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Immunology and Infection

Detección de Wolbachia Strain wAlbB en líneas celulares de Aedes albopictus

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63662
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1
1Guizhou Medical University, 2Guizhou Health Vocational College
* These authors contributed equally

Summary

Se utilizaron cuatro métodos para detectar Wolbachia intracelular, que se complementaron entre sí y mejoraron la precisión de detección de la infección por Wolbachia de Aa23 derivada de Aedes albopictus y Aa23-T curada de la infección nativa por Wolbachia utilizando antibióticos.

Abstract

Como endosimbionte albergado maternalmente, Wolbachia infecta grandes proporciones de poblaciones de insectos. Los estudios han informado recientemente de la regulación exitosa de la transmisión del virus del ARN utilizando mosquitos transfectados por Wolbachia. Las estrategias clave para controlar los virus incluyen la manipulación de la reproducción del huésped a través de la incompatibilidad citoplasmática y la inhibición de las transcripciones virales a través del cebado inmune y la competencia por los recursos derivados del huésped. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de las respuestas de los mosquitos transfectados por Wolbachia a la infección viral son poco conocidos. Este artículo presenta un protocolo para la identificación in vitro de la infección por Wolbachia a nivel de ácido nucleico y proteína en las células Aa23 de Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) para mejorar la comprensión de las interacciones entre Wolbachia y sus insectos vectores. A través del uso combinado de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR cuantitativa, el western blot y los métodos analíticos inmunológicos, se ha descrito un protocolo morfológico estándar para la detección de células infectadas por Wolbachia que es más preciso que el uso de un solo método. Este enfoque también se puede aplicar a la detección de la infección por Wolbachia en otros taxones de insectos.

Introduction

El mosquito tigre asiático Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), que es un vector clave del virus del dengue (DENV) en Asia y otras partes del mundo1, es un huésped natural de dos tipos de bacterias intracelulares, Wolbachia (wAlbA y wAlbB), que se distribuyen por toda la línea germinal y el tejido somático 2,3. La línea celular Aa23 derivada de embriones de A. albopictus consta de al menos dos tipos de células morfológicas, las cuales apoyan la infección4 y pueden curarse de la infección nativa por Wolbachia utilizando antibióticos (Aa23-T). Dado que Aa23 conserva sólo wAlbB, es un modelo útil para el estudio de las interacciones huésped-endosimbionte 4,5,6.

Wolbachia es de transmisión materna e infecta aproximadamente el 65% de las especies de insectos 8,9 y el 28% de las especies de mosquitos10. Infecta una variedad de tejidos y forma una relación simbiótica íntima con el huésped, generalmente induciendo incompatibilidad citoplasmática (IC)11 y reemplazo poblacional mediante la manipulación del sistema reproductivo huésped12,13. Estas respuestas del huésped se han observado en poblaciones naturales de Drosophila simulans14 y en A. aegypti en una jaula de laboratorio y ensayo de campo15. Una importante manipulación no reproductiva provocada por Wolbachia es la resistencia inducida del huésped a una variedad de patógenos, incluidos el DENV, el virus Chikungunya (CHIKV) y el virus del Nilo Occidental (WNV)16,17, que puede estar mediado por un sistema inmune innato mejorado del simbionte18,19, la competencia entre Wolbachia y los virus por los recursos esenciales del huésped20 y la manipulación de las vías de defensa viral del huésped21 .

Este protocolo ha sido desarrollado para estudiar estos mecanismos subyacentes de las respuestas antivirales del huésped inducidas por Wolbachia. Utiliza cuatro métodos de detección de la infección intracelular por Wolbachia de células Aa23. Estos métodos proporcionan una sólida base teórica para los estudios de la infección intracelular por Wolbachia de otras especies huésped. El primer método, la PCR, una técnica poderosa que permite la amplificación enzimática de regiones específicas de ADN sin utilizar procedimientos de clonación convencionales, se utilizó para detectar adn de Wolbachia y determinar la presencia/ausencia de infección por Wolbachia 22. El segundo método mide la densidad de copia de ADN de Wolbachia utilizando PCR cuantitativa (qPCR) para una detección y medición confiables de los productos generados durante cada ciclo de PCR que es directamente proporcional a la cantidad de plantilla antes de la PCR23. El tercer método detecta la presencia de proteínas Wolbachia intracelulares, utilizando Western Blot, una de las herramientas más poderosas para detectar proteínas específicas en mezclas complejas mediante la combinación del alto poder de separación de la electroforesis, la especificidad de los anticuerpos y la sensibilidad de las reacciones enzimáticas cromogénicas. El método final es un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) que combina inmunología, bioquímica y microscopía para detectar la proteína de superficie wolbachia (wsp) a través de una reacción antígeno-anticuerpo para confirmar la absorción celular de Wolbachia y determinar su localización celular.

Este artículo describe los cuatro métodos enumerados anteriormente para verificar la existencia de Wolbachia en las células, que se pueden utilizar para detectar si la Wolbachia exógena se transfectó con éxito y la Wolbachia en la célula se eliminó. Después de determinar si Wolbachia está presente en las células o no, se puede realizar una variedad de análisis diferentes, incluyendo genómica, proteómica o metabolómica. Este protocolo demuestra la detección de Wolbachia a través de células Aa23, pero también se puede utilizar en otras células.

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Protocol

1. Materiales y reactivos

  1. Utilice soluciones y medios libres de pirógenos para el cultivo celular (consulte la Tabla de materiales).
  2. Use agua ultrapura para preparar todas las soluciones.
  3. Tenga cuidado al seleccionar el suero fetal bovino (FBS) para el cultivo celular, después de un proceso de verificación de lotes.
    NOTA: Como los lotes fbs están sujetos a cambios regulares, es imposible indicar el catálogo y los números de lote relevantes en este protocolo.
  4. Seleccionar cepas celulares de Aa23 derivadas de huevos de A. albopictus , correspondientes a Aa23-T libre de Wolbachia.

2. Cultivo celular

  1. Preparar matraces de cultivo celularde 25 cm 2 con 4 mL de medio de Schneider con 10% de FBS.
  2. Incubar los matraces a 28 °C bajo una atmósfera de 5% de CO2 durante 5 a 7 días 7,24.
  3. Observe células Aa23 y Aa23-T no teñidas en los matraces utilizando microscopía de luz con un aumento de 100x (Figura 1).

3. Extracción de ADN

  1. Cultive las células durante 5-7 días hasta una confluencia del 70-80% por matraz (paso 2). Cosechar las células con pipeteo manual de 1 mL de medio de cultivo resuspendido por centrifugación durante 5 min a 100 × g en una microcentrífuga.
  2. Retire el sobrenadante por aspiración y almacene el pellet celular resultante a -20 °C.
  3. Resuspender los gránulos en 0,40 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), colocar 50 μL de la solución en un tubo de microcentrífuga, añadir 5 μL de proteinasa K (20 mg/ml) e incubar a 55 °C durante 1 h. Finalmente, caliente estos tubos a 99 °C durante 15 min para obtener el ADN crudo y almacenarlo a -20 °C.

4. Detección del ácido nucleico Wolbachia

  1. Análisis PCR
    1. Realizar PCR en un volumen total de reacción de 20 μL, que contiene 8 μL de ddH2O, 10 μL de Taq polimerasa (ver la Tabla de Materiales), 1 μL de plantilla de ADN (del paso 3), 0,5 μL de cebadores hacia adelante y hacia atrás (10 μM): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') y wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, respectivamente.
    2. Utilice las siguientes condiciones de PCR: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C, recocido a 55 °C y extensión a 72 °C; luego, una extensión final a 72 °C durante 7 min.
    3. Detecte el ADN en un gel de agarosa al 1% (1% p/v de agarosa en PBS) utilizando un generador de imágenes de gel.
  2. Análisis qPCR
    1. Analizar la copia del genoma de Wolbachia para tres réplicas biológicas (n = 6) del ADN extraído (paso 3) utilizando cebadores wsp 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') y QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAGTCCC 3')22, normalizados con cebadores de proteína ribosómica S6 (RPS6) hacia adelante y hacia atrás (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' y 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3', respectivamente)3.
    2. Genere una curva estándar para wAlbB y RPS6.
      1. Extraer ADN de PMD-18T (un vector especial para la clonación eficiente de productos de PCR (clonación de TA)) plásmido recombinante que contiene fragmentos de genes wsp y rps6 (Archivo suplementario) y medir la concentración de ADN plásmido (ver la Tabla de Materiales).
      2. Convierta la concentración de ADN plásmido a la concentración de número de copia usando Eq (1).
        Número de copias del plásmido = Equation 1 (1)
      3. Diluya el número de copia del plásmido de 101 a 108 con agua ultrapura y establezca 3 réplicas para cada gradiente de concentración.
      4. Realice la amplificación de qPCR utilizando TB Green y un sistema de PCR en tiempo real (consulte la Tabla de materiales), y registre los resultados de cada reacción. Utilice el valor Ct para desarrollar una curva estándar. Analizar el ADN en un volumen total de reacción de 20 μL, que comprende 7 μL de ddH2O, 10,4 μL de TB Green (consulte la Tabla de Materiales), 1 μL de plantilla de ADN (proporcionada por el Paso 3) y 0,8 μL de cebadores hacia adelante y hacia atrás (10 μM). Utilice las siguientes condiciones de reacción: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 s y recocido a 60 °C durante 35 s.
      5. Calcular los números de copia de los genes WSP y RPS6 en las células de acuerdo con la curva estándar establecida y la densidad relativa de Wolbachia por el número de copia de wsp/RPS6. Analice los datos utilizando una prueba t de muestras independiente.
  3. Análisis de Western blot de la proteína Wolbachia
    1. Extracción de proteínas
      1. Recolecte 2 × 107 células Aa23 y Aa23-T de la placa de seis pocillos (a partir del paso 2) en un tubo de microcentrífuga, lávelas tres veces con PBS y centrífuguelas a 100 × g durante 5 min a 4 °C.
      2. Preparar 1 ml de lisados con tampón de lisis RIPA (50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1% desoxicolato de sodio, 0.1% dodecil sulfato de sodio [SDS], 2 mM de pirofosfato de sodio, 25 mM de β-glicerofosfato, 1 mM de EDTA, 1 mM de Na3VO4, 0.5 μg/mL de leupeptina) y PMSF (concentración final de 1 mM).
      3. Agregue 200 μL de tampón de lisis al pellet celular y manténgalo durante 30 minutos en hielo. Centrifugar los lisados a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C y retirar el sobrenadante.
    2. Evalúe la concentración wsp del sobrenadante utilizando un kit de ensayo de proteína de ácido bicinconínico (BCA) (consulte la Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.
    3. Cargue cantidades iguales de proteína en un gel SDS-PAGE al 15% [10% agua destilada; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8.8; 1% (10% SDS), 1% (10% persulfato de amonio), 0.04% TEMED].
    4. Transfiera la proteína a las membranas de nitrocelulosa, bloquee las membranas con leche desnatada al 5% durante 2 h 26,27 a temperatura ambiente, y luego lave las membranas tres veces con TBST (1 ml de Tween 20 en 1 L de TBS) (consulte la Tabla de materiales).
    5. Incubar las membranas durante la noche a 4 °C con 100 μL de anticuerpo policlonal anti-wsp (preparado internamente, ver Archivo Suplementario)), preparado diluyendo el anticuerpo primario con leche desnatada al 5% (1:12.000).
    6. Lave el anticuerpo primario tres veces con TBST.
    7. Incubar las membranas en 100 μL de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en un agitador durante 1 h a temperatura ambiente.
    8. Lave las membranas tres veces con TBST y mezcle 20 μL de solución A (HRP Substrate Luminol Reagent) y 20 μL de solución B (HRP Substrate Peroxide Reagent) en el kit de detección de quimioluminiscencia en una proporción de 1:1. Sumerja toda la membrana en la solución de luminiscencia al mismo tiempo y observe las señales utilizando un sistema de imágenes multifuncional.
  4. Localización por inmunofluorescencia de la proteína Wolbachia
    1. Incubar 5 × 105 células Aa23 y Aa23-T a 28 °C en una placa de Petri confocal láser con un espesor de 0,17 mm en la parte inferior, bajo una atmósfera de CO2 al 5% durante 3 a 4 días 7,24. Espere hasta que la celda tenga una confluencia del 60% al 70% y lave las celdas tres veces con PBS.
    2. Fije las células durante 20 min a 4 °C en 1 ml de paraformaldehído al 4% (p/v) en PBS.
    3. Lave las celdas fijas usando PBST (0.2% v/v Triton X-100 en PBS) durante 5 min y lave las células nuevamente dos veces con PBS.
    4. Incubar los portaobjetos durante 1 h a 37 °C en 1 mL de albúmina sérica bovina al 3% (p/v) en PBS.
    5. Incubar los portaobjetos durante la noche en 100 μL de anticuerpo policlonal anti-wsp de ratón (preparado internamente) y suero de ratón (dilución de 1:1.000 en PBS) en una caja húmeda (puede mantener la humedad y evitar que la humedad se evapore) a 4 °C.
    6. Retire las diapositivas de la caja húmeda y devuélvalas a temperatura ambiente; lávelos tres veces con PBS y retire el PBS.
      NOTA: A partir del paso 4.4.7, todas las operaciones deben estar protegidas de la luz.
    7. Incubar los portaobjetos con 100 μL de un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado alexa Fluor 488 (dilución 1:2.000 en PBS) a 37 °C durante 30 min.
    8. Incubar los portaobjetos de muestra con 50 μL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI diluido en PBS a 10 μg/mL, se une fuertemente al ADN) a 37 °C durante 5 min y luego lavarlos tres veces con PBS.
    9. Observe la inmunotinción bajo un microscopio confocal.
      1. Encienda la alimentación y el láser.
      2. Encienda las lámparas normales y de mercurio del microscopio.
      3. Inicie el sistema y ejecute el software de operación. Coloque una gota de aceite de cedro en los portaobjetos de muestra, coloque los portaobjetos de muestra en el escenario del microscopio y mueva el escenario a la posición adecuada.
      4. Haga clic en el botón de observación de la lámpara de mercurio en el software, abra el obturador de la lámpara de mercurio y observe la muestra bajo un microscopio invertido para enfocar.
      5. Utilice el panel de control manual para seleccionar la fluorescencia verde y azul para tomar fotos de fluorescencia con un aumento de 100x.
      6. Apague el botón de observación de la lámpara de mercurio y comience a adquirir imágenes.
      7. Para garantizar una buena calidad de imagen, realice un escaneo previo por tamaño de escaneo (512 píxeles x 512 píxeles). Ajuste el tamaño del escaneo para obtener imágenes claras (1.024 píxeles x 1.024 píxeles).
      8. Realice la reducción de ruido si el ruido de fondo es demasiado alto.
      9. Deje de escanear y guarde las imágenes.
      10. Apague la lámpara de mercurio y los láseres.
      11. Limpie el objetivo con un 75% de alcohol y baje el objetivo a la posición más baja.
      12. Apague el obturador y la alimentación del microscopio.
      13. Después de que el instrumento se haya enfriado, cúbralo con la cubierta antipolvo.

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Representative Results

Antes de que se detectara Wolbachia , se observaron células Aa23 y Aa23-T bajo un microscopio de luz para determinar cualquier diferencia morfológica entre las dos líneas celulares. Las células Aa23 y Aa23-T tienen al menos dos morfologías celulares, pero no hay una diferencia morfológica obvia entre los dos tipos de células (Figura 1). Aquí, las células Aa23 se utilizaron como un sistema modelo para detectar la infección por Wolbachia utilizando cuatro métodos. La amplificación positiva del gen Wolbachiawsp utilizando los cebadores diagnósticos 81F/691R fue posible en células Aa23 (Carriles 1 y 2) pero no en células Aa23-T (Carriles 3 y 4) (Figura 2A). El análisis de la densidad de Wolbachia en las líneas celulares utilizando qPCR mostró una relación wsp/rps6 de 2,4 en células Aa23 pero no Wolbachia en células Aa23-T (Figura 2B). El análisis de Western blot de extractos de proteínas mostró una fuerte señal wsp para Aa23 y ninguna señal para Aa23-T (Figura 3A), mientras que el ensayo de inmunofluorescencia indirecta detectó la proteína wsp (Figura 3B) en células Aa23 (verde), mientras que solo se detectó ADN teñido con DAPI (azul) en células Aa23-T.

Figure 1
Figura 1: Microscopía de luz de células Aa23 y Aa23-T no teñidas. La morfología heterogénea indica que más de un tipo de célula está presente en ambas líneas celulares, como lo indican las flechas. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Detección de la infección por Wolbachia en células a nivel de ácido nucleico. (A) Análisis por PCR de células Aa23 y Aa23-T resueltas en un gel de agarosa al 1%. Amplificación positiva por PCR del gen Wolbachiawsp utilizando los cebadores diagnósticos , 81F/691R, observados en células Aa23 (carriles 1 y 2) pero no en células Aa23-T (carriles 3 y 4). (B) Densidad de copia de Wolbachia wsp de células Aa23 y Aa23-T. La densidad fue mayor en las células Aa23 e indetectable en las células Aa23-T. El número de copias se normalizó utilizando Aedes albopictus rps6; los datos son medios ± SEM, n = 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Detección de la infección por Wolbachia en células a nivel proteico. (A) Immunoblotting con anticuerpo wsp en células Aa23 (Lane 1), con una banda obvia cercana a 25 kDa; Aa23-T (Lane 2), que fue tratado con tetraciclina. (B) Marcado de inmunofluorescencia de células que muestran la localización de Wolbachia (verde); las células se sondearon con anticuerpos policlonales anti-wsp (Wolbachia), seguidos de anticuerpos conjugados alexa Fluor 488 anti-ratón de cabra (verde), y los núcleos (azules) se tiñeron con DAPI. El suero de ratón se utilizó como control negativo porque el anticuerpo anti-wsp no se purificó y el anticuerpo policlonal se derivó del ratón. Las células Aa23 (Aa23-anti-wsp) infectadas con Wolbachia están indicadas con una flecha blanca. Barras de escala = 10 μm. Abreviatura: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; M = marcador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo suplementario: Generación de plásmidos y preparación de anticuerpos anti-wsp. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La detección de la infección intracelular por Wolbachia es esencial para el estudio de las interacciones Wolbachia-huésped y la confirmación de la transfección exitosa de células con nuevas cepas. En este protocolo, se utilizaron cuatro métodos para detectar con éxito la infección intracelular por Wolbachia a nivel de ácido nucleico y proteína. Estos cuatro métodos experimentales corroboraron y mejoraron la precisión de detección de la infección por Wolbachia de las células.

La PCR se utilizó para detectar la presencia de infección por Wolbachia de las células a nivel de ácido nucleico. Sin embargo, como no cuantifica los niveles de infección28,29, se utilizó qPCR para cuantificar la densidad de copia de ADN28,30. Dado que la precisión de los métodos de PCR puede verse afectada por la baja eficiencia de amplificación y los falsos positivos, es importante garantizar una buena calidad del ADN, especialmente para la detección de qPCR, donde los reactivos y las plantillas deben colocarse en hielo para evitar la desnaturalización, y las operaciones deben llevarse a cabo de acuerdo con los métodos estándar. La baja eficiencia de amplificación tiende a ser causada por la degradación del reactivo en el sistema de reacción, cantidades insuficientes de plantillas y/o longitud excesiva de fragmentos de imprimación extendidos28. Los falsos positivos generalmente son causados por la contaminación de reactivos y plantillas, altos niveles de concentración de imprimación y / o estructuras de imprimación de dímeros y horquillas. Por lo tanto, es importante asegurarse de que los reactivos sean de alta calidad, que los cebadores se optimicen en función de la literatura y que se utilice el software adecuado para el diseño de imprimaciones.

Dos métodos descritos anteriormente detectan la infección intracelular por Wolbachia a nivel de ácido nucleico; los otros dos detectan la infección intracelular por Wolbachia a nivel proteico. Western blotting se utilizó para determinar la infección intracelular por Wolbachia de las células Aa23 y Aa23-T a nivel de proteína. Los problemas asociados con este método están relacionados con la preparación de muestras, la incubación de anticuerpos y la detección31. Los pasos críticos en el proceso de detección de western blotting incluyen el uso de muestras frescas y completamente lisadas y anticuerpos secundarios correctos, que deben validarse y diluirse de acuerdo con las instrucciones a una dilución de 1: 12,000. De acuerdo con los requisitos experimentales, este método también se puede combinar con otros métodos de inmunización. Por lo tanto, se utilizó la inmunofluorescencia para localizar la infección intracelular por Wolbachia31 , ya que esta no se detecta directamente mediante PCR, qPCR o análisis de western blot. Hay algunos pasos críticos a tener en cuenta sobre la inmunofluorescencia. En primer lugar, garantizar la calidad óptima de las muestras celulares y evitar la contaminación. La contaminación de las células por un insecto de pegamento negro, que también puede teñirse, afectará seriamente la interpretación de los resultados. En segundo lugar, la densidad celular en los platos confocales láser debe ser de ~ 60-70%. Finalmente, el lavado con PBS después de la incubación de la muestra es fundamental para obtener imágenes claras de fluorescencia.

Utilizando métodos cuantitativos y visuales relativos y absolutos para detectar la infección intracelular por Wolbachia a nivel de ácido nucleico y proteína, este protocolo es más completo y preciso que el uso de cualquier método individual. Además, la construcción de una curva de doble estándar (para wsp y RPS6) da como resultado requisitos menos estrictos para el sistema de PCR y la eficiencia de amplificación y la eliminación parcial del error experimental en el procesamiento final de datos, lo que reduce en gran medida el trabajo experimental. Sin embargo, había algunas limitaciones a este protocolo. En primer lugar, el anticuerpo anti-wsp se prepara internamente y aún no se ha comercializado. En segundo lugar, aunque no hubo bandas adicionales debido al anticuerpo anti-wsp policlonal no purificado en western blotting, lo que indica la pureza del anticuerpo, el grupo de control negativo que usó suero de ratón también tenía un fondo de fluorescencia verde, lo que no era propicio para la interpretación de los resultados. Si bien la precisión de los métodos de western blot e inmunofluorescencia puede mejorarse asegurando el uso de anticuerpos purificados o sondas fluorescentes precisas, se requieren más estudios y análisis de datos empíricos. En resumen, se informa de un protocolo más completo y preciso para la detección de la infección por Wolbachia en células Aa23 utilizando cuatro métodos utilizados en estudios previos de Wolbachia. El protocolo aquí descrito es aplicable a la detección de Wolbachia en otro tipo de células y tejidos.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Xin-Ru Wang de la Universidad de Minnesota por sus perspicaces sugerencias y orientación. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.81760374).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Zeiss SteREO Discovery V8
Petri dish Fisher Scietific FB0875713
Pipette Pipetman F167380 P10
inSituX platform
Analysis software In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet MSE Supplies Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder In-house developed
Control software In-house developed
Immersion oil Cargille Laboratories 16482 Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform In-house developed
IR light source  Thorlabs Incorporated LED1085L LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring  In-house developed
Pump lasers  Thorlabs Incorporated LD785-SE400 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi Raspberry Pi Fundation
Retaining ring Thorlabs Incorporated SM1RR SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal University Wafers, Inc. U01-W2-L-190514 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim In-house developed
X-ray beam stop In-house developed

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References

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Inmunología e Infección Número 184
Detección de <em>Wolbachia</em> Strain wAlbB en <em>líneas celulares de Aedes albopictus</em>
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Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng,… More

Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng, J., Wu, J. Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines. J. Vis. Exp. (184), e63662, doi:10.3791/63662 (2022).

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