usando soro de rato também tinha um fundo de fluorescência verde, o que não era propício à interpretação dos resultados. Embora a precisão dos métodos ocidentais de mancha e imunofluorescência possa ser melhorada, garantindo o uso de anticorpos purificados ou sondas fluorescentes precisas, são necessários estudos e análises mais aprofundados de dados empíricos. Em resumo, um protocolo mais abrangente e preciso é relatado para a detecção da infecção por Wolbachia em células Aa23 usando quatro métodos usados em estudos anteriores da Wolbachia. O protocolo aqui descrito é aplicável à detecção de Wolbachia em outros tipos de células e tecidos.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Acknowledgments

Agradecemos ao Dr. Xin-Ru Wang, da Universidade de Minnesota, por sugestões e orientações perspicazes. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (nº 81760374).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Zeiss SteREO Discovery V8
Petri dish Fisher Scietific FB0875713
Pipette Pipetman F167380 P10
inSituX platform
Analysis software In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet MSE Supplies Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder In-house developed
Control software In-house developed
Immersion oil Cargille Laboratories 16482 Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform In-house developed
IR light source  Thorlabs Incorporated LED1085L LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring  In-house developed
Pump lasers  Thorlabs Incorporated LD785-SE400 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi Raspberry Pi Fundation
Retaining ring Thorlabs Incorporated SM1RR SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal University Wafers, Inc. U01-W2-L-190514 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim In-house developed
X-ray beam stop In-house developed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Imunologia e Infecção Problema 184
Detectando <em>wolbachia</em> strain wAlbb em <em>linhas celulares Aedes albopictus</em>
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Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng,… More

Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng, J., Wu, J. Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines. J. Vis. Exp. (184), e63662, doi:10.3791/63662 (2022).

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