Summary
Os lisados plaquetários representam uma ferramenta emergente para o tratamento de doenças da superfície ocular. Aqui, propomos um método para o preparo, dispensação, armazenamento e caracterização do lisado plaquetário coletado de doadores de plaquetas.
Abstract
Várias doenças da superfície ocular são tratadas com colírios derivados do sangue. Seu uso foi introduzido na prática clínica por causa de seu conteúdo de metabólito e fator de crescimento, o que promove a regeneração da superfície ocular. Os colírios à base de sangue podem ser preparados a partir de diferentes fontes (ou seja, doação de sangue total ou aférese plaquetária), bem como com diferentes protocolos (por exemplo, diferentes diluições e ciclos de congelamento/descongelamento). Essa variabilidade dificulta a padronização dos protocolos clínicos e, consequentemente, a avaliação de sua eficácia clínica. O pormenor e a partilha dos procedimentos metodológicos podem contribuir para a definição de orientações comuns. Nos últimos anos, os produtos alogênicos vêm se difundindo como alternativa aos tratamentos autólogos, uma vez que garantem maiores padrões de eficácia; entre eles, os colírios de lisado plasmático rico em plaquetas (PRP-L) são preparados com procedimentos de fabricação simples. Na unidade de medicina transfusional da AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Itália, o PRP-L é obtido a partir da doação de aférese plaquetária. Este produto é inicialmente diluído a 0,3 x 10 9 plaquetas/mL (a partir de uma concentração média de 1 x 10 9 plaquetas/mL) em NaCl a0,9%. As plaquetas diluídas são congeladas/descongeladas e, posteriormente, centrifugadas para eliminar detritos. O volume final é dividido em alíquotas de 1,45 mL e armazenado a -80 °C. Antes de serem dispensados aos pacientes, os colírios são testados quanto à esterilidade. Os pacientes podem armazenar lisados plaquetários a -15 °C por até 1 mês. A composição do fator de crescimento também é avaliada a partir de alíquotas selecionadas aleatoriamente, e os valores médios são relatados aqui.
Introduction
Os produtos derivados do sangue são amplamente utilizados no cuidado de feridas1, cirurgia maxilofacial e ortopédica e para o tratamento de diferentes doenças da superfície ocular2, como a doença do olho seco (DED)3. Na DED, a homeostase do filme lacrimal é prejudicada como consequência do funcionamento anormal de diferentes fatores envolvidos na produção de lágrimas e na integridade da superfície ocular 4,5.
A DED é caracterizada por heterogeneidade de causas e gravidade 6,7,8 e pode ser consequência de diferentes fatores como envelhecimento, sexo9, lentes de contato, medicamentos tópicos ou sistêmicos 10 ou condições pré-existentes como a síndrome de Sjögren 10. Apesar de apresentar sintomas leves, a DED acomete milhões de pessoas em todo o mundo, impactando sua qualidade de vida e também o sistema de saúde6.
Muitos tratamentos têm sido relatados para essa patologia, mas ainda não há consenso sobre a solução mais eficaz12. Até o momento, as lágrimas artificiais são a primeira linha de terapia voltada para restaurar a composição aquosa do filme lacrimal, embora esses substitutos não contenham os principais solutos biologicamente ativos das lágrimas naturais 6,11. Os produtos à base de plaquetas são considerados uma alternativa válida12,13 às lágrimas artificiais, embora sua eficácia clínica, recomendações de uso e métodos de preparação ainda sejam motivo de debate3.
Os produtos à base de sangue compartilham com as lágrimas uma composição semelhante em termos de metabólitos14, proteínas, lipídios, vitaminas, íons, fatores de crescimento (GFs), compostos antioxidantes 11 e osmolaridade (300 mOsm/L)11. Por meio da atividade sinérgica de seus componentes, promovem a regeneração do epitélio corneano, inibem a liberação de citocinas inflamatórias e aumentam o número de células caliciformes e a expressão de mucinas na conjuntiva 2,3.
Até o momento, a heterogeneidade em produtos oftálmicos à base de sangue tem sido documentada na literatura; esses produtos podem ser classificados de acordo com a origem do doador de sangue, ou seja, autólogo ou alogênico, bem como a fonte sanguínea, ou seja, sangue periférico, sangue do cordão umbilical, soro ou plaquetas.
Embora os produtos autólogos tenham sido os mais difundidos3, os alogênicos estão se tornando a escolha preferida, uma vez que garantem maiores padrões de eficácia e segurança 15, juntamente com uma redução significativa nos custos16,17. Estudos prévios, de fato, comprovaram que produtos à base de sangue obtidos de pacientes com doenças autoimunes e/ou sistêmicas podem apresentar qualidade e funcionalidade alteradas 6,16,17. Apesar de os colírios à base de soro serem os mais difundidos, os produtos à base de plaquetas estão se firmando recentemente como uma alternativa válida, pois podem ser facilmente preparados mantendo níveis significativos de eficácia 3,11. Os produtos à base de plaquetas atualmente disponíveis podem ser divididos em plasma rico em plaquetas (PRP), lisado plasmático rico em plaquetas (PRP-L) e plasma rico em fatores de crescimento (PRGF)3.
Entre eles, o PRP-L tem a vantagem de ser um produto congelado de longa duração. O PRP-L pode ser preparado a partir de aférese, buffy-coats, ou mesmo de plaquetas expirantes (PLTs)18,19, reduzindo preciosamente seu desperdício. As alíquotas podem ser armazenadas por meses nos centros de transfusões de sangue a -80 °C ou mesmo nas casas dos pacientes a -15 °C por períodos mais curtos.
Os PRP-L são altamente enriquecidos em FGs, que comprovadamente estimulam a regeneração da superfície ocular 12,20,21. No entanto, são poucos os estudos clínicos relatados nessa área, e todos utilizaram fontes autólogas 3,22. O PRP-L ainda necessita de validação e caracterização adicionais antes de poder ser utilizado rotineiramente para o tratamento de doenças da superfície ocular, uma vez que não existem diretrizes padronizadas para sua preparação, dispensação e armazenamento3.
Neste documento, um protocolo detalhado é compartilhado para a produção de PRP-L usado na Unidade de Medicina Transfusional em AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Itália, e dispensação a pacientes com DED. Nosso objetivo é ajudar a comunidade científica a desenvolver métodos padrão de preparação, que possam aumentar a homogeneidade e a consistência em estudos e abordagens clínicas em todo o mundo.
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Protocol
O PRP-L utilizado para a avaliação quantitativa dos fatores de crescimento foi coletado dentro de um estudo mais amplo sobre a caracterização de produtos PRP para fins regenerativos, realizado na AUSL-IRCCS di Reggio Emilia e aprovado pelo Comitê de Ética da Área Vasta Emilia Nord em 10 de janeiro de 2019 (número de protocolo 2019/0003319). Os doadores deram o seu consentimento esclarecido de acordo com a Declaração de Helsínquia. Nenhuma aprovação ética foi necessária para coletar os dados agregados e anônimos do questionário Ocular Surface Disease Index (OSDI), que é rotineiramente usado por médicos para monitorar os sintomas da síndrome do olho seco. A Figura 1A mostra um esboço do protocolo seguido, enquanto as figuras da Figura 1B retratam as principais etapas do procedimento.
1. Coleta de plasma rico em plaquetas (PRP)
- Aférese do PRP
- Para este protocolo, selecione doadores de plaquetas de acordo com as leis italianas: os doadores de plaquetas devem ter entre 18 e 65 anos de idade, com parâmetros normais de pressão e hemograma e uma contagem plaquetária não inferior a 180 x 109 plaquetas / L23. Os doadores elegíveis não podem tomar medicamentos antiplaquetários ou anticoagulantes dentro de 1 semana antes da doação.
- Realizar plasma-plaquetas-aférese utilizando um sistema automatizado de coleta de sangue, de acordo com as instruções do fabricante e as legislações nacionais23, para obter 1 unidade de plasma rico em plaquetas (PRP) de doador único. Recolher PRP em solução anticoagulante de citrato de adenina dextrose A (ACD-A).
NOTA: A aférese plaquetária é realizada com um procedimento contínuo; o tempo de coleta está em um intervalo entre 40 min e 90 min. A quantidade de DAC entregue aos doadores e o tempo dos procedimentos dependem das características do doador, por exemplo, hematócrito e agulha.
- Características das unidades PRP
NOTA: A etapa a seguir geralmente é executada automaticamente pelo sistema automatizado de coleta de sangue durante o procedimento de plasma-plaquetas-aférese. Por favor, verifique o manual de instruções do fabricante.- Ressuspender as unidades de PRP coletadas por aférese em quantidade adequada de solução conservante com a quantidade mínima de plasma residual, necessária para manter o pH > 6,4 durante todo o tempo de armazenamento, até um volume final médio de 180 mL líquidos da solução anticoagulante (em torno de 40 mL).
NOTA: De acordo com a legislação italiana, os controlos de qualidade têm de avaliar que a contagem de plaquetas (PLTs) é de pelo menos 2,0 x10 11 PLTs/unidade, enquanto os leucócitos residuais têm de ser inferiores a 1 x 106 células/unidade. - Conservar o PRP leucodepletado e irradiado durante um período máximo de 5 dias a 22 °C ± 2 °C num agitador de plaquetas antes de nova manipulação23.
- Ressuspender as unidades de PRP coletadas por aférese em quantidade adequada de solução conservante com a quantidade mínima de plasma residual, necessária para manter o pH > 6,4 durante todo o tempo de armazenamento, até um volume final médio de 180 mL líquidos da solução anticoagulante (em torno de 40 mL).
- Diluição do PRP
- Imediatamente antes de iniciar a diluição do PRP, realize uma contagem de PLT com um hemocitômetro usando a amostra coletada da bolsa principal através de um espigão perfurante.
NOTA: Execute as próximas etapas na esterilidade sob um exaustor de risco biológico de classe II. Use equipamentos de proteção individual (jaleco, luvas e óculos) durante o procedimento. - Diluir o PRP com uma quantidade adequada de NaCl estéril a 0,9% até uma concentração final de 0,32 x 10 9 ± 0,03 x 109 PLTs/mL, que simula a concentração média de PLT no sangue periférico.
- Aproveitando um pico penetrante para bolsas de sangue, divida o PRP diluído em bolsas de coleta vazias de 300 mL para atingir um volume líquido de 190 mL/bolsa.
- Use uma alíquota de PRP diluído residual (geralmente 1 mL) para realizar controles de qualidade avaliando possíveis contaminações microbianas. Realize um ensaio de esterilidade seguindo as instruções do fabricante em um laboratório de microbiologia (consulte Tabela de Materiais).
NOTA: Utilizar frascos de cultura específicos para hemoculturas aeróbias, que são capazes de realizar a cultura qualitativa e recuperação de microrganismos aeróbios (principalmente bactérias e leveduras) a partir de amostras de sangue de pequeno volume. - Conservar os sacos de PRP diluídos a -80 °C durante um máximo de 2 meses antes do descongelamento.
- Imediatamente antes de iniciar a diluição do PRP, realize uma contagem de PLT com um hemocitômetro usando a amostra coletada da bolsa principal através de um espigão perfurante.
2. Preparação de lisado plasmático rico em plaquetas (PRP-L)
- Descongelar
- Antes de iniciar o processo de descongelamento, certifique-se de que um banho quente está regulado a 37 °C. Coloque os sacos PRP no banho quente e espere até descongelar completamente.
- Coleção PRP-L
- Centrifugar os sacos PRP a 3000 x g durante 30 min à temperatura ambiente.
NOTA: Os próximos passos devem ser realizados em esterilidade sob um exaustor de risco biológico de classe II. - Explorando o pico perfurante do saco de transferência, conecte o saco centrifugado com um saco de transferência estéril vazio de 300 mL. Com cuidado, transfira o sobrenadante PRP-L, evitando detritos, para o novo saco. Quando possível, use uma prensa de bolsas.
- Sele o tubo de conexão da unidade PRP-L com um selador de saco.
- Centrifugar os sacos PRP a 3000 x g durante 30 min à temperatura ambiente.
- Alíquota PRP-L
NOTA: Uma unidade de partida contendo 190 ml de PRP (ver passo 1.3.3.) é suficiente para preencher dois kits de colírios (para obter detalhes sobre os dispositivos médicos específicos utilizados para a aplicação e preservação de colírios de componentes sanguíneos, consulte a Tabela de Materiais). Os kits de colírios devem ser abertos sob um exaustor de classe II com os frascos para injetáveis de corda inteiros posicionados acima da seringa pré-ligada e a seta central da torneira apontando para a esquerda para excluir o filtro antibacteriano.- Recolher 30-60 ml de PRP-L com uma seringa estéril e ligar a seringa à ligação Luer/bloqueio na linha de enchimento.
- De acordo com as instruções do fabricante, gire a torneira pela metade de uma volta para abrir a linha entre a seringa contendo PRP-L e a seringa pré-conectada. Encha a seringa pré-ligada com PRP-L.
- Desligue a seringa PRP-L, feche a tampa do tubo da ligação luer/lock e rode a torneira para a posição original. Use a seringa do kit de colírios para encher os frascos para injetáveis com PRP-L.
- Repita o procedimento das etapas 2.3.1.-2.3.3. até que todos os frascos para injetáveis aplicadores estejam cheios. Certifique-se de que cada aplicador esteja devidamente preenchido e, em seguida, selá-los individualmente com um selador de sacos.
- Repita o procedimento com um novo kit de colírios.
- Utilizar uma pequena alíquota de PRP-L diluído residual para avaliar uma possível contaminação microbiana (ver passo 1.3.4.).
NOTA: Se o líquido atingir acidentalmente o filtro antibacteriano no final da corda, a seringa de sucção pode opor-se à resistência, dificultando o enchimento. Para continuar o ciclo de enchimento, levante a seção final da corda por cerca de 5/6 alíquotas do filtro hidrofóbico antibacteriano no final da corda. Nesta posição, utilize uma nova seringa estéril (de 30 ml de volume) que já tenha sido preenchida com ar. Ligue a luer/trava feminina do filtro antibacteriano e pressione com força e repetidamente o êmbolo da seringa para remover todos os resíduos de componentes sanguíneos e tornar a membrana do filtro antibacteriano livre do líquido. Retire a seringa e encha os restantes frascos para injetáveis.
- Armazenamento PRP-L
- Rotule corretamente cada aplicador e coloque-os em um saco plástico. Rotule o saco plástico também, tomando o cuidado de destacar o grupo sanguíneo do doador.
- Armazenar a -80 °C por um período máximo de 24 meses antes da designação do paciente, de acordo com a lei italiana23 e as diretrizes24.
3. Dispensação de PRP-L
- Realizar a designação do paciente de preferência combinando o grupo sanguíneo PRP-L. Entregue frascos para injetáveis aplicadores de PRP-L utilizando uma caixa fria e certifique-se de que cada frasco para injetáveis aplicador contém 1,45 ml de PRP-L, o que corresponde a aproximadamente 45 gotas. Instrua o paciente de que os frascos para injetáveis aplicadores podem ser armazenados nas casas dos pacientes por até 1 mês a -15 °C.
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Representative Results
A justificativa para o uso de colírios derivados do soro (que é o produto à base de sangue mais frequentemente usado para o tratamento de doenças da superfície ocular) reside em seu conteúdo de GFs, que são quase completamente derivados de plaquetas circulantes. O PRP contém um número significativamente maior de plaquetas (e, consequentemente, de GFs derivados de plaquetas) em comparação com o soro do sangue periférico, variando entre 0,15 x 10 9-0,45 x 109 PLTs/mL. De acordo com as leis italianas, a contagem de plaquetas em unidades PRP deve ser de pelo menos 0,9 x 10 9-1 x 109 PLTs/mL. Portanto, para obter um produto que simule a eficácia do colírio sérico, o PRP deve ser diluído para o conteúdo plaquetário fisiológico antes da preparação do lisato.
No entanto, uma vez que o reparo tecidual é impulsionado principalmente por GFs derivados de plaquetas, a contagem de PLT sozinha pode ser enganosa para uma terapia eficaz de doenças da superfície ocular. No DED, que é a doença ocular mais comumente tratada com colírios derivados do sangue, a produção de filme lacrimal e a homeostase são prejudicadas. Produtos à base de plaquetas para o tratamento de DED, portanto, também devem imitar o conteúdo fisiológico das lágrimas.
Identificar o PRP-L mais adequado para o tratamento de doenças da superfície ocular, descrito na etapa 1.3.2. do presente protocolo, avaliamos preliminarmente diferentes diluições de PRP, de acordo com seu conteúdo de PLTs (entre 0,7 x 10 9/mL e 0,3 x 109/mL), e alguns GFs representativos daqueles que se sabe estarem envolvidos no reparo do tecido ocular12,20,21.
A contagem plaquetária foi realizada com hemocitômetro, enquanto os GFs foram avaliados por meio de um ensaio de quantificação de proteínas multiplex. O ensaio foi realizado conforme descrito anteriormente25 de acordo com as instruções do fabricante. Os GFs mostrados neste manuscrito foram selecionados para quantificação após uma triagem preliminar de 36 GFs e GFRs realizada em lisado de PRP com uma matriz proteica semiquantitativa. A quantificação do Luminex foi realizada em 3 dos 36 GFs triados: EGF e PDGF (que se revelaram os mais abundantes em nossos lisatos PRP) e isoformas TGFβ-1,2,3 (para as quais o conteúdo é importante para o tratamento da superfície ocular21). Os teores de EGF e PDGF foram medidos, pois podem influenciar a eficácia do PRP-L22, enquanto as isoformas de TGFβ foram selecionadas por seu papel conhecido na regulação da sinalização imune21.
Como os arranjos proteicos fazem parte de outro estudo in vitro sobre a caracterização de diferentes PRP26, esses dados não são apresentados neste manuscrito.
Avaliamos quantitativamente EGF, PDGF e TGFβ em lisados de PRP de dois doadores diferentes (D1 e D2), previamente diluídos entre 0,7 x 10 9-0,3 x 10 9 PLTs/mL em NaCl a0,9%. A Figura 2 mostra os resultados da diluição de 0,3 x 109 PLTs/mL, que se mostrou mais semelhante à composição da lágrima.
A diluição de 0,3 x 109 PLTs/mL foi selecionada com base em dados da literatura sobre a composição da lágrima. Os valores de EGF mostraram-se bastante baixos em comparação com o valor médio da lágrima, mas ainda na faixa de normalidade27. Mesmo o PDGF, apesar de ser altamente variável entre os dois doadores considerados, foi sempre comparável à concentração encontrada nas lágrimas normais20. Finalmente, o TGFβ-1 foi a isoforma mais abundante no PRP-L, semelhante às lágrimas21.
Uma vez identificada a diluição de PLT mais adequada para preparar a aférese PRP-L, a Unidade de Medicina Transfusional começou a distribuir esses produtos para pacientes afetados por distúrbios da superfície ocular em 2015. Os oftalmologistas coletaram rotineiramente os questionários OSDI para monitorar os sintomas de DED; o teste OSDI avalia medidas de qualidade de vida, como a percepção de irritação ocular e como isso afeta o funcionamento relacionado à visão. O questionário, criado pelo Outcomes Research Group da Allergan Inc. em 1995 e agora aceito como um instrumento válido para monitorar a DED, é submetido aos pacientes e analisado conforme descrito anteriormente28,29.
Aqui, mostramos os resultados agregados dos testes OSDI de pacientes com disfunção erétil tratados entre janeiro de 2020 e janeiro de 2021 (n = 27). Após 6 meses de terapia com PRP-L, os escores do OSDI diminuíram de 56 ± 21 para 45 ± 21, indicando melhora na qualidade de vida dos pacientes (Figura 3).
Apesar desses dados ainda estarem na faixa grave e não estarem relacionados aos desfechos clínicos de eficácia, eles sugerem que os pacientes com disfunção erétil consideram o PRP-L um produto útil que melhora o desconforto ocular; este aspecto deve ser mais bem investigado em ensaios clínicos prospectivos destinados a avaliar a sua eficácia no tratamento de doenças da superfície ocular.
Na Tabela 1, relatamos uma comparação do presente método de produção com outro método de preparação alogênica PRP-L para colírios30 e para outros fins22. Até onde sabemos, o protocolo30 de Zhang e o protocolo atual são os únicos métodos publicados para produzir PRP-L para a superfície do olho. Em ambos, o PRP-L é obtido a partir da aférese; as diferenças entre os dois protocolos, principalmente relacionadas com o número de ciclos de congelamento e descongelamento e as etapas de centrifugação, devem ser comparadas a fim de melhorar a produção de PRP-L. No entanto, essas diferenças metodológicas não se mostraram prejudiciais à capacidade regenerativa do PRP-L testado em outros tecidos22.
Figura 1: Principais etapas do protocolo para a elaboração do PRP-L. (A) Esquema do protocolo, desde a coleta do PRP até o preparo e dispensação do PRP-L. (B) Imagens representativas das principais etapas dos protocolos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Quantificação de luminex dos fatores de crescimento derivados de plaquetas para a diluição 0,3 x 109/mL do PRP-L. (A) Fator de crescimento epidérmico (EGF); (B) fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF); (C) fator transformador de crescimento-beta isoforma 1 (TGFβ1); (D) fator transformador de crescimento-beta isoforma 2 (TGFβ2); (E) fator transformador de crescimento-beta isoforma 3 (TGFβ3). Os valores são expressos em pg/mL, média ± desvio padrão de três medidas independentes. D1 e D2 são dois doadores de plaquetas diferentes. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Escores OSDI agregados de pacientes com disfunção erétil tratados com PRP-L entre janeiro de 2020 e janeiro de 2021 na Unidade de Oftalmologia da AUSL-IRCCS di Reggio Emilia. N = 27 pacientes. Os resultados agregados do escore OSDI são representados como média ± erro padrão, o valor de p foi calculado com um teste t pareado com software de análise de dados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Este artigo | PRP-L para o olho (estudo in vitro )29 | PRP-L para outros fins21 | |
| Fonte | Aférese dos PLTs | Aférese dos PLTs | Aférese e sangue total |
| Ciclos de congelamento e descongelamento | 1 (a -80 °C) | 2 (a -80 °C) | 1-3 (a -20 °C e -80 °C) |
| Temperatura de armazenamento | a -80 °C | a -80 °C | a -20 °C e -80 °C |
| Velocidade de centrifugação antes do armazenamento | 3000 x g/30 min | 3500 x g/30 min | 400-3000 x g/6 min -30 min |
| Filtração antes do armazenamento | Não | Sim | Não/Sim |
Tabela 1: Comparação dos protocolos de preparação de PRP-L alogênico a partir de produtos à base de plaquetas coletados por aférese.
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Discussion
Nos últimos anos, o uso clínico de produtos à base de plaquetas para patologias da superfície ocular tem aumentado, mas sua difusão é dificultada pela falta de robustez científica. Isso é causado principalmente pela ampla heterogeneidade nas fontes de doadores e nos protocolos de preparação, que muitas vezes não são totalmente divulgados ou não são projetados especificamente para o propósito para o qual são dispensados. Particularmente, ainda faltam informações sobre produtos à base de plaquetas coletados por aférese. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi descrever o processamento passo-a-passo de lisados plasmáticos ricos em plaquetas (PRP-L) obtidos por aférese para o tratamento de DED.
O PRP-L é uma fonte ideal para a produção de colírios, uma vez que contém mais GFs do que os outros produtos à base de sangue22 e, quando comparado ao soro ou PRP, sua produção ou armazenamento são baratos e simples. Para obter o PRP-L, as plaquetas são submetidas à lise (geralmente através de um ou mais ciclos de congelamento e descongelamento) para liberar seu conteúdo. Esse processo garante uma solução enriquecida em moléculas ativas que estimulam a regeneração tecidual22,26. Um número crescente de doenças tem sido tratado com PRP-L22, mas a indicação para uso em oftalmologia ainda é fraca devido aos baixos critérios de padronização na coleta de plaquetas e na produção de PRP-L 3,22.
Os produtos alogênicos à base de plaquetas devem ser preferidos, pois são mais padronizáveis do que os autólogos, tanto em termos de características do doador quanto de método de preparação. O estado de saúde do paciente pode afetar a qualidade do produto 6,16,17, enquanto os kits internos para coleta de plaquetas autólogas do sangue total quando os serviços transfusionais não estão diretamente disponíveis não atendem à qualidade padrão exigida na medicina transfusional31.
Até onde sabemos, não há estudos clínicos que caracterizem o uso de PRP-L alogênico em oftalmologia 3, enquanto há poucos relatos sobre colírios autólogos PRP-L3 e apenas um estudo utilizando PRP-L alogênico obtido do sangue de cordão umbilical para tratar pacientes com doenças da superfície ocular32. Embora o PRP-L alogênico esteja listado nas diretrizes clínicas24 e seu uso tenha sido proposto 3,30, ainda há falta de evidências sobre sua eficácia em comparação com outros tratamentos e com outros produtos à base de sangue (por exemplo, soro). Aqui, o protocolo apresentado visa ajudar a comunidade científica a desenvolver métodos comuns de produção e lançar luz sobre as diferenças metodológicas.
Aqui, descrevemos a produção de PRP-L a partir de PRP alogênico coletado por aférese. Produtos alogênicos à base de plaquetas para obtenção de lisados plaquetários também podem ser coletados de buffy-coats (BCs), e ambas as fontes foram igualmente relatadas31. Os CBs são obtidos de doadores agrupados (geralmente quatro ou cinco), minimizando assim as diferenças interindividuais. Por outro lado, o agrupamento aumenta o risco de transmissão de agentes infecciosos ou príons ou estimula uma resposta alogênica31,33. A aférese é um procedimento complexo e invasivo, e apenas uma minoria dos doadores é elegível ou aderente a ela34. No entanto, os produtos à base de plaquetas obtidos por aférese são isentos de outras células sanguíneas circulantes residuais e contêm maior quantidade de PLTs35. Por essas razões, o presente trabalho está focado no desenvolvimento de estudos clínicos para comparar o PRP-L dessas duas fontes diferentes.
Neste protocolo, a concentração inicial de PLTs em unidades de PRP coletadas por aférese foi, em média, de 1 x 109/mL, o que é consistente com as concentrações relatadas para outros produtos à base de plaquetas22. Neste método, os PLTs são diluídos posteriormente com solução de NaCl a 0,9% a 0,3 x 109/mL. Outros protocolos relatam o uso de plasma para a diluição22.
Poucos estudos relataram o uso do PRP-L em oftalmologia; nesses casos, colírios autólogos foram preparados em concentrações de PLTs variando de 0,5 x 10 9/mL-1 x 109/mL36,37,38. Como discutido anteriormente, os marcadores de padronização são desejáveis e também ajudariam a determinar a diluição adequada. Aqui, por exemplo, relatamos a concentração de alguns GFs fundamentais no PRP-L. Os teores de EGF e PDGF influenciam a eficácia do PRP-L22, enquanto as isoformas de TGFβ estão envolvidas na regulação da sinalização imune21,39, e sua concentração é finamente regulada. Portanto, a concentração de TGFβ em colírios à base de plaquetas pode influenciar não apenas a eficácia, mas também provocar potenciais efeitos prejudiciais39; portanto, deve ser cuidadosamente investigado antes de definir a diluição adequada. No entanto, a diluição selecionada - 0,3 x 109 PLTs/mL - foi baseada no teor de GFs nas lágrimas21,25. Zhang et al. compararam anteriormente colírios à base de soro, autólogos e alogênicos, e lisados à base de plaquetas por seu conteúdo em GFs e por sua capacidade de promover a regeneração de células corneanas in vitro30. O estudo mostrou como esses produtos têm características comparáveis, com o PRP-L tendo maior concentração de EGF, mas menor fibronectina. Em seu protocolo, o processo de congelamento/descongelamento foi repetido duas vezes, a centrífuga realizada a 3500 x g por 30 min e o lisado plaquetário armazenado a -80 °C30.
O congelamento e o descongelamento são, de facto, um passo crítico; a maioria dos protocolos (incluindo este) foi desenvolvida com congelamento de -80 °C e descongelamento de 37 °C, mas o congelamento também foi relatado a -24 °C, -196 °C e -150 °C22,33 Mesmo o número de ciclos de congelamento/descongelamento realizados é variável, variando de 1 a 522,33. Um número limitado de estudos também relatou sonicação ou tratamento com solvente/detergente para obtenção de lisados plaquetários22,33. Outras variáveis metodológicas relatadas anteriormente na elaboração do PRP-L dizem respeito à etapa de centrifugação - entre 300 x g e 10000 x g, de 2 min a 60 min - e ao armazenamento a longo prazo, que, na maioria dos casos, está a -80 °C, embora produtos similares também tenham sido armazenados diretamente a -20 °C22. As condições de armazenamento, em particular, devem ser cuidadosamente monitorizadas, uma vez que podem afetar a disponibilidade e a atividade dos GF contidos nos lisatos. Nesse contexto altamente heterogêneo, controles de qualidade e estudos clínicos que levem em consideração a liberação de fatores biogênicos e as diferenças no efeito terapêutico devem ser avaliados com urgência.
Finalmente, aqui mostramos como esse método foi significativamente avaliado com um resultado positivo de uma análise agregada de pacientes com doença do olho seco que receberam PRP-L por 6 meses (questionário OSDI3). Embora promissor, o OSDI por si só não é suficiente para determinar a eficácia do PRP-L no tratamento de DED e outras doenças da superfície ocular, e estudos clínicos sobre o uso de PRP-L alogênico são justificados. Além disso, possíveis diferenças na composição do produto devido a etapas metodológicas alternativas (ou seja, congelamento e descongelamento, centrifugação, armazenamento) devem ser comparadas para otimizar o procedimento metodológico.
Em conclusão, a alta heterogeneidade de fontes e protocolos sanguíneos ainda dificulta a tradução definitiva de produtos à base de sangue para o tratamento clínico de doenças da superfície ocular. Embora o PRP-L seja um produto emergente com algumas características vantajosas, mais estudos são necessários para validar seu uso e desenvolver diretrizes comuns. Compartilhar e detalhar o protocolo de preparação pode expandir a usabilidade e lançar luz sobre as etapas críticas.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores agradecem à "Casa del Dono di Reggio Emilia" por fornecer concentrados de plaquetas derivados de doadores.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CompoSeal Mobilea II | Fresenius Kabi, Germany | bag sealer | |
| HeraSafe hood | Heraeus Instruments, Germany | Class II biohazard hood | |
| MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System | Haemonetics, Italy | automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components | |
| Platelet shaker, PF396i | Helmer, USA | Platelet shaker | |
| Raycell X-ray Blood Irradiator | MDS Nordion, Canada | X-ray Blood Irradiator | |
| ROTIXA 50RS | Hettich Zentrifugen, Germany | High speed entrifuge | |
| Sysmex XS-1000i | Sysmex Europe GMBH, Germany | haemocytometer for platelet count | |
| Warm bath, WB-M15 | Falc Instruments, Italy | Warm bath | |
| Materials | |||
| ACD-A anticoagulant solution A | Fenwal Inc., USA | DIN 00788139 | anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml) |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | BD 442020 | Sterility assay |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | 442020 | At least 2 vials for sterility assay |
| BD Luer Lok Syringe | BD Plastipack, USA | 300865 | At least 4 sterile syringes (50 ml) |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 1 | BioRad Laboratories, USA | 171AC500M | Standard panel for PDGF isoforms assessment |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 2 | BioRad Laboratories, USA | 171AC600M | Standard panel for EGF assessment |
| Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad Laboratories, USA | Magpix | This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads. |
| Bio-Plex Pro TGF-b Assay | BioRad Laboratories, USA | 10024984 | Set and standards for TGFb isoforms assessment |
| BioRet | ARIES s.r.l., Italy | A2DH0020 | At least 4 piercing spike for blood bags |
| Blood collection tube | BD Vacutainer, USA | 367835 | 1 tube, necessary to perform platelet counts |
| Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents | Biomed Device s.r.l., Italy | COLC50 | Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected |
| Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC511 | Set for PDGF isoforms assessment |
| Human Cancer2 EGF Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC603M | Set for EGF assessment |
| NaCl 0.9% sterile solution | Baxter S.p.A., Italy | B05BB01 | 1000 ml |
| OSDI Questionnaire | Allergan Inc., USA | OSDI | Ocular Surface Disease Index Questionnaire |
| Piercing spike | BioRet ARIES s.r.l., Italy | BS051004 | Spike |
| Platelet Additive Solution A+ T-PAS+ | TERUMO BCT Inc., Italy | 40842 | preservative solution for platelet concentrates (1000 ml) |
| Software Excel | Microsoft, USA | Excel | Data analysis software |
| Teruflex Transfer bag 1000 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*T100BM | 1 for PRP dilution |
| Teruflex Transfer bag 300 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*030CM | At least 6 for each PRP unit collected |
References
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