Summary
I lisati piastrinici rappresentano uno strumento emergente per il trattamento delle malattie della superficie oculare. Qui, proponiamo un metodo per la preparazione, la dispensazione, la conservazione e la caratterizzazione del lisato piastrinico raccolto da donatori di piastrine.
Abstract
Varie malattie della superficie oculare sono trattate con colliri derivati dal sangue. Il loro uso è stato introdotto nella pratica clinica a causa del loro contenuto di metaboliti e fattori di crescita, che promuove la rigenerazione della superficie oculare. I colliri a base di sangue possono essere preparati da diverse fonti (ad esempio, donazione di sangue intero o aferesi piastrinica), nonché con protocolli diversi (ad esempio, diverse diluizioni e cicli di congelamento / scongelamento). Questa variabilità ostacola la standardizzazione dei protocolli clinici e, di conseguenza, la valutazione della loro efficacia clinica. La definizione dettagliata e la condivisione delle procedure metodologiche possono contribuire alla definizione di orientamenti comuni. Negli ultimi anni si sono diffusi i prodotti allogenici come alternativa ai trattamenti autologhi in quanto garantiscono standard di efficacia più elevati; tra questi, i colliri a lisato plasmatico ricco di piastrine (PRP-L) sono preparati con semplici procedure di produzione. Nell'unità di medicina trasfusionale dell'AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italia, il PRP-L è ottenuto dalla donazione di aferesi piastrinica. Questo prodotto viene inizialmente diluito a 0,3 x 10 9 piastrine/ml (a partire da una concentrazione media di 1 x 10 9 piastrine/ml) in0,9% NaCl. Le piastrine diluite vengono congelate/scongelate e, successivamente, centrifugate per eliminare i detriti. Il volume finale viene suddiviso in aliquote da 1,45 ml e conservato a -80 °C. Prima di essere dispensato ai pazienti, i colliri vengono testati per la sterilità. I pazienti possono conservare lisati piastrinici a -15 °C fino a 1 mese. Anche la composizione del fattore di crescita è valutata da aliquote selezionate casualmente e i valori medi sono riportati qui.
Introduction
I prodotti derivati dal sangue sono ampiamente utilizzati nella cura delle ferite1, nella chirurgia maxillo-facciale e ortopedica e per il trattamento di diverse malattie della superficie oculare2 come la malattia dell'occhio secco (DED)3. Nella DED, l'omeostasi del film lacrimale è compromessa come conseguenza del funzionamento anomalo di diversi fattori coinvolti nella produzione lacrimale e nell'integrità della superficie oculare 4,5.
La DED è caratterizzata da eterogeneità nelle cause e nella gravità 6,7,8 e può essere una conseguenza di diversi fattori come l'invecchiamento, il sesso 9, le lenti a contatto, i farmaci topici o sistemici 10 o condizioni preesistenti come la sindrome di Sjögren 10. Nonostante abbia sintomi lievi, la DED colpisce milioni di persone in tutto il mondo, influenzando anche la loro qualità della vita e il sistema sanitario6.
Sono stati riportati molti trattamenti per questa patologia, ma non c'è ancora consenso sulla soluzione più efficace12. Ad oggi, le lacrime artificiali sono la prima linea di terapia volta a ripristinare la composizione acquosa del film lacrimale, sebbene questi sostituti non contengano i principali soluti biologicamente attivi delle lacrime naturali 6,11. I prodotti a base piastrinica sono considerati una valida alternativa12,13 alle lacrime artificiali, sebbene la loro efficacia clinica, le raccomandazioni per l'uso e i metodi di preparazione siano ancora oggetto di dibattito3.
I prodotti a base di sangue condividono con le lacrime una composizione simile in termini di metaboliti14, proteine, lipidi, vitamine, ioni, fattori di crescita (GF), composti antiossidanti 11 e osmolarità (300 mOsm/L)11. Attraverso l'attività sinergica dei loro componenti, promuovono la rigenerazione dell'epitelio corneale, inibiscono il rilascio di citochine infiammatorie e aumentano il numero di cellule caliciformi e l'espressione di mucine nella congiuntiva 2,3.
Finora, l'eterogeneità nei prodotti oftalmici a base di sangue è stata documentata in letteratura; Questi prodotti possono essere classificati in base all'origine dei donatori di sangue, cioè autologhi o allogenici, nonché alla fonte di sangue, cioè sangue periferico, sangue del cordone ombelicale, siero o piastrine.
Sebbene i prodotti autologhi fossero i più diffusi3, quelli allogenici stanno diventando la scelta preferita, poiché garantiscono standard di efficacia e sicurezza più elevati 15, insieme a una significativa riduzione dei costi16,17. Studi precedenti, infatti, hanno dimostrato che i prodotti a base di sangue ottenuti da pazienti con malattie autoimmuni e/o sistemiche possono mostrare qualità e funzionalità alterate 6,16,17. Nonostante i colliri a base sierica siano i più diffusi, i prodotti a base piastrinica si stanno recentemente affermando come una valida alternativa, in quanto possono essere facilmente preparati mantenendo livelli significativi di efficacia 3,11. I prodotti a base piastrinica attualmente disponibili possono essere suddivisi in plasma ricco di piastrine (PRP), lisato plasmatico ricco di piastrine (PRP-L) e plasma ricco di fattori di crescita (PRGF)3.
Tra questi, PRP-L ha il vantaggio di essere un prodotto congelato a lunga conservazione. Il PRP-L può essere preparato da aferesi, buffy-coat, o anche da piastrine in scadenza (PLT)18,19, riducendo preziosamente il loro spreco. Le aliquote possono essere conservate per mesi nei centri trasfusionali a -80 °C o anche a casa dei pazienti a -15 °C per periodi più brevi.
I PRP-L sono altamente arricchiti in GF, che hanno dimostrato di stimolare la rigenerazione della superficie oculare 12,20,21. Tuttavia, ci sono solo pochi studi clinici segnalati in questo settore, e tutti hanno utilizzato fonti autologhe 3,22. PRP-L ha ancora bisogno di ulteriore convalida e caratterizzazione prima che possa essere utilizzato di routine per il trattamento delle malattie della superficie oculare, poiché non esistono linee guida standardizzate per la sua preparazione, dispensazione e conservazione3.
Qui viene condiviso un protocollo dettagliato per la produzione di PRP-L utilizzato presso l'Unità di Medicina Trasfusionale dell'AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italia, e la dispensazione ai pazienti con DED. Miriamo ad aiutare la comunità scientifica a sviluppare metodi standard di preparazione, che possono aumentare l'omogeneità e la coerenza negli studi e negli approcci clinici in tutto il mondo.
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Protocol
I PRP-L utilizzati per la valutazione quantitativa dei fattori di crescita sono stati raccolti nell'ambito di uno studio più ampio sulla caratterizzazione dei prodotti PRP a scopo rigenerativo, condotto presso l'AUSL-IRCCS di Reggio Emilia e approvato dal Comitato Etico Area Vasta Emilia Nord il 10 gennaio 2019 (protocollo numero 2019/0003319). I donatori hanno dato il loro consenso informato secondo la Dichiarazione di Helsinki. Non è stata necessaria alcuna approvazione etica per raccogliere i dati aggregati e anonimi del questionario OSDI (Ocular Surface Disease Index), che viene abitualmente utilizzato dai medici per monitorare i sintomi della sindrome dell'occhio secco. La Figura 1A mostra una struttura del protocollo seguito, mentre le immagini nella Figura 1B illustrano i passaggi principali della procedura.
1. Raccolta di plasma ricco di piastrine (PRP)
- Aferesi PRP
- Per questo protocollo, selezionare i donatori piastrinici secondo le leggi italiane: i donatori piastrinici devono avere 18-65 anni, con parametri normali di pressione ed emocromo e una conta piastrinica non inferiore a 180 x 109 piastrine/L23. I donatori idonei non possono assumere farmaci antiaggreganti piastrinici o anticoagulanti entro 1 settimana prima della donazione.
- Eseguire l'aferesi plasma-piastrinica utilizzando un sistema automatizzato di raccolta del sangue, secondo le istruzioni dei produttori e le leggi nazionali23, per ottenere 1 unità di plasma ricco di piastrine (PRP) monodonatore. Raccogliere PRP in adenina citrato destrosio soluzione A (ACD-A) soluzione anticoagulante.
NOTA: L'aferesi piastrinica viene condotta con una procedura continua; Il tempo di raccolta è compreso tra 40 min e 90 min. La quantità di ACD consegnata ai donatori e il tempo delle procedure dipendono dalle caratteristiche del donatore, ad esempio ematocrito e calibro dell'ago.
- Caratteristiche delle unità PRP
NOTA: Il passaggio successivo viene solitamente eseguito automaticamente dal sistema automatico di raccolta del sangue durante la procedura di aferesi plasma-piastrinica. Si prega di consultare il manuale di istruzioni del produttore.- Risospendere le unità PRP raccolte per aferesi in una quantità adeguata di soluzione conservante con la minima quantità di plasma residuo, necessaria per mantenere il pH > 6,4 durante l'intero tempo di conservazione, ad un volume finale medio di 180 mL netti della soluzione anticoagulante (circa 40 ml).
NOTA: Secondo la legge italiana, i controlli di qualità devono valutare che la conta piastrinica (PLT) sia di almeno 2,0 x 10 11 PLT / unità, mentre i leucociti residui devono essere inferiori a 1 x10 6 cellule / unità. - Conservare il PRP leucodepletato e irradiato per un massimo di 5 giorni a 22 °C ± 2 °C su uno shaker piastrinico prima di un'ulteriore manipolazione23.
- Risospendere le unità PRP raccolte per aferesi in una quantità adeguata di soluzione conservante con la minima quantità di plasma residuo, necessaria per mantenere il pH > 6,4 durante l'intero tempo di conservazione, ad un volume finale medio di 180 mL netti della soluzione anticoagulante (circa 40 ml).
- Diluizione PRP
- Immediatamente prima di iniziare la diluizione del PRP, eseguire un conteggio PLT con un emocitometro utilizzando il campione raccolto dalla sacca principale attraverso una punta perforante.
NOTA: Eseguire le fasi successive della sterilità sotto una cappa a rischio biologico di classe II. Indossare dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi) durante la procedura. - Diluire il PRP con una quantità adeguata di NaCl sterile allo 0,9% fino a una concentrazione finale di 0,32 x 10 9 ± 0,03 x 109 PLT/ml, che simula la concentrazione media di PLT nel sangue periferico.
- Approfittando di un picco penetrante per sacche di sangue, dividere il PRP diluito in sacche di raccolta vuote da 300 ml per raggiungere un volume netto di 190 ml / sacchetto.
- Utilizzare un'aliquota di PRP diluito residuo (di solito 1 ml) per eseguire controlli di qualità che valutino possibili contaminazioni microbiche. Eseguire un test di sterilità seguendo le istruzioni del produttore in un laboratorio di microbiologia (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Utilizzare flaconcini di coltura specifici per emocolture aerobiche, che sono in grado di eseguire la coltura qualitativa e il recupero di microrganismi aerobici (principalmente batteri e lieviti) da campioni di sangue di piccolo volume. - Conservare i sacchetti di PRP diluiti a -80 °C per un massimo di 2 mesi prima dello scongelamento.
- Immediatamente prima di iniziare la diluizione del PRP, eseguire un conteggio PLT con un emocitometro utilizzando il campione raccolto dalla sacca principale attraverso una punta perforante.
2. Preparazione del lisato plasmatico ricco di piastrine (PRP-L)
- Scongelamento
- Prima di iniziare la procedura di scongelamento, assicurarsi che un bagno caldo sia impostato a 37 °C. Metti i sacchetti PRP nel bagno caldo e attendi fino a completo scongelamento.
- Collezione PRP-L
- Centrifugare i sacchetti di PRP a 3000 x g per 30 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: I passaggi successivi devono essere eseguiti in sterilità sotto una cappa a rischio biologico di classe II. - Sfruttando la punta perforante della sacca di trasferimento, collegare la sacca centrifugata con una sacca di trasferimento sterile vuota da 300 ml. Con attenzione, trasferire il surnatante PRP-L, evitando detriti, nella nuova borsa. Quando possibile, utilizzare una pressa per sacchetti.
- Sigillare il tubo di collegamento dell'unità PRP-L con un sigillatore per sacchetti.
- Centrifugare i sacchetti di PRP a 3000 x g per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Aliquota PRP-L
NOTA: Un'unità di partenza contenente 190 mL di PRP (vedere punto 1.3.3.) è sufficiente per riempire due kit di colliri (per i dettagli sui dispositivi medici specifici utilizzati per l'applicazione e la conservazione dei colliri da emocomponenti, vedere la Tabella dei materiali). I kit di colliri devono essere aperti sotto un cappuccio di classe II con i flaconcini interi posizionati sopra la siringa precollegata e la freccia centrale del rubinetto rivolta verso sinistra per escludere il filtro antibatterico.- Raccogliere 30-60 ml di PRP-L con una siringa sterile e collegare la siringa alla connessione Luer/lock sulla linea di riempimento.
- Secondo le istruzioni del produttore, ruotare il rubinetto di mezzo giro per aprire la linea tra la siringa contenente PRP-L e la siringa precollegata. Riempire la siringa precollegata con PRP-L.
- Scollegare la siringa PRP-L, chiudere il cappuccio del tubo della connessione luer/lock e ruotare il rubinetto di arresto nella posizione originale. Utilizzare la siringa del kit collirio per riempire i flaconcini con PRP-L.
- Ripetere la procedura dai passaggi 2.3.1.-2.3.3. fino a riempire tutti i flaconcini dell'applicatore. Assicurarsi che ogni applicatore sia riempito correttamente, quindi sigillarli individualmente con un sigillante per sacchetti.
- Ripetere la procedura con un nuovo kit di collirio.
- Utilizzare una piccola aliquota di PRP-L diluito residuo per valutare la possibile contaminazione microbica (vedere punto 1.3.4.).
NOTA: Se il liquido raggiunge accidentalmente il filtro antibatterico all'estremità della stringa, la siringa di aspirazione può opporre resistenza, ostacolando il riempimento. Per continuare il ciclo di riempimento, sollevare la sezione terminale della corda per circa 5/6 aliquote dal filtro idrofobo antibatterico all'estremità della corda. In questa posizione, utilizzare una nuova siringa sterile (di 30 mL di volume) che è già stata riempita d'aria. Collegare il luer/lock femmina del filtro antibatterico e premere con forza e ripetutamente sullo stantuffo della siringa per rimuovere tutti i residui di emocomponenti e rendere la membrana del filtro antibatterico libera dal liquido. Rimuovere la siringa e riempire i flaconcini rimanenti.
- Archiviazione PRP-L
- Etichettare correttamente ogni applicatore e metterli in un sacchetto di plastica. Etichettare anche il sacchetto di plastica, avendo cura di evidenziare il gruppo sanguigno del donatore.
- Conservare a -80 °C per un massimo di 24 mesi prima dell'assegnazione del paziente, secondo la legge23 e le linee guida24.
3. Dispensa PRP-L
- Eseguire l'assegnazione del paziente preferibilmente abbinando il gruppo sanguigno PRP-L. Fornire i flaconcini dell'applicatore PRP-L utilizzando una scatola frigorifera e assicurarsi che ogni flaconcino dell'applicatore contenga 1,45 ml di PRP-L, che corrisponde a circa 45 gocce. Informare il paziente che i flaconcini dell'applicatore possono essere conservati a casa dei pazienti fino a 1 mese a -15 °C.
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Representative Results
Il razionale per l'uso di colliri derivati dal siero (che è il prodotto a base di sangue più frequentemente utilizzato per il trattamento delle malattie della superficie oculare) risiede nel loro contenuto di GF, che sono quasi completamente derivati dalle piastrine circolanti. Il PRP contiene un numero significativamente più elevato di piastrine (e, di conseguenza, di GF derivate dalle piastrine) rispetto al siero del sangue periferico, compreso tra 0,15 x 10 9-0,45 x 109 PLT / ml. Secondo le leggi italiane, la conta piastrinica nelle unità PRP dovrebbe essere di almeno 0,9 x 10 9-1 x 109 PLT / ml. Pertanto, per ottenere un prodotto che simuli l'efficacia del collirio sierico, il PRP deve essere diluito al contenuto piastrinico fisiologico prima della preparazione del lisato.
Tuttavia, poiché la riparazione dei tessuti è guidata principalmente da GF derivati dalle piastrine, il conteggio PLT da solo potrebbe essere fuorviante per una terapia efficace delle malattie della superficie oculare. Nella DED, che è la malattia dell'occhio più comunemente trattata con colliri derivati dal sangue, la produzione di film lacrimale e l'omeostasi sono compromesse. I prodotti a base piastrinica per il trattamento della DED, quindi, dovrebbero anche imitare il contenuto fisiologico delle lacrime.
Identificare il PRP-L più adatto per il trattamento delle malattie della superficie oculare, descritto nella fase 1.3.2. del presente protocollo, abbiamo valutato preliminarmente diverse diluizioni di PRP, in base al loro contenuto di PLT (tra 0,7 x 10 9 / mL e 0,3 x 109 / mL), e alcuni GF rappresentativi di quelli che sono noti per essere coinvolti nella riparazione del tessuto oculare12,20,21.
La conta piastrinica è stata eseguita con un emocitometro, mentre i GF sono stati valutati mediante un saggio di quantificazione delle proteine multiplex. Il test è stato eseguito come descritto in precedenza25 secondo le istruzioni del produttore. I GF mostrati in questo manoscritto sono stati selezionati per la quantificazione dopo uno screening preliminare di 36 GF e GFR eseguiti su lisato di PRP con un array proteico semi-quantitativo. La quantificazione di Luminex è stata eseguita su 3 dei 36 GF sottoposti a screening: EGF e PDGF (che si sono rivelati i più abbondanti nei nostri lisati PRP) e TGFβ-1,2,3 isoforme (per le quali il contenuto è importante per il trattamento della superficie oculare21). Il contenuto di EGF e PDGF è stato misurato in quanto possono influenzare l'efficacia del PRP-L22, mentre le isoforme del TGFβ sono state selezionate per il loro ruolo noto nella regolazione della segnalazione immunitaria21.
Poiché gli array proteici fanno parte di un altro studio in vitro sulla caratterizzazione di diversi PRP26, tali dati non sono presentati in questo manoscritto.
Abbiamo valutato quantitativamente EGF, PDGF e TGFβ in lisati di PRP da due diversi donatori (D1 e D2), precedentemente diluiti tra 0,7 x 10 9-0,3 x 10 9 PLT / mL in0,9% NaCl. La figura 2 mostra i risultati della diluizione 0,3 x 109 PLT/ml, che si è rivelata molto simile alla composizione lacrimale.
La diluizione 0,3 x 109 PLT/mL è stata selezionata sulla base dei dati della letteratura sulla composizione lacrimale. I valori del FEG sono risultati piuttosto bassi rispetto al valore medio lacrimale, ma ancora nell'intervallo di normalità27. Anche il PDGF, pur essendo molto variabile tra i due donatori considerati, è sempre stato paragonabile alla concentrazione riscontrata nelle normali lacrime20. Infine, TGFβ-1 è risultato essere l'isoforma più abbondante in PRP-L, simile alle lacrime21.
Una volta identificata la diluizione PLT più adatta per preparare l'aferesi PRP-L, l'Unità di Medicina Trasfusionale ha iniziato a distribuire questi prodotti a pazienti affetti da disturbi della superficie oculare nel 2015. Gli oftalmologi raccoglievano regolarmente i questionari OSDI per monitorare i sintomi della DED; il test OSDI valuta le misure di qualità della vita, come la percezione dell'irritazione oculare e come influisce sul funzionamento correlato alla visione. Il questionario, creato dall'Outcomes Research Group di Allergan Inc. nel 1995 e ora accettato come valido strumento per monitorare la DED, viene sottoposto ai pazienti e analizzato come precedentemente descritto28,29.
Qui, mostriamo i risultati aggregati dei test OSDI dei pazienti DED trattati tra gennaio 2020 e gennaio 2021 (n = 27). Dopo una terapia di 6 mesi con PRP-L, i punteggi OSDI sono diminuiti da 56 ± 21 a 45 ± 21, indicando un miglioramento della qualità della vita dei pazienti (Figura 3).
Nonostante questi dati siano ancora nell'intervallo grave e non relativi agli esiti clinici di efficacia, suggeriscono che i pazienti con DED considerano PRP-L un prodotto utile che migliora il disagio oculare; Questo aspetto dovrebbe essere ulteriormente indagato in studi clinici prospettici volti a valutarne l'efficacia nel trattamento delle patologie della superficie oculare.
Nella tabella 1, riportiamo un confronto dell'attuale metodo di produzione con un altro metodo per la preparazione di PRP-L allogenico per collirio30 e per altri scopi22. Per quanto ne sappiamo, il protocollo30 di Zhang e il protocollo attuale sono gli unici metodi pubblicati per produrre PRP-L per la superficie oculare. In entrambi, PRP-L è ottenuto dall'aferesi; Le differenze tra i due protocolli, principalmente relative al numero di cicli di congelamento e disgelo e alle fasi di centrifugazione, dovrebbero essere confrontate al fine di migliorare la produzione di PRP-L. Tuttavia, queste differenze metodologiche non si sono dimostrate dannose per la capacità rigenerativa del PRP-L testato su altri tessuti22.
Figura 1: Fasi principali del protocollo per la preparazione del PRP-L. (A) Schema del protocollo, dalla raccolta del PRP alla preparazione e dispensazione del PRP-L. (B) Immagini rappresentative delle fasi principali dei protocolli. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Quantificazione Luminex dei fattori di crescita derivati dalle piastrine per la diluizione 0,3 x 109/mL del PRP-L. (A) fattore di crescita epidermico (EGF); b) fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF); (C) fattore di crescita trasformante-beta isoforma 1 (TGFβ1); (D) fattore di crescita trasformante-beta isoforma 2 (TGFβ2); (E) fattore di crescita trasformante-beta isoforma 3 (TGFβ3). I valori sono espressi come pg/mL, media ± deviazione standard di tre misurazioni indipendenti. D1 e D2 sono due diversi donatori di piastrine. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Punteggi OSDI aggregati dei pazienti DED trattati con PRP-L tra gennaio 2020 e gennaio 2021 presso l'Unità Operativa di Oftalmologia dell'AUSL-IRCCS di Reggio Emilia. N = 27 pazienti. I risultati aggregati del punteggio OSDI sono rappresentati come media ± errore standard, il valore p è stato calcolato con un t-test accoppiato con software di analisi dei dati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Questo articolo | PRP-L per l'occhio (studio in vitro )29 | PRP-L per altri scopi21 | |
| Fonte | Aferesi dei PLT | Aferesi dei PLT | Aferesi e sangue intero |
| Cicli di congelamento e scongelamento | 1 (a -80 °C) | 2 (a -80 °C) | 1-3 (a -20 °C e -80 °C) |
| Temperatura di conservazione | a -80 °C | a -80 °C | a -20 °C e -80 °C |
| Velocità di centrifugazione prima dello stoccaggio | 3000 x g/30 min | 3500 x g/30 min | 400-3000 x g/6 min -30 min |
| Filtrazione prima dello stoccaggio | No | Sì | No/Sì |
Tabella 1: Confronto dei protocolli per preparare PRP-L allogenico da prodotti a base piastrinica raccolti per aferesi.
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Discussion
Negli ultimi anni è aumentato l'uso clinico di prodotti a base piastrinica per le patologie della superficie oculare, ma la loro diffusione è ostacolata dalla mancanza di robustezza scientifica. Ciò è causato principalmente dall'ampia eterogeneità delle fonti dei donatori e dei protocolli di preparazione, che spesso non sono completamente divulgati o non specificamente progettati per lo scopo per il quale sono dispensati. In particolare, mancano ancora informazioni sui prodotti a base piastrinica raccolti per aferesi. Pertanto, lo scopo del presente lavoro è stato quello di descrivere il trattamento passo-passo dei lisati plasmatici ricchi di piastrine (PRP-L) ottenuti mediante aferesi per il trattamento della DED.
Il PRP-L è una fonte ottimale per la produzione di colliri poiché contiene più GF rispetto agli altri prodotti a base di sangue22 e, rispetto al siero o al PRP, la sua produzione o conservazione sono poco costose e semplici. Per ottenere PRP-L, le piastrine sono sottoposte a lisi (di solito attraverso uno o più cicli di congelamento e scongelamento) per rilasciare il loro contenuto. Questo processo garantisce una soluzione arricchita in molecole attive che stimolano la rigenerazione dei tessuti22,26. Un numero crescente di malattie è stato trattato con PRP-L 22, ma l'indicazione per l'uso in oftalmologia è ancora debole a causa dei bassi criteri di standardizzazione nella raccolta piastrinica e nella produzione di PRP-L 3,22.
I prodotti allogenici a base piastrinica dovrebbero essere preferiti in quanto sono più standardizzabili di quelli autologhi, sia in termini di caratteristiche del donatore che di metodo di preparazione. Lo stato di salute del paziente può influire sulla qualità del prodotto 6,16,17, mentre i kit interni per raccogliere piastrine autologhe dal sangue intero quando i servizi trasfusionali non sono direttamente disponibili non soddisfano la qualità standard richiesta nella medicina trasfusionale31.
Per quanto ne sappiamo, non ci sono studi clinici che caratterizzano l'uso del PRP-L allogenico in oftalmologia 3, mentre ci sono poche segnalazioni riguardanti colliri autologhi PRP-L3 e solo uno studio che utilizza PRP-L allogenico ottenuto dal sangue del cordone ombelicale per il trattamento di pazienti con malattie della superficie oculare32. Sebbene il PRP-L allogenico sia elencato nelle linee guida cliniche24 e il suo utilizzo sia stato proposto 3,30, vi è ancora una mancanza di prove sulla sua efficacia rispetto ad altri trattamenti e ad altri prodotti a base di sangue (ad esempio, siero). Qui, il protocollo presentato mira ad aiutare la comunità scientifica a sviluppare metodi comuni di produzione e a far luce sulle differenze metodologiche.
Qui, abbiamo descritto la produzione di PRP-L a partire dal PRP allogenico raccolto per aferesi. I prodotti allogenici a base piastrinica per ottenere lisati piastrinici possono anche essere raccolti da buffy-coat (BC), ed entrambe le fonti sono state ugualmente riportate31. I BC sono ottenuti da donatori aggregati (di solito quattro o cinque), riducendo così al minimo le differenze interindividuali. Al contrario, il pooling aumenta il rischio di trasmettere agenti infettivi o prioni o di stimolare una risposta allogenica31,33. L'aferesi è una procedura complessa e invasiva e solo una minoranza di donatori è ammissibile o conforme ad essa34. Tuttavia, i prodotti a base piastrinica ottenuti per aferesi sono esenti da altre cellule residue circolanti e contengono una quantità maggiore di PLT35. Per questi motivi, il lavoro attuale è focalizzato sullo sviluppo di studi clinici per confrontare PRP-L da queste due diverse fonti.
In questo protocollo, la concentrazione iniziale di PLT nelle unità PRP raccolte mediante aferesi era in media 1 x 109/ml, che è coerente con le concentrazioni riportate per altri prodotti a base piastrinica22. In questo metodo, i PLT vengono successivamente diluiti con soluzione di NaCl allo 0,9% a 0,3 x 109 / ml. Altri protocolli riportano l'uso del plasma per la diluizione22.
Pochi studi hanno riportato l'uso di PRP-L in oftalmologia; in questi casi, colliri autologhi sono stati preparati a concentrazioni di PLT comprese tra 0,5 x 10 9 / mL-1 x 109 / mL36,37,38. Come discusso in precedenza, i marcatori di standardizzazione sono auspicabili e aiuterebbero anche a determinare la corretta diluizione. Qui, ad esempio, riportiamo la concentrazione di alcuni GF cardine nel PRP-L. Il contenuto di EGF e PDGF influenza l'efficacia del PRP-L22, mentre le isoforme del TGFβ sono coinvolte nella regolazione della segnalazione immunitaria 21,39 e la loro concentrazione è finemente regolata. Pertanto, la concentrazione di TGFβ nei colliri a base piastrinica può influenzare non solo l'efficacia, ma anche suscitare potenziali effetti dannosi39; Pertanto, dovrebbe essere attentamente studiato prima di definire la corretta diluizione. Tuttavia, la diluizione selezionata - 0,3 x 109 PLT / ml - era basata sul contenuto di GF in lacrime21,25. Zhang et al. hanno precedentemente confrontato colliri a base di siero, sia autologhi che allogenici, e lisati a base piastrinica per il loro contenuto in GF e per la loro capacità di promuovere la rigenerazione delle cellule corneali in vitro30. Lo studio ha mostrato come questi prodotti abbiano caratteristiche comparabili, con PRP-L con una maggiore concentrazione di EGF ma una fibronectina inferiore. Nel loro protocollo, il processo di congelamento/scongelamento è stato ripetuto due volte, la centrifuga eseguita a 3500 x g per 30 minuti e il lisato piastrinico conservato a -80 °C30.
Il congelamento e lo scongelamento sono infatti una fase critica; la maggior parte dei protocolli (incluso questo) sono stati sviluppati con congelamento a -80 °C e scongelamento a 37 °C, ma il congelamento è stato riportato anche a -24 °C, -196 °C e -150 °C 22,33 Anche il numero di cicli di congelamento/disgelo eseguiti è variabile, da 1 a 5 22,33. Un numero limitato di studi ha anche riportato sonicazione o trattamento solvente/detergente per ottenere lisati piastrinici22,33. Altre variabili metodologiche precedentemente riportate nella preparazione del PRP-L riguardano la fase di centrifugazione - tra 300 x g e 10000 x g, da 2 min a 60 min - e la conservazione a lungo termine, che, nella maggior parte dei casi, è a -80 °C, sebbene prodotti simili siano stati anche immagazzinati direttamente a -20 °C22. Le condizioni di conservazione, in particolare, dovrebbero essere attentamente monitorate poiché potrebbero influire sulla disponibilità e sull'attività dei GF contenuti nei lisati. In questo contesto altamente eterogeneo, dovrebbero essere urgentemente valutati i controlli di qualità e gli studi clinici che prendono in considerazione il rilascio di fattori biogeni e le differenze nell'effetto terapeutico.
Infine, qui mostriamo come questo metodo sia stato valutato in modo significativo con un risultato positivo da un'analisi aggregata di pazienti con malattia dell'occhio secco trattati con PRP-L per 6 mesi (questionario OSDI3). Sebbene promettente, l'OSDI da solo non è sufficiente a determinare l'efficacia del PRP-L nel trattamento della DED e di altre malattie della superficie oculare, e sono giustificati studi clinici sull'uso del PRP-L allogenico. Inoltre, le possibili differenze di composizione del prodotto dovute a fasi metodologiche alternative (ad esempio, congelamento e disgelo, centrifugazione, conservazione) dovrebbero essere confrontate al fine di ottimizzare la procedura metodologica.
In conclusione, l'elevata eterogeneità delle fonti di sangue e dei protocolli ostacola ancora la traduzione definitiva dei prodotti a base di sangue nel trattamento clinico delle malattie della superficie oculare. Sebbene il PRP-L sia un prodotto emergente con alcune caratteristiche vantaggiose, sono necessari ulteriori studi per convalidarne l'uso e sviluppare linee guida comuni. La condivisione e il dettaglio del protocollo di preparazione può espandere l'usabilità e far luce sui passaggi critici.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare "Casa del Dono di Reggio Emilia" per aver fornito concentrati piastrinici derivati da donatori.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CompoSeal Mobilea II | Fresenius Kabi, Germany | bag sealer | |
| HeraSafe hood | Heraeus Instruments, Germany | Class II biohazard hood | |
| MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System | Haemonetics, Italy | automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components | |
| Platelet shaker, PF396i | Helmer, USA | Platelet shaker | |
| Raycell X-ray Blood Irradiator | MDS Nordion, Canada | X-ray Blood Irradiator | |
| ROTIXA 50RS | Hettich Zentrifugen, Germany | High speed entrifuge | |
| Sysmex XS-1000i | Sysmex Europe GMBH, Germany | haemocytometer for platelet count | |
| Warm bath, WB-M15 | Falc Instruments, Italy | Warm bath | |
| Materials | |||
| ACD-A anticoagulant solution A | Fenwal Inc., USA | DIN 00788139 | anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml) |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | BD 442020 | Sterility assay |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | 442020 | At least 2 vials for sterility assay |
| BD Luer Lok Syringe | BD Plastipack, USA | 300865 | At least 4 sterile syringes (50 ml) |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 1 | BioRad Laboratories, USA | 171AC500M | Standard panel for PDGF isoforms assessment |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 2 | BioRad Laboratories, USA | 171AC600M | Standard panel for EGF assessment |
| Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad Laboratories, USA | Magpix | This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads. |
| Bio-Plex Pro TGF-b Assay | BioRad Laboratories, USA | 10024984 | Set and standards for TGFb isoforms assessment |
| BioRet | ARIES s.r.l., Italy | A2DH0020 | At least 4 piercing spike for blood bags |
| Blood collection tube | BD Vacutainer, USA | 367835 | 1 tube, necessary to perform platelet counts |
| Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents | Biomed Device s.r.l., Italy | COLC50 | Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected |
| Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC511 | Set for PDGF isoforms assessment |
| Human Cancer2 EGF Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC603M | Set for EGF assessment |
| NaCl 0.9% sterile solution | Baxter S.p.A., Italy | B05BB01 | 1000 ml |
| OSDI Questionnaire | Allergan Inc., USA | OSDI | Ocular Surface Disease Index Questionnaire |
| Piercing spike | BioRet ARIES s.r.l., Italy | BS051004 | Spike |
| Platelet Additive Solution A+ T-PAS+ | TERUMO BCT Inc., Italy | 40842 | preservative solution for platelet concentrates (1000 ml) |
| Software Excel | Microsoft, USA | Excel | Data analysis software |
| Teruflex Transfer bag 1000 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*T100BM | 1 for PRP dilution |
| Teruflex Transfer bag 300 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*030CM | At least 6 for each PRP unit collected |
References
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