Summary
ליזטים של טסיות דם מייצגים כלי מתפתח לטיפול במחלות פני השטח של העין. כאן אנו מציעים שיטה להכנה, חלוקה, אחסון ואפיון של ליזאט טסיות שנאסף מתורמי טסיות.
Abstract
מחלות שונות של פני השטח של העין מטופלות בטיפות עיניים שמקורן בדם. השימוש בהם הוכנס לקליניקה בגלל תכולת המטבוליטים וגורמי הגדילה שלהם, המקדמת התחדשות פני השטח של העין. ניתן להכין טיפות עיניים על בסיס דם ממקורות שונים (כלומר, תרומת אפרזיס מדם מלא או טסיות דם), כמו גם עם פרוטוקולים שונים (למשל, דילולים שונים ומחזורי הקפאה/הפשרה). שונות זו מעכבת את הסטנדרטיזציה של פרוטוקולים קליניים, וכתוצאה מכך, את הערכת היעילות הקלינית שלהם. פירוט ושיתוף ההליכים המתודולוגיים עשויים לתרום להגדרת קווים מנחים משותפים. במהלך השנים האחרונות, מוצרים אלוגניים מתפזרים כחלופה לטיפולים האוטולוגיים מכיוון שהם מבטיחים סטנדרטים גבוהים יותר של יעילות; ביניהם, טיפות עיניים פלזמה עשירות טסיות דם (PRP-L) מוכנים עם נהלי ייצור פשוטים. ביחידה לרפואת עירוי ב- AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, איטליה, PRP-L מתקבל מתרומת טסיות-אפרזיס. מוצר זה מדולל בתחילה ל-0.3 x 109 טסיות /מ"ל (החל מריכוז ממוצע של 1 x 10 9 טסיות/מ"ל) ב-NaCl של0.9 %. טסיות מדוללות מוקפאות/מופשרות, ולאחר מכן צנטריפוגות כדי לסלק פסולת. הנפח הסופי מפוצל ל-1.45 מ"ל ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס. לפני מתן לחולים, טיפות עיניים נבדקות לסטריליות. חולים יכולים לאחסן ליזטים טסיות ב -15 מעלות צלזיוס למשך עד חודש. הרכב גורם הצמיחה מוערך גם מתוך aliquots שנבחרו באקראי, ואת הערכים הממוצעים מדווחים כאן.
Introduction
מוצרים שמקורם בדם נמצאים בשימוש נרחב בטיפול בפצעים1, כירורגיית לסתות ואורתופדיה, ולטיפולבמחלות שונות של פני השטח של העין 2 כגון מחלת העין היבשה (DED)3. ב- DED, ההומיאוסטזיס של סרט הדמעות נפגע כתוצאה מתפקוד לא תקין של גורמים שונים המעורבים בייצור דמעות ותקינות פני השטח של העין 4,5.
DED מאופיין בהטרוגניות בסיבות ובחומרה 6,7,8 ועשוי להיות תוצאה של גורמים שונים כמו הזדקנות, מין9, עדשות מגע, תרופות אקטואליות או סיסטמיות 10, או מצבים קיימים כמו תסמונת סיוגרן 10. למרות שיש להם תסמינים קלים, DED משפיע על מיליוני אנשים ברחבי העולם, ומשפיע על איכות חייהם וגם על מערכת הבריאות6.
טיפולים רבים דווחו עבור פתולוגיה זו, אבל עדיין אין קונצנזוס על הפתרון היעיל ביותר12. נכון להיום, דמעות מלאכותיות הן קו הטיפול הראשון שמטרתו לשחזר את ההרכב המיימי של סרט הדמעות, אם כי תחליפים אלה אינם מכילים את המומסים הפעילים ביולוגית העיקריים של דמעות טבעיות 6,11. מוצרים מבוססי טסיות נחשבים לחלופה תקפה12,13 לקרעים מלאכותיים, אם כי יעילותם הקלינית, המלצות לשימוש ושיטות ההכנות עדיין נתונות לוויכוח3.
מוצרים המבוססים על דם חולקים עם דמעות הרכב דומה במונחים של מטבוליטים14, חלבונים, שומנים, ויטמינים, יונים, גורמי גדילה (GFs), תרכובות נוגדות חמצון 11 ואוסמולריות (300 mOsm/L)11. באמצעות הפעילות הסינרגטית של מרכיביהם, הם מקדמים את התחדשות אפיתל הקרנית, מעכבים את שחרורם של ציטוקינים דלקתיים ומגדילים את מספר תאי הגביע ואת הביטוי של מוצינים בלחמית 2,3.
עד כה, הטרוגניות במוצרים מבוססי דם עיניים תועדה בספרות; ניתן לסווג מוצרים אלה לפי מוצא תורמי הדם, כלומר אוטולוגי או אלוגני, כמו גם מקור הדם, כלומר דם היקפי, דם טבורי, סרום או טסיות דם.
למרות שמוצרים אוטולוגיים היוהנפוצים ביותר 3, אלה אלוגניים הופכים כעת לבחירה המועדפת, שכן הם מבטיחים יעילות גבוהה יותר ותקני בטיחות 15, יחד עם הפחתה משמעותית בעלויות16,17. מחקרים קודמים, אכן, הוכיחו כי מוצרים מבוססי דם המתקבלים מחולים עם מחלות אוטואימוניות ו/או סיסטמיות עשויים להראות שינוי באיכות ובפונקציונליות 6,16,17. למרות העובדה שטיפות עיניים מבוססות סרום הן הנפוצות ביותר, מוצרים מבוססי טסיות דם מקבלים לאחרונה אישור כחלופה תקפה, שכן ניתן להכין אותם בקלות תוך שמירה על רמות משמעותיות של יעילות 3,11. ניתן לחלק מוצרים מבוססי טסיות הזמינות כיום בפלזמה עשירה בטסיות דם (PRP), ליזאט פלזמה עשיר בטסיות (PRP-L) ופלזמה עשירה בגורמי גדילה (PRGF)3.
ביניהם, PRP-L יש את היתרון של להיות מוצר קפוא חיים ארוכים. ניתן להכין PRP-L מאפרזיס, מעילי באפי, או אפילו מטסיות שפג תוקפן (PLTs)18,19, מה שמפחית באופן יקר את הבזבוז שלהן. ניתן לאחסן את האליקוטים במשך חודשים במרכזי עירויי הדם בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס או אפילו בבתי החולים בטמפרטורה של −15 מעלות צלזיוס לתקופות קצרות יותר.
PRP-L מועשרים מאוד ב-GFs, אשר הוכחו כמעודדים התחדשות פני השטח של העיניים 12,20,21. עם זאת, ישנם רק מחקרים קליניים מעטים שדווחו בתחום זה, וכולם השתמשו במקורות אוטולוגיים 3,22. PRP-L עדיין זקוק לאימות ואפיון נוספים לפני שניתן יהיה להשתמש בו באופן שגרתי לטיפול במחלות פני העין, שכן אין הנחיות סטנדרטיות להכנתו, חלוקתו ואחסון3.
כאן, פרוטוקול מפורט משותף לייצור PRP-L המשמש ביחידה לרפואת עירוי ב- AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, איטליה, וחלוקה לחולים עם DED. אנו שואפים לסייע לקהילה המדעית לפתח שיטות הכנה סטנדרטיות, שעשויות להגביר את ההומוגניות והעקביות במחקרים ובגישות קליניות ברחבי העולם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
PRP-L המשמש להערכה כמותית של גורמי צמיחה נאספו במסגרת מחקר רחב יותר על אפיון מוצרי PRP למטרות רגנרטיביות, שבוצע ב- AUSL-IRCCS di Reggio Emilia ואושר על ידי הוועדה האתית של אזור וסטה אמיליה נורד ב-10 בינואר 2019 (פרוטוקול מספר 2019/0003319). התורמים נתנו את הסכמתם מדעת בהתאם להצהרת הלסינקי. לא היה צורך באישור אתי לאיסוף הנתונים המצטברים והאנונימיים של שאלון מדד מחלות פני השטח של העין (OSDI), המשמש באופן שגרתי רופאים לניטור תסמיני תסמונת העין היבשה. איור 1A מציג מתווה של הפרוטוקול שבוצע, בעוד שהתמונות באיור 1B מתארות את השלבים העיקריים של ההליך.
1. אוסף פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP)
- אפרזיס PRP
- עבור פרוטוקול זה, בחר תורמי טסיות על פי החוקים האיטלקיים: תורמי טסיות חייבים להיות בני 18-65, עם פרמטרים תקינים של לחץ וספירת דם וספירת טסיות לא פחות מ 180 x 109 טסיות / L23. תורמים זכאים אינם יכולים ליטול תרופות נוגדות טסיות או נוגדות קרישה תוך שבוע לפני התרומה.
- בצע פלזמה-טסיות-אפרזיס באמצעות מערכת איסוף דם אוטומטית, על פי הוראות היצרנים והחוקים הלאומיים23, כדי לקבל יחידה אחת של פלזמה עשירה בטסיות דם של תורם יחיד (PRP). אסוף PRP בתמיסת אדנין ציטראט דקסטרוז A (ACD-A) תמיסת נוגדי קרישה.
הערה: טסיות-אפרזיס מתבצעת עם הליך מתמשך; זמן האיסוף הוא בטווח שבין 40 דקות ל -90 דקות. כמות ה-ACD המועברת לתורמים וזמן ההליכים תלויים במאפייני התורם, כגון המטוקריט ומד מחט.
- מאפייני יחידות PRP
הערה: השלב הבא מבוצע בדרך כלל באופן אוטומטי על ידי מערכת איסוף הדם האוטומטית במהלך הליך פלזמה-טסיות-אפרזיס. אנא עיין במדריך ההוראות של היצרן.- השהה את יחידות ה- PRP שנאספו על ידי אפרזיס בכמות מספקת של תמיסה משמרת עם הכמות המינימלית של פלזמה שיורית, הדרושה לשמירה על pH > 6.4 במהלך כל זמן האחסון, לנפח סופי ממוצע של 180 מ"ל נטו של התמיסה נוגדת הקרישה (כ -40 מ"ל).
הערה: על פי החוק האיטלקי, בקרות איכות צריכות להעריך כי ספירת הטסיות (PLTs) היא לפחות 2.0 x 1011 PLTs / יחידה, בעוד leucocytes שיורי צריך להיות פחות מ 1 x 106 תאים / יחידה. - יש לאחסן PRP מקודד ומוקרן למשך 5 ימים לכל היותר ב-22°C ±-2°C על שייקר טסיות לפני מניפולציה נוספת23.
- השהה את יחידות ה- PRP שנאספו על ידי אפרזיס בכמות מספקת של תמיסה משמרת עם הכמות המינימלית של פלזמה שיורית, הדרושה לשמירה על pH > 6.4 במהלך כל זמן האחסון, לנפח סופי ממוצע של 180 מ"ל נטו של התמיסה נוגדת הקרישה (כ -40 מ"ל).
- דילול PRP
- מיד לפני תחילת דילול PRP, בצע ספירת PLT עם המוציטומטר באמצעות הדגימה שנאספה מהשקית הראשית דרך דוקרנים חודרים.
הערה: בצע את השלבים הבאים בסטריליות תחת מכסה מנוע biohazard מדרגה II. יש ללבוש ציוד הגנה אישי (מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן) במהלך ההליך. - לדלל PRP עם כמות מספקת של NaCl סטרילי 0.9% לריכוז סופי של 0.32 x 109 ± 0.03 x 109 PLTs / mL, המדמה את ריכוז PLT הממוצע בדם היקפי.
- תוך ניצול ספייק נוקב לשקיות דם, חלקו את ה- PRP המדולל לשקיות איסוף ריקות של 300 מ"ל כדי להגיע לנפח נטו של 190 מ"ל לשקית.
- השתמש aliquot של PRP מדולל שיורי (בדרך כלל 1 מ"ל) כדי לבצע בקרות איכות הערכת זיהומים מיקרוביאליים אפשריים. בצע בדיקת סטריליות בהתאם להוראות היצרן במעבדה מיקרוביולוגית (ראה טבלת חומרים).
הערה: השתמש בבקבוקוני תרבית ספציפיים לתרביות דם אירוביות, המסוגלים לבצע את התרבית האיכותית ואת ההתאוששות של מיקרואורגניזמים אירוביים (בעיקר חיידקים ושמרים) מדגימות דם בנפח קטן. - יש לאחסן שקיות PRP מדוללות בטמפרטורה של −80°C למשך חודשיים לכל היותר לפני ההפשרה.
- מיד לפני תחילת דילול PRP, בצע ספירת PLT עם המוציטומטר באמצעות הדגימה שנאספה מהשקית הראשית דרך דוקרנים חודרים.
2. הכנת ליזאט פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP-L)
- הפשרה
- לפני תחילת הליך ההפשרה, ודא כי אמבטיה חמה מוגדרת ב 37 מעלות צלזיוס. הכניסו את שקיות ה- PRP לאמבטיה החמה והמתינו עד להפשרה מוחלטת.
- אוסף PRP-L
- צנטריפוגה שקיות PRP ב 3000 x גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: השלבים הבאים צריכים להתבצע בסטריליות תחת מכסה מנוע ביו-האזרד מדרגה II. - תוך ניצול הספייק החודר של תיק ההעברה, חבר את התיק הצנטריפוגה לשקית העברה סטרילית ריקה של 300 מ"ל. בזהירות העבירו את ה-PRP-L, תוך הימנעות מפסולת, לתוך השקית החדשה. במידת האפשר, יש להשתמש במכבש שקית.
- אטם את צינור החיבור של יחידת PRP-L עם חותם שקית.
- צנטריפוגה שקיות PRP ב 3000 x גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- PRP-L אליציטוט
הערה: יחידת התחלה המכילה 190 מ"ל PRP (ראה שלב 1.3.3.) מספיקה למילוי שתי ערכות טיפות עיניים (לפרטים על המכשירים הרפואיים הספציפיים המשמשים ליישום ושימור טיפות עיניים ממרכיבי הדם, עיין בטבלת החומרים). יש לפתוח ערכות טיפות עיניים מתחת למכסה מנוע מדרגה II כאשר בקבוקוני המיתרים השלמים ממוקמים מעל המזרק המחובר מראש והחץ המרכזי של הפקק מצביע שמאלה כדי לא לכלול את המסנן האנטי בקטריאלי.- לאסוף 30-60 מ"ל של PRP-L עם מזרק סטרילי ולקשר את המזרק לחיבור Luer / מנעול על קו המילוי.
- על פי הוראות היצרן, סובב את הסטופר בחצי סיבוב כדי לפתוח את הקו בין המזרק המכיל PRP-L לבין המזרק המחובר מראש. מלא את המזרק המחובר מראש ב- PRP-L.
- נתק את מזרק PRP-L, סגור את מכסה הצינור של חיבור הלואר/נעילה וסובב את ה-stopcock למיקום המקורי. השתמש במזרק ערכת טיפות העיניים כדי למלא את הבקבוקונים ב- PRP-L.
- חזור על ההליך משלבים 2.3.1.-2.3.3. עד שכל בקבוקוני המוליך מתמלאים. ודא כי כל המוליך מלא כראוי, ולאחר מכן לאטום אותם בנפרד עם חותם שקית.
- חזור על ההליך עם ערכת טיפות עיניים חדשה.
- השתמש באליקוט קטן של PRP-L מדולל שיורי כדי להעריך זיהום מיקרוביאלי אפשרי (ראה שלב 1.3.4.).
הערה: אם הנוזל מגיע בטעות למסנן האנטי-בקטריאלי שבקצה החוט, מזרק היניקה עלול להתנגד להתנגדות, מה שמעכב את המילוי. כדי להמשיך את מחזור המילוי, הרימו את החלק הסופי של המחרוזת לכ-5/6 אליקוטים מהמסנן ההידרופובי האנטי-בקטריאלי שבקצה החוט. במצב זה, להשתמש מזרק סטרילי חדש (של נפח 30 מ"ל) כי כבר מלא באוויר. חברו את הלואר/מנעול הנשי של המסנן האנטי-בקטריאלי ולחצו חזק ושוב על הבוכנה של המזרק כדי להסיר את כל שאריות רכיב הדם ולהפוך את הממברנה של המסנן האנטי-בקטריאלי ללא הנוזל. מוציאים את המזרק וממלאים את הבקבוקונים הנותרים.
- אחסון PRP-L
- תייג כראוי כל אפליקטור והכניס אותם לשקית ניילון. תייג גם את שקית הניילון, תוך הקפדה להדגיש את קבוצת הדם של התורם.
- יש לאחסן בטמפרטורה של −80°C למשך 24 חודשים לכל היותר לפני הקצאת המטופל, על פי החוק האיטלקי23 והנחיות24.
3. חלוקת PRP-L
- בצע את הקצאת המטופל עדיף על ידי התאמת קבוצת הדם PRP-L. ספק בקבוקוני אפליקטור PRP-L באמצעות קופסה קרירה וודא שכל בקבוקון אפליקטור מכיל 1.45 מ"ל של PRP-L, המתאים לכ-45 טיפות. להנחות את המטופל כי בקבוקונים המוליך ניתן לאחסן בבתי המטופלים עד 1 חודש ב -15 מעלות צלזיוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הרציונל לשימוש בטיפות עיניים שמקורן בסרום (שהוא המוצר מבוסס הדם הנפוץ ביותר לטיפול במחלות פני העין) טמון בתכולתן של GFs, אשר נגזרות כמעט לחלוטין מטסיות דם במחזור. PRP מכיל מספר גבוה משמעותית של טסיות דם (וכתוצאה מכך, של GFs שמקורם בטסיות) בהשוואה לסרום דם היקפי, הנע בין 0.15 x 10 9-0.45 x 109 PLTs / mL. על פי החוקים האיטלקיים, ספירת הטסיות ביחידות PRP צריכה להיות לפחות 0.9 x 109-1 x 109 PLTs / mL. לכן, כדי להשיג מוצר המדמה את היעילות של טיפות עיניים בסרום, PRP צריך להיות מדולל לתכולת טסיות פיזיולוגית לפני הכנת ליזאט.
עם זאת, מכיוון שתיקון רקמות מונע בעיקר על ידי GFs שמקורם בטסיות דם, ספירת ה- PLT לבדה עלולה להטעות לטיפול יעיל במחלות פני העין. ב- DED, שהיא מחלת העיניים המטופלת בדרך כלל עם טיפות עיניים שמקורן בדם, הפקת סרטי דמעה והומאוסטזיס נפגעים. מוצרים מבוססי טסיות לטיפול ב- DED, אם כן, צריכים גם לחקות את התוכן הפיזיולוגי של דמעות.
כדי לזהות את PRP-L המתאים ביותר לטיפול במחלות פני השטח של העין, המתואר בשלב 1.3.2. של הפרוטוקול הנוכחי, הערכנו באופן ראשוני דילולי PRP שונים, על פי תוכן ה- PLTs שלהם (בין 0.7 x 10 9/mL ו- 0.3 x 109/mL), וכמה GFs מייצגים מאלה הידועים כמעורבים בתיקון רקמת העין12,20,21.
ספירת הטסיות בוצעה באמצעות המוציטומטר, בעוד ש- GFs הוערכו באמצעות בדיקת כימות חלבונים מרובה. הבדיקה בוצעה כאמור25 על פי הוראות היצרן. GFs המוצגים בכתב יד זה נבחרו לכימות לאחר סינון ראשוני של 36 GFs ו- GFRs שבוצעו על ליזאט PRP עם מערך חלבונים חצי כמותי. כימות לומינקס בוצע ב-3 מתוך 36 ה-GFs שנבדקו: EGF ו-PDGF (שהתבררו כנפוצים ביותר בליסאטות ה-PRP שלנו) ואיזופורמים TGFβ-1,2,3 (שעבורם התוכן חשוב לטיפול בפני השטח של העין21). תוכן EGF ו-PDGF נמדד מכיוון שהם עשויים להשפיע על היעילות של PRP-L22, בעוד שאיזופורמים של TGFβ נבחרו בשל תפקידם הידוע באיתות חיסוני21.
מאחר שמערכי חלבונים הם חלק ממחקר אחר במבחנה על אפיון PRP26 שונה, נתונים אלה אינם מוצגים בכתב יד זה.
הערכנו באופן כמותי את EGF, PDGF ו- TGFβ בליזאטים של PRP משני תורמים שונים (D1 ו- D2), שדוללו בעבר בין 0.7 x 10 9-0.3 x 10 9 PLTs / mL ב- 0.9% NaCl. איור 2 מציג את התוצאות של דילול 0.3 x 109 PLTs / mL, אשר התברר להיות דומה ביותר להרכב דמעות.
דילול 0.3 x 109 PLTs /mL נבחר על סמך נתוני ספרות על הרכב דמעות. ערכי ה-EGF נמצאו נמוכים למדי בהשוואה לערך הקרע הממוצע אך עדיין בטווח הנורמליות27. אפילו PDGF, למרות היותו משתנה מאוד בין שני התורמים שנלקחו בחשבון, תמיד היה דומה לריכוז שנמצא בדמעות רגילות20. לבסוף, TGFβ-1 נמצא כאיזופורם הנפוץ ביותר ב-PRP-L, בדומה לדמעות21.
לאחר שזוהה דילול ה- PLT המתאים ביותר להכנת אפרזיס PRP-L, היחידה לרפואת עירוי החלה להפיץ מוצרים אלה לחולים שנפגעו מהפרעות בפני השטח של העיניים בשנת 2015. רופאי העיניים אספו באופן שגרתי את שאלוני OSDI כדי לעקוב אחר תסמיני DED; מבחן OSDI מעריך מדדי איכות חיים, כגון תפיסת גירוי העיניים וכיצד הוא משפיע על התפקוד הקשור לראייה. השאלון, שנוצר על ידי קבוצת מחקר התוצאות באלרגן בע"מ בשנת 1995 והתקבל כעת כמכשיר תקף לניטור DED, מוגש למטופלים ומנותח כפי שתואר קודם לכן28,29.
כאן אנו מראים את התוצאות המצטברות של בדיקות OSDI של חולי DED שטופלו בין ינואר 2020 לינואר 2021 (n = 27). לאחר טיפול של 6 חודשים ב-PRP-L, ציוני ה-OSDI ירדו מ-56 ±-21 ל-45 ±-21, מה שמצביע על שיפור באיכות החיים של המטופלים (איור 3).
למרות שנתונים אלה עדיין נמצאים בטווח החמור ואינם מתייחסים לתוצאות קליניות של יעילות, הם מציעים לחולי DED לשקול PRP-L מוצר שימושי המפחית אי נוחות בעיניים; היבט זה צריך להיחקר עוד יותר בניסויים קליניים פרוספקטיביים שמטרתם להעריך את יעילותו בטיפול במחלות פני השטח של העין.
בטבלה 1 אנו מדווחים על השוואה של שיטת הייצור הנוכחית עם שיטה אחרת להכנת PRP-L אלוגני לטיפות עיניים30 ולמטרות אחרות22. למיטב ידיעתנו, פרוטוקול30 של ג'אנג והפרוטוקול הנוכחי הם השיטות היחידות שפורסמו לייצור PRP-L עבור משטח העין. בשניהם, PRP-L מתקבל מאפרזיס; יש להשוות את ההבדלים בין שני הפרוטוקולים, המתייחסים בעיקר למספר מחזורי ההקפאה וההפשרה ולשלבי הצנטריפוגה, על מנת לשפר את ייצור PRP-L. עם זאת, הבדלים מתודולוגיים אלה לא הוכחו כמזיקים ליכולת ההתחדשות של PRP-L שנבדקה על רקמות אחרות22.
איור 1: השלבים העיקריים של הפרוטוקול להכנת PRP-L. (A) ערכת הפרוטוקול, מאיסוף PRP ועד הכנה וחלוקה של PRP-L. (ב) תמונות מייצגות של השלבים העיקריים של הפרוטוקולים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: כימות לומינקס של גורמי גדילה שמקורם בטסיות עבור דילול של0.3 x 10 9/מ"ל של PRP-L. (A) גורם גדילה אפידרמלי (EGF); (B) גורם גדילה שמקורו בטסיות (PDGF); (C) שינוי גורם גדילה-בטא איזופורם 1 (TGFβ1); (D) שינוי גורם גדילה-בטא איזופורם 2 (TGFβ2); (E) שינוי גורם גדילה-בטא איזופורם 3 (TGFβ3). הערכים מבוטאים כ-pg/mL, ממוצע ± סטיית תקן של שלוש מדידות בלתי תלויות. D1 ו- D2 הם שני תורמי טסיות שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ציוני OSDI מצטברים של חולי DED שטופלו ב-PRP-L בין ינואר 2020 לינואר 2021 ביחידת העיניים של AUSL-IRCCS di Reggio Emilia. N = 27 חולים. התוצאות המצטברות של ציון OSDI מיוצגות כממוצע ± שגיאת תקן, ערך p חושב עם מבחן t זוגי עם תוכנה לניתוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| מאמר זה | PRP-L לעין (מחקר במבחנה )29 | PRP-L למטרות אחרות21 | |
| מקור | PLTs אפרזיס | PLTs אפרזיס | אפרזיס ודם שלם |
| מחזורי הקפאה והפשרה | 1 (ב-80°C-) | 2 (ב-80°C-) | 1-3 (ב-20 מעלות צלזיוס ו-80 מעלות צלזיוס) |
| טמפרטורת אחסון | ב-80°C- | ב-80°C- | ב-20°C- וב-80°C- |
| מהירות צנטריפוגה לפני האחסון | 3000 x גרם/30 דקות | 3500 x גרם/30 דקות | 400-3000 x g/6 דקות -30 דקות |
| סינון לפני האחסון | לא | כן | לא/כן |
טבלה 1: השוואה בין פרוטוקולים להכנת PRP-L אלוגני ממוצרים מבוססי טסיות שנאספו על ידי אפרזיס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשנים האחרונות, השימוש הקליני של מוצרים מבוססי טסיות עבור פתולוגיות פני השטח של העין גדל, אבל הדיפוזיה שלהם נפגעת על ידי חוסר חוסן מדעי. זה נגרם בעיקר על ידי הטרוגניות רחבה במקורות התורמים ופרוטוקולי הכנה, שלעתים קרובות אינם נחשפים במלואם או לא תוכננו במיוחד למטרה שלשמה הם מחולקים. במיוחד, מידע על מוצרים מבוססי טסיות שנאספו על ידי אפרזיס עדיין חסר. לכן, מטרת העבודה הנוכחית הייתה לתאר את העיבוד שלב אחר שלב של ליזטים פלזמה עשירים בטסיות דם (PRP-L) המתקבלים על ידי אפרזיס לטיפול ב- DED.
PRP-L הוא מקור אופטימלי לייצור טיפות עיניים שכן הוא מכיל יותר GFs מאשר מוצרים אחרים מבוססי דם22, וכאשר בהשוואה לסרום או PRP, הייצור או האחסון שלו זולים ופשוטים. כדי להשיג PRP-L, טסיות נתונים לתזה (בדרך כלל באמצעות מחזור הקפאה והפשרה אחד או יותר) כדי לשחרר את התוכן שלהם. תהליך זה מבטיח תמיסה מועשרת במולקולות פעילות הממריצות התחדשות רקמות22,26. מספר גדל והולך של מחלות טופלו ב- PRP-L 22, אך ההתוויה לשימוש ברפואת עיניים עדיין חלשה בשל קריטריוני התקינה הנמוכים באיסוף טסיות וייצור PRP-L 3,22.
יש להעדיף מוצרים מבוססי טסיות אלוגניות מכיוון שהם סטנדרטיים יותר ממוצרים אוטולוגיים, הן מבחינת מאפייני התורם והן מבחינת שיטת ההכנה. מצב בריאות המטופל עשוי להשפיע על איכות המוצר 6,16,17, בעוד שהערכות הפנימיות לאיסוף טסיות דם אוטולוגיות מדם שלם כאשר שירותי העירוי אינם זמינים ישירות אינן עומדות באיכות הסטנדרטית הנדרשת ברפואת עירוי31.
למיטב ידיעתנו, אין מחקרים קליניים המאפיינים את השימוש ב- PRP-L אלוגני ברפואת עיניים 3, בעוד שיש מעט דיווחים לגבי טיפות עיניים אוטולוגיות PRP-L3 ורק מחקר אחד המשתמש ב- PRP-L אלוגני המתקבל מדם טבורי לטיפול בחולים עם מחלות פני העין32. למרות ש- PRP-L אלוגני מופיע בהנחיות הקליניות24 והשימוש בו הוצע 3,30, עדיין חסרות ראיות ליעילותו בהשוואה לטיפולים אחרים ולמוצרים אחרים מבוססי דם (למשל, סרום). כאן, הפרוטוקול המוצג נועד לסייע לקהילה המדעית לפתח שיטות ייצור נפוצות ולשפוך אור על ההבדלים המתודולוגיים.
כאן תיארנו את ייצור PRP-L החל מ-PRP אלוגני שנאסף על ידי אפרזיס. מוצרים אלוגניים מבוססי טסיות דם לקבלת ליזטים של טסיות דם עשויים להיאסף גם מ-buffy-coats (BCs), ושני המקורות דווחו באותה מידה31. BCs מתקבלים מתורמים מאוגדים (בדרך כלל ארבעה או חמישה), ובכך ממזערים את ההבדלים בין הפרטים. לעומת זאת, איגום מעלה את הסיכון להעברת גורמים מזהמים או פריונים או גירוי תגובה אלוגנית31,33. אפרזיס הוא הליך מורכב ופולשני, ורק מיעוט מהתורמים זכאים לו או עומדים בו34. עם זאת, מוצרים מבוססי טסיות הדם המתקבלים על ידי אפרזיס נקיים משאריות אחרות של תאי דם במחזור הדם ומכילים כמות גבוהה יותר של PLTs35. מסיבות אלה, העבודה הנוכחית מתמקדת בפיתוח מחקרים קליניים להשוואת PRP-L משני מקורות שונים אלה.
בפרוטוקול זה, הריכוז ההתחלתי של PLTs ביחידות PRP שנאספו על ידי אפרזיס היה בממוצע 1 x 109/mL, אשר עולה בקנה אחד עם הריכוזים המדווחים עבור מוצרים אחרים מבוססי טסיות22. בשיטה זו, PLTs מדוללים לאחר מכן עם תמיסת NaCl של 0.9% ל-0.3 x 109/mL. פרוטוקולים אחרים מדווחים על שימוש בפלזמה לדילול22.
מחקרים מעטים דיווחו על שימוש ב- PRP-L ברפואת עיניים; במקרים אלה, טיפות עיניים אוטולוגיות הוכנו בריכוזים של PLTs הנעים בין 0.5 x 10 9/mL-1 x 109/mL36,37,38. כפי שפורט קודם לכן, סמני סטנדרטיזציה רצויים וגם יסייעו בקביעת הדילול הנכון. כאן, למשל, אנו מדווחים על ריכוז של כמה GFs מרכזיים ב- PRP-L. תוכן EGF ו- PDGF משפיע על היעילות של PRP-L22, בעוד איזופורמים TGFβ מעורבים בוויסות איתות חיסוני21,39, וריכוזם מוסדר היטב. לכן, ריכוז TGFβ בטיפות עיניים מבוססות טסיות עשוי להשפיע לא רק על היעילות אלא גם לעורר השפעות מזיקות פוטנציאליות39; לכן, יש לחקור אותו בקפידה לפני הגדרת הדילול הנכון. עם זאת, הדילול שנבחר - 0.3 x 109 PLTs / mL- התבסס על תוכן GFs בדמעות21,25. Zhang et al. השוו בעבר בין טיפות עיניים מבוססות סרום, הן אוטולוגיות והן אלוגניות, לבין ליזטים מבוססי טסיות דם לתכולתן ב-GFs וליכולתן לקדם התחדשות של תאי קרנית במבחנה30. המחקר הראה כיצד למוצרים אלה יש תכונות דומות, כאשר PRP-L הוא בעל ריכוז EGF גבוה יותר אך פיברונקטין נמוך יותר. בפרוטוקול שלהם, תהליך ההקפאה/הפשרה חזר על עצמו פעמיים, הצנטריפוגה פעלה ב-3500 x g במשך 30 דקות, והליזאט הטסיות אוחסן בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס30.
הקפאה והפשרה היא אכן צעד קריטי; רוב הפרוטוקולים (כולל זה) פותחו עם הקפאה של −80 מעלות צלזיוס והפשרה של 37 מעלות צלזיוס, אך הקפאה דווחה גם ב-−24 מעלות צלזיוס, −196 מעלות צלזיוס, ו-−150 מעלות צלזיוס 22,33 אפילו מספר מחזורי ההקפאה/הפשרה שבוצעו משתנים, ונעים בין 1ל-5 22,33. מספר מצומצם של מחקרים דיווחו גם על סוניקציה או טיפול בממס/דטרגנט כדי להשיג ליזטים טסיות22,33. משתנים מתודולוגיים אחרים שדווחו בעבר בהכנת PRP-L נוגעים לשלב הצנטריפוגה - בין 300 x g ל- 10000 x g, מ -2 דקות עד 60 דקות - ואת האחסון לטווח ארוך, אשר, ברוב המקרים, הוא ב -80 מעלות צלזיוס, אם כי מוצרים דומים אוחסנו גם ישירות ב -20 °C22. בפרט, יש לעקוב בקפידה אחר תנאי האחסון, שכן הם עשויים להשפיע על הזמינות והפעילות של GFs הכלולים בליסאטות. בהקשר הטרוגני זה, יש להעריך בדחיפות בקרות איכות ומחקרים קליניים תוך התחשבות בשחרור גורמים ביוגניים ובהבדלים באפקט הטיפולי.
לבסוף, כאן אנו מראים כיצד שיטה זו הוערכה באופן משמעותי עם תוצאה חיובית מניתוח מצטבר של חולים עם מחלת עיניים יבשות המקבלים PRP-L במשך 6 חודשים (שאלון OSDI3). למרות ההבטחה, OSDI לבדו אינו מספיק כדי לקבוע את היעילות של PRP-L בטיפול במחלות DED ומחלות אחרות של פני העין, ומחקרים קליניים על השימוש ב- PRP-L אלוגניים מוצדקים. יתר על כן, יש להשוות הבדלים אפשריים בהרכב המוצר עקב צעדים מתודולוגיים חלופיים (כלומר, הקפאה והפשרה, צנטריפוגה, אחסון) על מנת לייעל את ההליך המתודולוגי.
לסיכום, ההטרוגניות הגבוהה של מקורות הדם והפרוטוקולים עדיין מעכבת את התרגום הסופי של מוצרים מבוססי דם לטיפול קליני במחלות פני השטח של העין. למרות PRP-L הוא מוצר מתפתח עם כמה תכונות יתרון, מחקרים נוספים נחוצים כדי לאמת את השימוש בו ולפתח הנחיות משותפות. שיתוף ופירוט פרוטוקול ההכנה עשוי להרחיב את השימושיות ולשפוך אור על השלבים הקריטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות ל-"Casa del Dono di Reggio Emilia" על אספקת תרכיזי טסיות שמקורם בתורמים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CompoSeal Mobilea II | Fresenius Kabi, Germany | bag sealer | |
| HeraSafe hood | Heraeus Instruments, Germany | Class II biohazard hood | |
| MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System | Haemonetics, Italy | automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components | |
| Platelet shaker, PF396i | Helmer, USA | Platelet shaker | |
| Raycell X-ray Blood Irradiator | MDS Nordion, Canada | X-ray Blood Irradiator | |
| ROTIXA 50RS | Hettich Zentrifugen, Germany | High speed entrifuge | |
| Sysmex XS-1000i | Sysmex Europe GMBH, Germany | haemocytometer for platelet count | |
| Warm bath, WB-M15 | Falc Instruments, Italy | Warm bath | |
| Materials | |||
| ACD-A anticoagulant solution A | Fenwal Inc., USA | DIN 00788139 | anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml) |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | BD 442020 | Sterility assay |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | 442020 | At least 2 vials for sterility assay |
| BD Luer Lok Syringe | BD Plastipack, USA | 300865 | At least 4 sterile syringes (50 ml) |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 1 | BioRad Laboratories, USA | 171AC500M | Standard panel for PDGF isoforms assessment |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 2 | BioRad Laboratories, USA | 171AC600M | Standard panel for EGF assessment |
| Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad Laboratories, USA | Magpix | This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads. |
| Bio-Plex Pro TGF-b Assay | BioRad Laboratories, USA | 10024984 | Set and standards for TGFb isoforms assessment |
| BioRet | ARIES s.r.l., Italy | A2DH0020 | At least 4 piercing spike for blood bags |
| Blood collection tube | BD Vacutainer, USA | 367835 | 1 tube, necessary to perform platelet counts |
| Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents | Biomed Device s.r.l., Italy | COLC50 | Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected |
| Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC511 | Set for PDGF isoforms assessment |
| Human Cancer2 EGF Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC603M | Set for EGF assessment |
| NaCl 0.9% sterile solution | Baxter S.p.A., Italy | B05BB01 | 1000 ml |
| OSDI Questionnaire | Allergan Inc., USA | OSDI | Ocular Surface Disease Index Questionnaire |
| Piercing spike | BioRet ARIES s.r.l., Italy | BS051004 | Spike |
| Platelet Additive Solution A+ T-PAS+ | TERUMO BCT Inc., Italy | 40842 | preservative solution for platelet concentrates (1000 ml) |
| Software Excel | Microsoft, USA | Excel | Data analysis software |
| Teruflex Transfer bag 1000 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*T100BM | 1 for PRP dilution |
| Teruflex Transfer bag 300 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*030CM | At least 6 for each PRP unit collected |
References
- Everts, P. A., et al. Platelet-rich plasma and platelet gel: A review. The Journal of Extra-Corporeal Technology. 38 (2), 174 (2006).
- Giannaccare, G., et al. Blood derived eye drops for the treatment of cornea and ocular surface diseases. Transfusion and Apheresis Science. 56 (4), 595-604 (2017).
- Bernabei, F., et al. Blood-based treatments for severe dry eye disease: The need of a consensus. Journal of Clinical Medicine. 8 (9), 1478 (2019).
- Findlay, Q., Reid, K. Dry eye disease: When to treat and when to refer. Australian Prescriber. 41 (5), 160-163 (2018).
- Clayton, J. A.
- Jones, L., et al. TFOS DEWS II management and therapy report. The Ocular Surface. 15 (3), 575-628 (2017).
- Holland, E. J., Darvish, M., Nichols, K. K., Jones, L., Karpecki, P. M. Efficacy of topical ophthalmic drugs in the treatment of dry eye disease: A systematic literature review. The Ocular Surface. 17 (3), 412-423 (2019).
- Shih, K. C., Lun, C. N., Jhanji, V., Thong, B. Y. H., Tong, L. Systematic review of randomized controlled trials in the treatment of dry eye disease in Sjogren syndrome. Journal of Inflammation. 14, 26 (2017).
- Rusciano, D., et al. Age-related dry eye lactoferrin and lactobionic acid. Ophthalmic Research. 60 (2), 94-99 (2018).
- Craig, J. P., et al. TFOS DEWS II definition and classification report. The Ocular Surface. 15 (3), 276-283 (2017).
- Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: Therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
- Giannaccare, G., et al. Blood derived eye drops for the treatment of cornea and ocular surface diseases. Transfusion and Apheresis Science. 56 (4), 595-604 (2017).
- Acebes-Huerta, A., et al. Platelet-derived bio-products: Classification update, applications, concerns and new perspectives. Transfusion and Apheresis Science. 59 (1), 102716 (2020).
- Quartieri, E., et al. Metabolomics comparison of cord and peripheral blood-derived serum eye drops for the treatment of dry eye disease. Transfusion and Apheresis Science. 60 (4), 103155 (2021).
- Badami, K. G., McKellar, M. Allogeneic serum eye drops: Time these became the norm. British Journal of Ophthalmology. 96 (8), 1151-1152 (2012).
- Hwang, J., et al. Comparison of clinical efficacies of autologous serum eye drops in patients with primary and secondary Sjögren syndrome. Cornea. 33 (7), 663-667 (2014).
- Chiang, C. C., Lin, J. M., Chen, W. L., Tsai, Y. Y. Allogeneic serum eye drops for the treatment of severe dry eye in patients with chronic graft-versus-host disease. Cornea. 26 (7), 861-863 (2007).
- Jonsdottir-Buch, S. M., Lieder, R., Sigurjonsson, O. E. Platelet lysates produced from expired platelet concentrates support growth and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 8 (7), 68984 (2013).
- Altaie, A., Owston, H., Jones, E. Use of platelet lysate for bone regeneration - Are we ready for clinical translation. World Journal of Stem Cells. 8 (2), 47-55 (2016).
- Vesaluoma, M., Teppo, A. M., Grönhagen-Riska, C., Tervo, T. Platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) in tear fluid: A potential modulator of corneal wound healing following photorefractive keratectomy. Current Eye Research. 16 (8), 825-831 (1997).
- Zheng, X., et al. Evaluation of the transforming growth factor β activity in normal and dry eye human tears by CCL-185 cell bioassay. Cornea. 29 (9), 1048 (2010).
- Zamani, M., et al. Novel therapeutic approaches in utilizing platelet lysate in regenerative medicine: Are we ready for clinical use. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17172-17186 (2019).
- Ministro della Salute. Disposizioni relative ai requisiti di qualità e sicurezza del sangue e degli emocomponenti. Italian Ministry of Health. , DECRETO 2 Novembre 2015 (2015).
- Aprili, G., et al. Raccomandazioni SIMTI sugli emocomponenti per uso non trasfusionale. Società Italiana di Medicina Trasfusionale e Immunoematologia. , (2012).
- Schiroli, D., et al. Comparison of two alternative procedures to obtain packed red blood cells for β-thalassemia major transfusion therapy. Biomolecules. 11 (11), 1638 (2021).
- Pulcini, S., et al. Apheresis platelet rich-plasma for regenerative medicine: An in vitro study on osteogenic potential. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8764 (2021).
- Ohashi, Y., et al. Presence of epidermal growth factor in human tears. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (8), 1879-1882 (1989).
- Vitale, S., Goodman, L. A., Reed, G. F., Smith, J. A. Comparison of the NEI-VFQ and OSDI questionnaires in patients with Sjögren's syndrome-related dry eye. Health Quality of Life Outcomes. 2, 44 (2004).
- Schiffman, R. M., Christianson, M. D., Jacobsen, G., Hirsch, J. D., Reis, B. L. Reliability and validity of the Ocular Surface Disease Index. Archives of Ophthalmology. 118 (5), 615-621 (2000).
- Zhang, J., et al. Characteristics of platelet lysate compared to autologous and allogeneic serum eye drops. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), 24 (2020).
- Henschler, R., Gabriel, C., Schallmoser, K., Burnouf, T., Koh, M. B. Human platelet lysate current standards and future developments. Transfusion. 59 (4), 1407-1413 (2019).
- Samarkanova, D., et al. Clinical evaluation of allogeneic eye drops from cord blood platelet lysate. Blood Transfusion. 19 (4), 347-356 (2021).
- Strunk, D., et al. International Forum on GMP-grade human platelet lysate for cell propagation: Summary. Vox Sanguinis. 113 (1), 80-87 (2018).
- Schiroli, D., et al. The impact of COVID-19 outbreak on the Transfusion Medicine Unit of a Northern Italy Hospital and Cancer Centre. Vox Sanguinis. 117 (2), 235-242 (2021).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: An in vitro study. International Journal of Molecular Science. 19 (1), 212 (2018).
- Fea, A. M., et al. The effect of autologous platelet lysate eye drops: An in vivo confocal microscopy study. BioMed Research International. 2016, 8406832 (2016).
- Abu-Ameerh, M. A., et al. Platelet lysate promotes re-epithelialization of persistent epithelial defects: A pilot study. International Ophthalmology. 39 (7), 1483-1490 (2019).
- Geremicca, W., Fonte, C., Vecchio, S. Blood components for topical use in tissue regeneration: evaluation of corneal lesions treated with platelet lysate and considerations on repair mechanisms. Blood Transfusion. 8 (2), 107-112 (2010).
- De Paiva, C. S., et al. Disruption of TGF-β signaling improves ocular surface epithelial disease in experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca. PLoS One. 6 (12), 29017 (2011).
