Summary
血小板溶解物は、眼の表面疾患の治療のための新たなツールを表しています。ここでは、血小板ドナーから採取した血小板溶解液の調製、分注、保存、および特性評価の方法を提案する。
Abstract
さまざまな眼の表面疾患は、血液由来の点眼薬で治療されます。それらの使用は、眼の表面再生を促進する代謝産物および成長因子含有量のために臨床診療において導入されている。血液ベースの点眼薬は、さまざまな供給源(すなわち、全血または血小板アフェレーシスの寄付)から、および異なるプロトコル(例えば、異なる希釈および凍結/解凍サイクル)で調製することができる。この変動性は、臨床プロトコルの標準化を妨げ、その結果、臨床効果の評価を妨げます。方法論的手順を詳述し、共有することは、共通のガイドラインの定義に貢献する可能性がある。過去数年間、同種異系製品は、より高い有効性基準を保証するため、自家治療の代替として普及しています。その中で、多血小板血漿溶解物(PRP-L)点眼剤は簡単な製造手順で調製されます。イタリアのAUSL-IRCCSディレッジョエミリアの輸血医学ユニットでは、PRP-Lは血小板アフェレーシスの提供から得られます。この製品は、最初に0.9%NaClで0.3 x 109 血小板/ mL(1 x 109 血小板/ mLの平均濃度から開始)に希釈されます。希釈された血小板は凍結/解凍され、その後、破片を除去するために遠心分離されます。最終容量を1.45 mLアリコートに分割し、-80°Cで保存します。 患者に調剤される前に、点眼薬は無菌性についてテストされます。患者は血小板溶解物を-15°Cで最大1か月間保存できます。成長因子組成も無作為に選択されたアリコートから評価され、平均値がここで報告されます。
Introduction
血液由来製品は、創傷ケア1、顎顔面および整形外科手術、およびドライアイ疾患(DED)3などのさまざまな眼表面疾患2の治療に広く使用されています。DEDでは、涙液膜の恒常性は、涙液の生成および眼の表面の完全性に関与するさまざまな要因の異常な機能の結果として損なわれます4,5。
DEDは、原因と重症度の不均一性を特徴とします6,7,8 そして、老化、性別9、コンタクトレンズ、局所または全身薬10、またはシェーグレン症候群10のような既存の状態などのさまざまな要因の結果である可能性があります。軽度の症状にもかかわらず、DEDは世界中の何百万人もの人々に影響を及ぼし、生活の質と医療システムにも影響を及ぼします6。
この病状に対して多くの治療法が報告されていますが、最も効果的な解決策についてはまだコンセンサスがありません12。今日まで、人工涙液は涙液膜の水性組成物を回復することを目的とした治療の第一線であるが、これらの代替物は天然涙液の主要な生物学的に活性な溶質を含まない6,11。血小板ベースの製品は、人工涙液の有効な代替品12,13と考えられていますが、その臨床効果、使用の推奨事項、および調製方法はまだ議論の問題です3。
血液ベースの製品は、代謝物14、タンパク質、脂質、ビタミン、イオン、成長因子(GF)、抗酸化化合物11、および浸透圧(300 mOsm / L)11の点で同様の組成を涙と共有します。それらの成分の相乗的活性を通して、それらは角膜上皮の再生を促進し、炎症性サイトカインの放出を阻害し、そして結膜における杯細胞の数およびムチンの発現を増加させる2,3。
これまでのところ、眼科用血液ベースの製品の不均一性が文献に記録されています。これらの製品は、献血者の起源、すなわち自家または同種、ならびに血液源、すなわち末梢血、臍帯血、血清、または血小板に従って分類することができる。
自家製品は最も普及していましたが3、同種異系製品は、より高い有効性と安全基準15を保証し、コストの大幅な削減を保証するため、現在、好ましい選択肢になりつつあります16,17。実際、以前の研究では、自己免疫疾患および/または全身性疾患の患者から得られた血液ベースの製品が、品質および機能の変化を示す可能性があることが証明されています6,16,17。血清ベースの点眼薬が最も普及しているという事実にもかかわらず、血小板ベースの製品は、有意なレベルの有効性を維持しながら容易に調製できるため、最近有効な代替品として確認されつつあります3,11。現在入手可能な血小板ベースの製品は、多血小板血漿(PRP)、多血小板血漿溶解物(PRP-L)、および成長因子に富む血漿(PRGF)に分けることができます3。
その中でも、PRP-Lは長寿命の冷凍品であるという利点があります。PRP-Lは、アフェレーシス、バフィーコート、さらには期限切れの血小板(PLT)18,19から調製することができ、無駄を大幅に削減します。アリコートは、-80°Cの輸血センターで数ヶ月間、または-15°Cの患者の自宅で短期間保管することができます。
PRP-LはGFが非常に豊富であり、眼の表面再生を刺激することが証明されています12,20,21。それにもかかわらず、この分野で報告された臨床研究はごくわずかであり、それらのすべてが自家源を使用していました3,22。PRP-Lは、その調製、調剤、および保管に関する標準化されたガイドラインがないため、眼表面疾患の治療に日常的に使用する前に、さらなる検証と特性評価が必要です3。
ここでは、イタリアのAUSL-IRCCSディレッジョエミリアの輸血医学ユニットで使用されるPRP-Lの製造、およびDED患者への調剤に関する詳細なプロトコルが共有されています。私たちは、科学界が標準的な調製方法を開発するのを支援することを目指しており、これにより、世界的な研究や臨床アプローチにおける均質性と一貫性が向上する可能性があります。
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Protocol
成長因子の定量的評価に使用されるPRP-Lは、AUSL-IRCCSディレッジョエミリアで実施され、2019年1月10日にエリアヴァスタエミリアノルド倫理委員会によって承認された、再生目的のPRP製品の特性評価に関するより広範な研究内で収集されました(プロトコル番号2019/0003319)。ドナーは、ヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントを行いました。ドライアイ症候群の症状を監視するために臨床医によって日常的に使用されている眼表面疾患指数(OSDI)質問票の集計された匿名データを収集するために倫理的承認は必要ありませんでした。図 1A は、従ったプロトコルの概要を示し、 図1B の写真は、手順の主なステップを示しています。
1.多血小板血漿(PRP)収集
- PRPアフェレーシス
- このプロトコルでは、イタリアの法律に従って血小板ドナーを選択します:血小板ドナーは18〜65歳で、正常圧と血球数のパラメーターと血小板数が180 x 109 血小板/ L23以上である必要があります。適格なドナーは、寄付前1週間以内に抗血小板薬または抗凝固薬を服用することはできません。
- 製造業者の指示および国内法23に従って、自動採血システムを用いて血漿血小板アフェレーシスを行い、1単位の単一ドナー多血小板血漿(PRP)を得た。アデニンクエン酸デキストロース溶液A(ACD-A)抗凝固剤溶液でPRPを収集します。
注:血小板アフェレーシスは連続的な手順で行われます。収集時間は40分から90分の範囲です。ドナーに送達されるACDの量と手順の時間は、ドナーの特性、例えば、ヘマトクリット値および針ゲージに依存する。
- PRPユニットの特性
注:次のステップは通常、血漿血小板アフェレーシス手順中に自動採血システムによって自動的に実行されます。メーカーの取扱説明書をご確認ください。- アフェレーシスによって収集されたPRPユニットを、保存時間全体でpH>6.4を維持するために必要な最小量の残留血漿を含む適切な量の保存液に再懸濁し、抗凝固剤溶液の正味平均最終容量180 mL(約40 mL)まで再懸濁します。.
注:イタリアの法律によると、品質管理は血小板(PLT)数が少なくとも2.0 x 10 11 PLT /ユニットであり、残留白血球が1 x10 6 細胞/ユニット未満であることを評価する必要があります。 - ロイコデプレットし、照射したPRPを血小板振盪機で22°C±2°Cで最大5日間保存してから、さらに操作します23。
- アフェレーシスによって収集されたPRPユニットを、保存時間全体でpH>6.4を維持するために必要な最小量の残留血漿を含む適切な量の保存液に再懸濁し、抗凝固剤溶液の正味平均最終容量180 mL(約40 mL)まで再懸濁します。.
- PRP希釈
- PRP希釈を開始する直前に、メインバッグからピアススパイクを通して採取したサンプルを使用して、血球計算盤でPLTカウントを実行します。
注意: クラスIIバイオハザードフードの下で無菌状態で次のステップを実行します。手順中は、個人用保護具(白衣、手袋、ゴーグル)を着用してください。 - PRPを適切な量の滅菌0.9%NaClで最終濃度0.32 x 10 9 ± 0.03 x10 9 PLT / mLに希釈し、末梢血中の平均PLT濃度をシミュレートします。
- 血液バッグのピアススパイクを利用して、希釈したPRPを300 mLの空の収集バッグに分割して、正味容量190 mL /バッグに到達します。
- 残留希釈PRP(通常1 mL)のアリコートを使用して、微生物汚染の可能性を評価する品質管理を実行します。微生物学研究所で製造元の指示に従って無菌アッセイを実行します(材料表を参照)。
注:少量の血液検体から好気性微生物(主に細菌と酵母)の定性的培養と回収を行うことができる好気性血液培養に固有の培養バイアルを使用してください。 - 解凍する前に、希釈したPRPバッグを-80°Cで最大2か月間保管してください。
- PRP希釈を開始する直前に、メインバッグからピアススパイクを通して採取したサンプルを使用して、血球計算盤でPLTカウントを実行します。
2.多血小板血漿溶解液(PRP-L)製剤
- 解凍
- 解凍手順を開始する前に、温浴が37°Cに設定されていることを確認してください。 PRPバッグを温かいお風呂に入れ、完全に解凍するまで待ちます。
- PRP-L コレクション
- PRPバッグを3000 x g で室温で30分間遠心分離します。
注意: 次のステップは、クラスIIバイオハザードフードの下で無菌状態で実行する必要があります。 - トランスファーバッグのピアススパイクを利用して、遠心分離バッグを空の滅菌300mLトランスファーバッグに接続します。破片を避けながら、PRP-L上清を慎重に新しいバッグに移します。可能であれば、バッグプレスを使用してください。
- PRP-Lユニットの接続チューブをバッグシーラーでシールします。
- PRPバッグを3000 x g で室温で30分間遠心分離します。
- PRP-L アリコート
注:190 mL PRPを含む始動ユニット(ステップ1.3.3を参照)は、2つの点眼キットを充填するのに十分です(血液成分からの点眼剤の適用と保存に使用される特定の医療機器の詳細については、 材料の表を参照してください)。点眼薬キットは、事前に接続されたシリンジの上にストリングバイアル全体を配置し、抗菌フィルターを除外するために活栓の中央の矢印を左に向けて、クラスIIフードの下で開く必要があります。- 滅菌シリンジで30〜60mLのPRP-Lを収集し、シリンジを充填ラインのルアー/ロック接続にリンクします。
- 製造元の指示に従って、活栓を半回転させて、PRP-L含有シリンジと事前に接続されたシリンジの間のラインを開きます。事前に接続されたシリンジにPRP-Lを充填します。
- PRP-Lシリンジを外し、ルアー/ロック接続のチューブキャップを閉じて、活栓を元の位置に回転させます。点眼キットシリンジを使用して、バイアルにPRP-Lを充填します。
- 手順 2.3.1.-2.3.3 の手順を繰り返します。すべてのアプリケーターバイアルが満たされるまで。各アプリケーターが適切に充填されていることを確認してから、バッグシーラーで個別に密封します。
- 新しい点眼キットで手順を繰り返します。
- 微生物汚染の可能性を評価するために、残留希釈PRP-Lの少量のアリコートを使用してください(ステップ1.3.4を参照)。
注意: 液体が誤ってストリングの端にある抗菌フィルターに到達した場合、吸引シリンジが抵抗に反対し、充填を妨げる可能性があります。充填サイクルを続けるには、ストリングの端にある抗菌疎水性フィルターからストリングの端部を約5/6アリコート持ち上げます。この位置で、すでに空気で満たされている新しい滅菌注射器(30 mL容量)を使用します。抗菌フィルターのメスルアー/ロックを接続し、シリンジのプランジャーを強く繰り返し押して、血液成分の残留物をすべて取り除き、抗菌フィルターの膜に液体がないようにします。シリンジを取り外し、残りのバイアルを満たします。
- PRP-L ストレージ
- 各アプリケーターに適切なラベルを付け、ビニール袋に入れます。ドナーの血液型を強調するように注意しながら、ビニール袋にもラベルを付けます。
- イタリアの法律23 およびガイドライン24に従って、患者の割り当て前に最大24か月間-80°Cで保管してください。
3. PRP-Lディスペンセーション
- 好ましくはPRP-L血液型を一致させることによって患者割り当てを行う。クールボックスを使用してPRP-Lアプリケーターバイアルを配送し、各アプリケーターバイアルに約45滴に相当する1.45mLのPRP-Lが含まれていることを確認します。アプリケーターバイアルは、-15°Cで最大1か月間患者の自宅で保管できることを患者に指示します。
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Representative Results
血清由来の点眼薬(眼表面疾患の治療に最も頻繁に使用される血液ベースの製品)を使用する理論的根拠は、循環血小板にほぼ完全に由来するGFの含有量にあります。PRPには、末梢血血清と比較して有意に多くの血小板(およびその結果として血小板由来GF)が含まれており、0.15 x 10 9-0.45 x10 9 PLT / mLの範囲です。.イタリアの法律によると、PRP単位の血小板数は少なくとも0.9 x 10 9-1x 10 9 PLT / mLである必要があります。したがって、血清点眼薬の有効性をシミュレートする製品を得るには、ライセート調製前にPRPを生理的血小板含有量に希釈する必要があります。
それにもかかわらず、組織修復は主に血小板由来GFによって引き起こされるため、PLTカウントだけでは眼表面疾患の効果的な治療に誤解を招く可能性があります。血液由来の点眼薬で最も一般的に治療される眼疾患であるDEDでは、涙液膜の生成と恒常性が損なわれます。したがって、DEDの治療のための血小板ベースの製品も、涙の生理学的含有量を模倣する必要があります。
眼表面疾患を治療するのに最も適したPRP-Lを同定するために、ステップ1.3.2に記載する。本プロトコルのうち、PLT含有量(0.7 x 10 9/mLから0.3 x 109/mLの間)、および眼組織修復に関与することが知られているGFからのいくつかの代表的なGFに従って、さまざまなPRP希釈を事前に評価しました12,20,21。
血小板数は血球計算盤で行い、GFはマルチプレックスタンパク質定量アッセイによって評価しました。アッセイは、製造業者の説明書に従って前述の25 のように実施した。この原稿に示されているGFは、半定量的タンパク質アレイを用いてPRPライセートで実施された36のGFおよびGFRの予備スクリーニングの後に定量のために選択されました。ルミネックス定量は、スクリーニングされた36のGFのうち3つ、EGFとPDGF(PRP溶解物の中で最も豊富であることが判明)およびTGFβ-1,2,3アイソフォーム(眼の表面治療に含有量が重要であることが判明)で実施されました21。EGFおよびPDGF含量はPRP-L22の有効性に影響を与える可能性があるため測定され、TGFβアイソフォームは免疫シグナル伝達制御における既知の役割のために選択された21。
タンパク質アレイは、異なるPRP26の特性評価に関する別のin vitro研究の一部であるため、これらのデータはこの原稿には提示されていません。
2つの異なるドナー(D1とD2)からのPRPライセート中のEGF、PDGF、およびTGFβを定量的に評価し、0.9%NaClで0.7 x 10 9-0.3 x10 9 PLT/mLに希釈しました。図2は、0.3 x 109 PLT / mL希釈の結果を示しており、これは涙液組成に最も類似していることが判明しました。
0.3 x 109 PLT/mL希釈液は、涙液組成に関する文献データに基づいて選択されました。EGF値は平均涙値と比較してかなり低いが、それでも正規性27の範囲にあることがわかった。PDGFでさえ、考慮された2人のドナーの間で非常に変動しているにもかかわらず、通常の涙液に見られる濃度に常に匹敵した20。最後に、TGFβ-1は、涙21と同様に、PRP-Lの中で最も豊富なアイソフォームであることがわかりました。
アフェレーシスPRP-Lを調製するための最適なPLT希釈液が特定されると、輸血医学ユニットは2015年に眼表面障害の影響を受けた患者にこれらの製品の配布を開始しました。眼科医は、DEDの症状を監視するためにOSDIアンケートを定期的に収集しました。OSDIテストは、眼の刺激の知覚やそれが視覚に関連する機能にどのように影響するかなど、生活の質の測定値を評価します。1995年にAllergan Inc.のアウトカム研究グループによって作成され、現在DEDを監視するための有効な手段として受け入れられている質問票は、患者に提出され、前述のように分析されます28,29。
ここでは、2020年1月から2021年1月の間に治療されたDED患者のOSDI検査の集計結果を示します(n=27)。PRP-Lによる6か月の治療後、OSDIスコアは21±56から21±45に減少し、患者の生活の質の改善を示しています(図3)。
これらのデータはまだ重篤な範囲にあり、有効性の臨床転帰とは関係がないにもかかわらず、DED患者はPRP-Lを眼の不快感を改善する有用な製品と見なしていることを示唆しています。この側面は、眼の表面疾患の治療におけるその有効性を評価することを目的とした前向き臨床試験でさらに調査する必要があります。.
表1において、本発明者らは、本製造方法と、点眼剤30および他の目的のための同種異系PRP-Lを調製するための別の方法との比較を報告する22。我々の知る限り、Zhangの30プロトコルと現在のプロトコルは、眼の表面用のPRP-Lを製造するための唯一の公開された方法です。どちらにおいても、PRP-Lはアフェレーシスから得られる。PRP-Lの生産を改善するために、主に凍結融解サイクルの数と遠心分離ステップに関連する2つのプロトコルの違いを比較する必要があります。それにもかかわらず、これらの方法論的差異は、他の組織で試験されたPRP-Lの再生能力に有害であることが証明されていない22。
図1:PRP-Lの調製のためのプロトコルの主なステップ 。 (A)PRP収集からPRP-L調製および分配までのプロトコルのスキーム。(B)プロトコルの主なステップの代表的な写真。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PRP-Lの0.3 x 109 / mL希釈のための血小板由来成長因子のルミネックス定量。 (A)上皮成長因子(EGF);(b)血小板由来増殖因子(PDGF);(c)トランスフォーミング増殖因子-βアイソフォーム1(TGFβ1);(d)トランスフォーミング増殖因子ベータアイソフォーム2(TGFβ2);(e)トランスフォーミング増殖因子-βアイソフォーム3(TGFβ3)。値はpg/mL、3つの独立した測定値の平均±標準偏差で表されます。D1とD2は2つの異なる血小板ドナーです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:AUSL-IRCCSディレッジョエミリアの眼科ユニットで2020年1月から2021年1月の間にPRP-Lで治療されたDED患者のOSDIスコアを集計します。 N = 27人の患者。OSDIスコア集計結果は平均値±標準誤差として表され、p値はデータ解析ソフトウェアを用いた対応のあるt検定で算出した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| この記事 | 眼に対するPRP-L(インビトロ 試験)29 | その他の目的のためのPRP-L21 | |
| 源 | PLTのアフェレーシス | PLTのアフェレーシス | アフェレーシスと全血 |
| 凍結融解サイクル | 1 (で -80 °C) | 2 (で -80 °C) | 1-3 (-20 °Cおよび-80 °C) |
| 保管温度 | -80°Cで | -80°Cで | -20 °C および -80 °C で |
| 保存前の遠心分離速度 | 3000 x g/30分 | 3500 x g/30分 | 400-3000 x g/6 分 -30 分 |
| 保管前のろ過 | いいえ | はい | いいえ/はい |
表1:アフェレーシスによって収集された血小板ベースの製品から同種異系PRP-Lを調製するためのプロトコルの比較。
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Discussion
近年、眼の表面病理に対する血小板ベースの製品の臨床使用が増加しているが、それらの普及は科学的堅牢性の欠如によって妨げられている。これは主に、ドナーソースと調製プロトコルの幅広い異質性によって引き起こされ、それらはしばしば完全に開示されていないか、それらが調剤される目的のために特別に設計されていません。特に、アフェレーシスによって収集された血小板ベースの製品に関する情報はまだ不足しています。したがって、本研究の目的は、DEDの治療のためのアフェレーシスによって得られた多血小板血漿溶解物(PRP-L)の段階的な処理を説明することでした。
PRP-Lは、他の血液ベースの製品よりも多くのGFを含むため、点眼剤の製造に最適な供給源であり22、血清またはPRPと比較した場合、その製造または保管は安価で簡単です。PRP-Lを得るために、血小板を溶解(通常は1回以上の凍結および融解サイクルを経て)して、その内容物を放出する。このプロセスは、組織再生を刺激する活性分子に富む溶液を保証する22,26。PRP-L 22で治療される疾患は増加しているが、血小板採取およびPRP-L産生における標準化基準が低いため、眼科での使用の適応は依然として弱い3,22。
同種血小板ベースの製品は、ドナーの特性と調製方法の両方の点で自家よりも標準化可能であるため、好ましいはずです。患者の健康状態は、製品の品質6、16、17に影響を与える可能性があるが、輸血サービスが直接利用できないときに全血から自家血小板を収集するための社内キットは、輸血医学31で要求される標準品質を満たしていない。
眼科における同種PRP-Lの使用を特徴づける臨床研究はありませんが3、自家PRP-L点眼薬3に関する報告はほとんどなく、臍帯血から得られた同種PRP-Lを眼表面疾患患者の治療に使用した研究は1件のみです32。同種異系PRP-Lは臨床ガイドライン24に記載されており、その使用法が提案されていますが3,30、他の治療法や他の血液ベースの製品(血清など)と比較して、その有効性に関する証拠はまだ不足しています。ここで提示された議定書は、科学界が共通の生産方法を開発し、方法論の違いに光を当てるのを助けることを目的としています。
ここでは、アフェレーシスにより採取した同種PRPから始まるPRP-L産生について述べる。血小板溶解物を得るための血小板ベースの同種異系産物もバフィーコート(BC)から収集することができ、両方の供給源が等しく報告されています31。BCはプールされたドナー(通常は4人または5人)から得られるため、個人間の差が最小限に抑えられます。逆に、プーリングは、感染性病原体またはプリオンを感染させるか、同種異系反応を刺激するリスクを増加させる31,33。アフェレーシスは複雑で侵襲的な手順であり、少数のドナーのみがそれを受け入れる資格があるか、準拠しています34。それにもかかわらず、アフェレーシスによって得られる血小板ベースの製品は、他の残留循環血球を含まず、より多くの量のPLTを含む35。これらの理由から、現在の研究は、これら2つの異なるソースからのPRP-Lを比較するための臨床研究の開発に焦点を当てています。
このプロトコルでは、アフェレーシスによって収集されたPRPユニットにおけるPLTの開始濃度は平均1 x 109 / mLであり、これは他の血小板ベースの製品について報告された濃度と一致しています22。この方法では、PLTはその後0.9%NaCl溶液で0.3 x 109 / mLに希釈されます。他のプロトコルは、希釈のための血漿の使用を報告している22。
眼科におけるPRP-Lの使用を報告した研究はほとんどありません。これらの場合、自家点眼薬は、0.5 x 10 9 / mL-1 x 109 / mL36,37,38の範囲のPLTの濃度で調製されました。先に説明したように、標準化マーカーは望ましく、適切な希釈を決定するのにも役立ちます。ここでは、例えば、PRP-Lにおけるいくつかの重要なGFの濃度を報告する。EGFおよびPDGF含量はPRP-L22の有効性に影響を与えるが、TGFβアイソフォームは免疫シグナル伝達21,39の調節に関与しており、それらの濃度は細かく調節されている。したがって、血小板ベースの点眼薬中のTGFβ濃度は、有効性に影響を与えるだけでなく、潜在的な有害な影響も引き起こす可能性があります39。したがって、適切な希釈を定義する前に慎重に調査する必要があります。それにもかかわらず、選択された希釈率(0.3 x 109 PLT / mL)は、涙液中のGFs含有量に基づいていました21,25。Zhangらは以前、自家および同種の両方の血清ベースの点眼液と血小板ベースのライセートを、GFの含有量とin vitroで角膜細胞の再生を促進する能力について比較しました30。この研究では、PRP-LのEGF濃度は高いがフィブロネクチンが低いという、これらの製品がどのように同等の特徴を持っているかが示されました。彼らのプロトコルでは、凍結/解凍プロセスを2回繰り返し、遠心分離機を3500 x gで30分間実行し、血小板溶解液を-80°C30で保存しました。
凍結と解凍は確かに重要なステップです。ほとんどのプロトコル(これを含む)は、-80°Cの凍結と37°Cの融解で開発されましたが、凍結は-24°C、-196°C、および-150°Cでも報告されています22,33実行される凍結/解凍サイクルの数でさえ、1から5の範囲で可変です22,33。限られた数の研究はまた、血小板溶解物を得るための超音波処理または溶媒/洗剤処理を報告した22,33。PRP-Lの調製において以前に報告された他の方法論的変数は、遠心分離ステップ(300 x gから10000 x gの間、2分から60分)および長期保存に関するものであり、これはほとんどの場合、-80°Cであるが、同様の製品も-20°Cで直接保存されている22。特に保管条件は、溶解物に含まれるGFの可用性と活性に影響を与える可能性があるため、注意深く監視する必要があります。この非常に異質な状況では、生体因子の放出と治療効果の違いを考慮した品質管理と臨床試験が緊急に評価されるべきです。
最後に、PRP-Lを6ヶ月間投与されたドライアイ疾患患者の集計分析(OSDI質問票3)から、この方法がどのように有意に評価されたかを示します。有望ではあるが、OSDI単独ではDEDおよび他の眼表面疾患の治療におけるPRP-Lの有効性を決定するのに十分ではなく、同種異系PRP-Lの使用に関する臨床研究が必要である。さらに、方法論的手順を最適化するために、代替の方法論的ステップ(すなわち、凍結融解、遠心分離、貯蔵)による可能性のある製品組成の違いを比較する必要があります。
結論として、血液源とプロトコルの高い不均一性は、依然として血液ベースの製品の眼表面疾患の臨床治療への決定的な翻訳を妨げています。PRP-Lはいくつかの有利な機能を備えた新しい製品ですが、その使用を検証し、共通のガイドラインを開発するには、さらなる研究が必要です。準備のプロトコルを共有して詳細に説明すると、使いやすさが広がり、重要なステップに光が当てられる可能性があります。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
著者らは、ドナー由来の血小板濃縮物を提供してくれた「カサ・デル・ドノ・ディ・レッジョ・エミリア」に感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CompoSeal Mobilea II | Fresenius Kabi, Germany | bag sealer | |
| HeraSafe hood | Heraeus Instruments, Germany | Class II biohazard hood | |
| MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System | Haemonetics, Italy | automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components | |
| Platelet shaker, PF396i | Helmer, USA | Platelet shaker | |
| Raycell X-ray Blood Irradiator | MDS Nordion, Canada | X-ray Blood Irradiator | |
| ROTIXA 50RS | Hettich Zentrifugen, Germany | High speed entrifuge | |
| Sysmex XS-1000i | Sysmex Europe GMBH, Germany | haemocytometer for platelet count | |
| Warm bath, WB-M15 | Falc Instruments, Italy | Warm bath | |
| Materials | |||
| ACD-A anticoagulant solution A | Fenwal Inc., USA | DIN 00788139 | anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml) |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | BD 442020 | Sterility assay |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | 442020 | At least 2 vials for sterility assay |
| BD Luer Lok Syringe | BD Plastipack, USA | 300865 | At least 4 sterile syringes (50 ml) |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 1 | BioRad Laboratories, USA | 171AC500M | Standard panel for PDGF isoforms assessment |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 2 | BioRad Laboratories, USA | 171AC600M | Standard panel for EGF assessment |
| Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad Laboratories, USA | Magpix | This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads. |
| Bio-Plex Pro TGF-b Assay | BioRad Laboratories, USA | 10024984 | Set and standards for TGFb isoforms assessment |
| BioRet | ARIES s.r.l., Italy | A2DH0020 | At least 4 piercing spike for blood bags |
| Blood collection tube | BD Vacutainer, USA | 367835 | 1 tube, necessary to perform platelet counts |
| Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents | Biomed Device s.r.l., Italy | COLC50 | Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected |
| Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC511 | Set for PDGF isoforms assessment |
| Human Cancer2 EGF Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC603M | Set for EGF assessment |
| NaCl 0.9% sterile solution | Baxter S.p.A., Italy | B05BB01 | 1000 ml |
| OSDI Questionnaire | Allergan Inc., USA | OSDI | Ocular Surface Disease Index Questionnaire |
| Piercing spike | BioRet ARIES s.r.l., Italy | BS051004 | Spike |
| Platelet Additive Solution A+ T-PAS+ | TERUMO BCT Inc., Italy | 40842 | preservative solution for platelet concentrates (1000 ml) |
| Software Excel | Microsoft, USA | Excel | Data analysis software |
| Teruflex Transfer bag 1000 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*T100BM | 1 for PRP dilution |
| Teruflex Transfer bag 300 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*030CM | At least 6 for each PRP unit collected |
References
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