Summary
我们提出了简单的肌动蛋白丝微流体测定方案，结合荧光显微镜，使人们能够实时准确地监测单个肌动蛋白丝，同时按顺序将它们暴露于不同的蛋白质溶液中。
Abstract
为了破译调节肌动蛋白细丝组装和拆卸的复杂分子机制，在良好控制的条件下监测单个反应是一项重要资产。为此，在过去的20年中出现了实时单丝实验，主要使用全内反射荧光（TIRF）显微镜，并提供了大量关键结果。2011年，为了进一步扩大这些实验的可能性并避免反复出现有问题的伪影，我们在这些测定中引入了简单的微流体。本研究详细介绍了我们的基本方案，其中单个肌动蛋白细丝由一端锚定在钝化的盖玻片表面上，与流动对齐，并且可以连续暴露于不同的蛋白质溶液中。我们还介绍了特定应用的协议，并解释了如何施加受控的机械力，这要归功于流动溶液的粘性阻力。我们强调了这些实验的技术警告，并简要介绍了基于该技术的可能发展。这些方案和解释，以及当今易于使用的微流体设备的可用性，应该允许非专业人员在其实验室中实施该测定。
Introduction
肌动蛋白长丝和肌动蛋白丝网络的组装和拆卸由几种生化反应控制，并取决于机械环境。为了深入了解这些复杂的机制，能够观察单个细丝上的单个反应（足够大的数量）是非常宝贵的。在过去的几十年中，实时观察动态肌动蛋白丝，主要使用全内反射荧光（TIRF）显微镜，已成为一项关键技术，并提供了令人印象深刻的结果列表，这些结果无法通过本体溶液生化测定1获得。
为了实现这一点，需要将荧光标记的肌动蛋白丝保持在显微镜盖玻片表面附近，同时将它们暴露于肌动蛋白结合蛋白（ABP）的溶液中，这些溶液也可以进行荧光标记。这样做提供了一种在良好控制的生化条件下监测单个细丝上发生的事件的方法，从而量化反应速率。但是，应考虑一些具体的限制。人为地保持细丝靠近表面，通常由于多个锚定点或使用拥挤剂如甲基纤维素，可以改变它们的行为（例如，导致其聚合和解聚的暂停2）。跟踪每根灯丝的轮廓可能具有挑战性，特别是如果新的灯丝或灯丝碎片随着时间的推移在视野中积聚。反应发生在有限的体积中，其中肌动蛋白单体和ABP的浓度会随时间变化，可能难以获得准确的速率常数。最后，更新或改变ABP的溶液很难在不到30秒的时间内实现，并且通常会导致样品中的蛋白质含量不均匀。
10多年前，受到已经完成的单个脱氧核糖核酸（DNA）链3的启发，我们引入了一种基于微流体的新技术来观察和操纵单个肌动蛋白丝4。它允许人们规避上述经典单丝技术的局限性。在这些微流体测定中，肌动蛋白细丝是从吸附在盖玻片上的光谱蛋白 - 肌动蛋白种子中生长的。因此，细丝仅由一端锚定在微流体室的底部，并在表面上方波动而不粘附。细丝与进料溶液的流动保持一致，从而简化了对其轮廓长度的监控，并将它们保持在可以使用TIRF的盖玻片上方的浅区域。不同的溶液同时流入腔室而不混合，并且细丝可以依次快速地暴露在它们中。
在这里，我们提出了一系列基本方案，以在实验室中建立单肌动蛋白丝微流体测定。盖玻片和微流体室可以提前（在半天内）制备，实验本身可以在不到一天的时间内完成，其中可以测试几种生化条件。
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Protocol
1. 微流控室制备
- 选择具有多个腔室图案的SU-8主模具。典型的腔室是十字形的，有三个入口和一个出口，高20μm，宽800μm（图1）。这种母模可以从外部公司购买或在学术实验室制造（例如，Gicquel，Y.等人5）。
- 将胶带放在模具边缘周围。
- 将约50厘米长，19毫米宽的标准透明办公胶带（见 材料表）放在长凳上，粘性面朝上。将模具垂直放置在胶带的一端和中线。
- 将模具卷到胶带的另一端，在模具周围形成一个1厘米的边框。将胶带折叠在模具底部。
- 制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）溶液。
- 在一次性称重盘中，直接倒入25-30克PDMS底座（材料表）。用一次性塑料巴斯德移液器加入10%重量/重量的PDMS固化剂（材料表）。
- 用塑料棒手动彻底混合。确保固化剂充分掺入PDMS基质中，即使搅拌会产生大量气泡。
- 在室温（RT）下将PDMS溶液在真空干燥器（材料表）中脱气至少5分钟。气泡会膨胀，上升到表面，并在真空被打破时破裂。
- 将 PDMS 溶液倒在 SU-8 模具上。使用塑料棒刮擦并转移尽可能多的混合物。
- 第二次对PDMS进行脱气（在真空干燥器中5分钟）。确保去除大多数气泡（顶部表面的一些小气泡很好）。
- 将模具置于70°C的烤箱中至少5小时，以使PDMS网状并固化。
- 从模具中取出固体 PDMS 腔室。
注意：用于SU-8模具的硅晶圆非常脆弱，因此在将PDMS与晶圆分离时必须格外小心。在坚硬、平坦的表面上工作，并使晶圆在表面上保持平坦。- 用剃须刀片在PDMS中做一个圆形切口，距离模具边缘约1厘米。所有图案必须在切口内至少 0.5 厘米。用轻柔的拉扯轻轻剥离中央 PDMS 块。
注意：剥落时，请将SU-8模具平放在台面上，以防止其破裂。 - 将PDMS放在干净的铝箔上，模制表面面向铝箔，以保护其表面免受灰尘侵害并使图案更加明显。
- 用剃须刀片在PDMS中做一个圆形切口，距离模具边缘约1厘米。所有图案必须在切口内至少 0.5 厘米。用轻柔的拉扯轻轻剥离中央 PDMS 块。
- 选择并用剃须刀片切割距离图案至少0.5厘米的腔室。由此产生的PDMS块高约0.5厘米，宽1.5厘米，长3厘米。用内径0.75毫米的活检冲头刺穿三个入口和一个出口（材料表）。
- 用超纯乙醇清洁PDMS室（材料表），并使用安全吹气枪（材料表）风干。将图案朝上的PDMS放在干净的培养皿中，并用盖子关闭培养皿。
2. 玻璃盖玻片清洁
注意：这里详细介绍了基于一系列超声处理步骤的标准盖玻片清洁程序。其他玻璃盖玻片清洁程序已经在许多其他出版物中描述过，这些程序可以达到类似的令人满意的结果6，7，8，9。
- 将10-20个盖玻片（40毫米长）放在聚四氟乙烯（PTFE）支架上（材料表）。在1L玻璃烧杯（35°C，30分钟）中将盖玻片在0.5L的2%玻璃清洁溶液（材料表）中超声处理。
- 处理玻璃清洁溶液，并在至少三个连续的0.5 L浴中用dH 2O广泛冲洗盖玻片。
- 在1升玻璃烧杯中准备0.5升2 M KOH。在KOH（RT，30分钟）中超声处理盖玻片。处理KOH并用dH 2 O冲洗盖玻片，至少三个0.5升浴。
注意：使用适当的实验室安全防护设备（手套、眼镜和实验室外套）。 - 在0.5L超纯乙醇（RT，30分钟）中转移并超声处理盖玻片。盖玻片可以在乙醇中保存长达2周。用热塑性薄膜（材料表）关闭烧杯以防止蒸发。使用前，用气流干燥盖玻片。
3. 管腔室组装
- 将热板预热至100°C。 将最多三个清洁的 PDMS 室和玻璃盖玻片放入干净的培养皿中。将开放的培养皿置于深紫外线（UV）清洁剂（λ = 185nm，参见 材料表）中，并将其暴露在紫外线下3-5分钟。
注意：或者，PDMS室和盖玻片可以暴露在空气或氧气等离子体中30秒。 - 轻轻地将 PDMS 腔室放在盖玻片上。确保接触的两个表面直接暴露在紫外线下。PDMS自动粘附在玻璃上，腔室变得清晰可见。
- 要清除被困在 PDMS 盖玻片接口处的任何空气，请用手指轻轻按压表面。要实现更紧密的粘合，请更用力地按压角落和侧面。确保腔室的天花板不与玻璃表面接触。
- 将玻璃底朝向100°C的热板放置室5分钟。完成此步骤后，玻璃- PDMS键合成为永久性的，腔室只能使用一次。立即使用腔室或将其存放在干净的培养皿中长达一周。
4. [可选] 直接钝化和功能化
注意：根据应用的不同，腔室可以在连接到微流体控制装置（参见 材料表）后进行钝化和功能化，或者在将溶液连接到微流体装置之前用移液管手动将溶液直接注入腔室。后者的优点是消耗更少的试剂，并通过使溶液流过微流体装置的聚醚醚酮（PEEK）管来避免潜在的污染。在以下所有步骤中，通过将移液器吸头直接插入出口来注入溶液。为了避免在腔室内产生气泡，当将吸头插入 PDMS 腔室的出口时，请确保移液器吸头中伸出一个微小的液滴。同样，在注入整个体积之前取出移液器吸头。
- 注入20微升PLL-PEG（1毫克/毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS））。在室温下孵育至少1小时（或过夜）。为防止蒸发，请将 PDMS 室放在潮湿的箱子中（例如，下部隔室中有一个装有水的空吸头盒，而 PDMS 室位于吸头保持平台上）。
- 注入20μL100 pM光谱蛋白肌动蛋白种子（在F缓冲液中，见 表1 和 表2）。等待不超过1分钟。调整种子浓度和时间以调整种子表面密度，高到足以进行大统计，足够低，以使细丝不重叠。
注意：或者，如果没有光谱素 - 肌动蛋白种子，请使用生物素功能化的短丝段，这些短丝段将固定在链霉亲和素包被的盖玻片9，10上。 - [可选]在F缓冲液中注入20μL5%牛血清白蛋白（BSA）。在室温下放置 10 分钟。
- [可选]在F缓冲液中注入20μL1mg / mL β酪蛋白。在室温下放置 10 分钟。
注：按照步骤 4.3 和/或 4.4 进一步钝化腔室。钝化的选择取决于所使用的蛋白质，并且不能在所有ABP上同样有效。当单独使用肌动蛋白时，PLL-PEG或BSA就足够了。
5. 连接微流控装置
注意：使用具有多达四个通道的基于压力的微流体系统来控制微流体室中的流量（图1A，参见 材料表）。为避免微流体管中形成气泡并扰动流动稳定性，请对所有溶液进行脱气。将5 mL dH20和10 mL F缓冲液置于连接到真空泵的真空干燥器中（极限真空<250 mbar），并在室温下脱气至少1小时。
- 用 dH2O （500 μL， 300 mbar） 冲洗入口 + 出口管。
- 用300μLF缓冲液填充所有2 mL储液管（参见 材料表）。将压力设置为 300 毫巴，让 5 到 8 滴水浪费掉。对每个通道重复上述步骤，并将压力设置为 0。
- 连接出口并广泛冲洗腔室。
- 将油箱管 4（出口）的压力设置为 50 mbar。一旦液滴从管端出来，将管子连接到PDMS室的出口。液体填充在腔室中并从所有入口中流出。
- [可选]如果腔室已直接钝化（第4节），请将压力设置为100 mbar，以用50-100μLF缓冲液冲洗腔室（3-5分钟）。用清洁纸巾清除入口处多余的液体。
- 将压力设置为 20 毫巴。
- 连接入口。
- 将储液管的压力设置为 1 至 50 mbar。为避免引入气泡，请确保液滴从管道和 PDMS 入口中流出。
- 将管子连接到入口1（连接时两个液滴合并）。将压力设置为 30 毫巴。
- 重复步骤 5.4.1-5.4.2 以连接入口 2 和 3。
- 将所有入口的压力设置为 20 毫巴，将出口压力设置为 0 毫巴。确保入口处的流速大致相等（请参阅故障排除部分）。
图1：通过微流体室注射溶液 （A）用于单个肌动蛋白丝实验的标准微流体设置。放置在储液槽1-3中的蛋白质溶液通过调节气相中的压力被推入腔室。生成的流量由流量计测量。在微流体室内部，溶液不会混合并占用空间，具体取决于施加的相对压力（此处为所有入口上的相同压力）。典型尺寸：储液管含有多达 2 mL 的溶液。PEEK管（内径0.25毫米）将储液器连接到流量计（在10厘米的管道之后），然后连接到PDMS室（再连接70厘米后）。硅管和不锈钢管接头用于将PEEK管连接到PDMS入口。主微流体通道高20-60μm，宽约1毫米，长1厘米。（乙、丙）微流体腔内的流动曲线。（B）流体在腔室高度上产生抛物线轮廓：v（z） = 6z（h-z）R / h3w，其中h和w是腔室的高度和宽度，R是总流速。底部：由表面锚定的光谱蛋白肌动蛋白种子聚合而成的单肌动蛋白丝。（C）当腔室宽度大大大于其高度时，流动在腔室中几乎是均匀的，除了在PDMS表面，它变为零。请点击此处查看此图的大图。
6. 使用标准流速配置设置
注意：计算机控制的压力系统可以轻松、精确地调节连接到 PDMS 腔室的所有入口/出口的压力，从而控制输入和输出流量。只需单击鼠标即可保存和打开/关闭预设配置。以下是推荐的配置（除非另有说明，否则出口压力设置为 0 mbar）。有关这些预设配置的预期流速，请参见 表 3 。此处指示的压力必须根据腔室几何形状和系统配置进行调整。
-
更改：更改一个或多个储液槽时使用此预设。它在感兴趣的管道中产生温和的逆流，以防止引入气泡。
- 将所有入口压力设置为 12 毫巴，将出口压力设置为 5 毫巴（图 2B）。
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高流量“全部”：使用此预设可快速并行注入三种溶液。他们将在4分钟内到达房间。
- 将所有入口压力设置为 150 mbar。
-
高流量“x”：使用此预设可快速注入溶液。它将在3分钟内到达腔室（图3A-C）。
- 将入口“x”压力设置为150毫巴（~15毫升/分钟）。其他入口中的压力被调节到约100 mbar，使得这些入口处产生的流速约为500 nL / min。
-
中流“全部”：使用此预设可暂停系统。
- 将所有入口设置为20毫巴（图2A）。
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中流'x'：使用此预设允许溶液“x”填充大部分主通道宽度（见 图2C，D），同时将其他入口解决方案限制在通道侧。因此，腔室中的肌动蛋白细丝将仅暴露于溶液“x”施加的生化条件下。
- 将入口“x”压力设置为12毫巴。设置其他入口处的压力并调整至~9 mbar，使其各自的流速为~150 nL/min。
图2：施加在每个储液罐上的压力控制微流体室内溶液的分区/空间分布。（A）在对储液器施加相等压力的情况下，每个溶液占据腔室的三分之一。（B）更换储液管（此处为储液罐3）时，有效压力降至零，产生逆流。（三、四）增加其中一个储液槽上的相对压力允许玻璃表面暴露在单个溶液中。通过在配置中流1（C）和中流2（D）之间交替，腔室中间的视野可以依次暴露于溶液1和2。请点击此处查看此图的大图。
7. 更改解决方案“x”
注意：如图3A-C所示，重要的是要记住，溶液从储液管流向腔室的主通道需要几分钟时间。这种最小的“死”时间是由管道中所含的液体体积和管道内的流动曲线施加的（图3A-C）。
- 在新的储液管中制备200-300μL溶液。将压力设置为 更改 设置（请参阅第 6 节）。
- 拧下入口“x”的储液管。卡套管中的溶液将缓慢地向后流动，从腔室到自由管尖。测得的流速变为负值（图2B）。
- 一旦在管尖上形成微小的液滴，用新鲜的溶液拧入新管。一旦管子正确拧紧到压力系统，入口的流速就会恢复为正值。
- 将压力设置设置为 高流量“x”。
- 根据微流体配置和腔室几何形状，等待3-5分钟，使溶液完全填充管并到达腔室。
- [可选]通过测量荧光随时间的增加来遵循此过程（图3C）。
图3：溶液从储液罐延迟到达PDMS室以及生化条件的快速变化。 （自动对照）溶液从储液罐延迟到达 PDMS 室。 （A） 根据腔室几何形状，管长和入口处施加的压力，一种溶液的更换不是即时的。将储液管更换为含有荧光溶液的储液管（0分钟）后，溶液逐渐填充管（0.4分钟）和PDMS室（1-2分钟）。对于 150 mbar 施加的压力、80 cm PEEK 管和 1600 μm 宽、20 μm 高的 PDMS 腔室，给出了指示性计时。 （B）PEEK管内的抛物线流动曲线沿管子放射状剖面和腔室内产生有效的荧光梯度（另见 图1B）。 （C）溶液的延迟到达可以通过测量腔室中的背景落射荧光信号作为时间的函数来量化。实验条件：通过流量计和80 cm PEEK管向0.5 μM 10%Alexa-568标记的G-肌动蛋白注入150 mbar。 （D，E）生化条件的快速变化。 （D） 两种 中流 条件下的进料溶液模式。 （E）背景荧光的增加作为肌动蛋白浓度的读数。时间 t = 0 设置为荧光开始增加。溶液1：0.5μM 10%Alexa-488标记的G-肌动蛋白，溶液2：F缓冲液。（C，E）PDMS腔室：高20微米，宽1600微米。通过对整个视场上的信号求平均值来量化表面以上约2μm的落射荧光强度，在没有荧光团的情况下归一化为0，在最大强度下归一化为1。 请点击此处查看此图的大图。
8. 基本单丝实验：二磷酸腺苷（ADP）-肌动蛋白倒钩端解聚
注：本节假定为非功能化腔室（仅限第 5 节）。如果腔室已直接功能化（第4节），请从步骤8.4开始。
- 肌动蛋白长丝种子的表面功能化：
- 在F缓冲液中改变溶液3至200μL的50pM光谱蛋白 - 肌动蛋白种子11 （参见第7节）。
注意：或者，如果没有光谱蛋白 - 肌动蛋白种子，则可以使用生物素功能化的短丝段，这些短丝段将被固定在链霉亲和素包被的盖玻片上（有关详细信息，请参阅9，10 ）。 - 用 高流量注射2分钟 3.
注意：根据最终种子密度调整浓度和时间。
- 在F缓冲液中改变溶液3至200μL的50pM光谱蛋白 - 肌动蛋白种子11 （参见第7节）。
- 表面钝化：
- 在F缓冲液中用300μL5%BSA更换试管3。
- 在 高流量3下注射5分钟，然后在 中流3下注射5分钟。在第二步中，将通道1和2中的压力降低到7-8 mbar以获得逆流〜-100 nL / min，以便整个腔室表面被BSA钝化。
注意：由于BSA溶液粘度更高，因此需要相应地调整压力。
- 将管3更换为F缓冲液并冲洗通道（5分钟， 高流量3）。
- 制备以下200-300μL溶液，所有蛋白质在F缓冲液中稀释：
入口1，聚合溶液：1μM 10%Alexa-488标记G-肌动蛋白，1μM普罗菲林（表1）。
入口2，老化溶液：0.15μM 10%Alexa-488标记G-肌动蛋白。
3、解聚液：仅F缓冲液。
注意：普罗菲林在这里用于防止自发成核并保持G-肌动蛋白的恒定浓度。 - 更换试管 1 至 3（第 7 节）。使用 高流量全部 预设注入3-4分钟。这三种溶液现在已经填充了PEEK管并到达了腔室（图3A）。玻璃表面可以暴露在任何入口溶液中，而不会出现死区时间（<1秒， 图3D，E）。
- 打开显微镜。设置设置：150 mW 488 nm激发激光器，10%-20%功率，100-200 ms相机曝光时间，200-300 nm TIRF穿透深度，60倍物镜。这些设置在整个手稿中使用。
- 灯丝聚合（图4A）：
- 将压力设置设置为 中流 1 约 10 分钟。
- [可选]记录聚合（1 帧/20 秒，TIRF）。细丝应以约10亚基/秒（亚/秒）1，12聚合。
- 灯丝老化：将压力设置设置为 中流2 ，持续15分钟。在临界浓度下，0.15μM G-肌动蛋白，灯丝长度将保持不变，细丝将变为>99%ADP-F-肌动蛋白4。
- 解聚（图4A）：
- 在落射荧光模式下以1帧/5秒开始采集。由于通道2和3中的荧光背景非常低，因此无需使用TIRF。
- 在一到两帧之后，切换到 中流 3。细丝应在约10亚/秒处解聚（参考文献12）。
- 为了重置实验，通过以最大功率连续暴露于激光约2分钟来打破所有荧光标记的灯丝。要测试不同的条件，请更换溶液1，2或3并注入它们（高流量，3-4分钟）。重复步骤 8.7-8.9。
9. 其他单丝实验
- 测试 ABP 与 F-肌动蛋白的相互作用
注意：微流体已成功用于量化几种侧结合ABP的活性，例如共纤维蛋白，托生育蛋白和Arp2 / 3。按照第8节中的协议：- 将通道3更改为F缓冲液中感兴趣的荧光ABP。注射（高流量3，3分钟）。
- 灯丝聚合：将压力设置设置为 中流1 ，持续10分钟。
- 总部基地绑定：使用 TIRF 开始采集。根据 ABP 浓度调整帧速率。1-2 帧后，切换到 中流 3。
注意：根据 ABP 的不同，还可以快速（例如，在 5 秒内）切换到 Mid Flow 2 ，以进一步减少拍摄图像时的背景荧光。 - 总部基地解除绑定：在继续收购的同时，切换到 中流2。
- 在自由倒钩端用前茬聚合
注意：前缘素已被证明会影响细丝倒钩端聚合。微流体特别适用于测量formin结合和脱绑速率及其对长丝伸长的影响。- 准备以下解决方案：
通道 1：F 缓冲液中的 10 nM formin（表 1）。
通道 2：1 μM 10% Alexa-488 标记 G-肌动蛋白，4 μM profilin。
通道 3：F 缓冲器。 - 更换试管 1、2 和 3（第 7 节）。使用 高流量全部 预设注入3-4分钟。
- 启动灯丝聚合：将压力设置设置为 中流2 ，持续2分钟。
- Formin 与灯丝倒钩端的结合：将压力设置设置为 中流 1 ，持续 30 秒。
- 福明介导聚合：将压力设置设置为 中流 2。当formin mDia1在其倒钩端时，细丝应在约50亚/秒13，14，15处聚合。
- 准备以下解决方案：
- 表面锚定前缘的聚合/解聚
注意：Formin装饰的倒钩端的聚合和解聚速率已被证明取决于施加在灯丝上的张力。在微流体中，流体沿灯丝侧流动的摩擦产生与灯丝长度和流速14，16成比例的张力。- 使用上述第 8 节中的方法，将步骤 8.1、8.2 和 8.3 中的表面钝化替换为：
- 将试管3至1μg/ mL抗His抗体更换在F缓冲液中。用 高流量注射2分钟 3.
- 在F缓冲液中更换5%BSA的管3。在 高流量3下注射5分钟，然后在 中流3下注射5分钟。在第二步中，将通道1和2中的压力降低到7-8 mbar，以获得~-100 nL / min的逆流，以便整个腔室表面被BSA钝化。
- 将管3改为100 nM His标记的formin在F缓冲液中。用 高流量注射5分钟 3。用F缓冲液更换试管3。用 高流量3 注入5分钟，以确保管道中没有formins。
- 制备并注射以下溶液（每个200-300μL，在F缓冲液中）：
通道 1：1 μM 10% Alexa-488 标记 G-肌动蛋白。
通道2：1μM未标记的G-肌动蛋白，4μM脯蛋白。
通道 3：仅限 F 缓冲器。 - 灯丝成核：将表面锚定的formin暴露于G-肌动蛋白（设置 中流1）。
- 长丝聚合：使用 中流2将腔室暴露于普罗菲林 - 肌动蛋白。
- 开始采集：1 帧/2 秒，落射荧光。使用formin mDia1时，长丝应在50-80 sub/s下聚合，具体取决于灯丝长度和流速14。
- 灯丝解聚：开始采集（1帧/4秒，落射荧光）。1-2帧后，将灯丝暴露在F缓冲液 中，中流3。使用formin mDia1，长丝应在5-15 sub/ s下解聚，具体取决于灯丝长度和流速14。
- 使用上述第 8 节中的方法，将步骤 8.1、8.2 和 8.3 中的表面钝化替换为：
- 具有未标记节段的肌动蛋白细丝
注意：肌动蛋白荧光标记会产生几种伪影，例如解聚过程中的停顿17 和改变的托肌苷结合18。这些伪影的解决方法是使用微流体来组装显示未标记片段的细丝。- 制备并注射以下溶液（200-300μL在F缓冲液中）：
通道 1：1 μM 未标记的 G-肌动蛋白，1 μM 脯氨酸。
通道 2：0.3 μM 10% Alexa-488 标记 G-肌动蛋白。 - 将表面依次暴露于通道2（5分钟），通道1（10分钟）和通道2（15分钟），以产生ADP-肌动蛋白未标记的片段，每端都有荧光标记的片段。
- 制备并注射以下溶液（200-300μL在F缓冲液中）：
- 带刺的末端锚定细丝与凝胶素
注意：对于光谱素 - 肌动蛋白种子，细丝在其游离的倒钩端聚合，而尖端由光谱素 - 肌动蛋白种子稳定。另一种方法是用带刺的端盖器（如凝胶素）锚定细丝。- 在20μLF缓冲液中制备4μM 10%Alexa-488标记G-肌动蛋白的F-肌动蛋白溶液。让肌动蛋白自发成核并在室温下在工作台上聚合至少30分钟。用铝箔包裹管子以保护其免受光线照射。
- 同时，制备微流体室并用5%BSA和1%生物素-BSA的混合物钝化表面（参见步骤8.2）。
- 用F缓冲液冲洗通道3（ 高流量3下2分钟）。在F缓冲液中注入10μg/ mL纽曲维丁（ 高流量3下4分钟）。
- 将试管更换为：
通道1：10 nM生物素 -明胶（表1）。
通道 2：F 缓冲器。
通道 3：0.4 μM 预聚 F-肌动蛋白。 - 使用 “高流量全部” 设置将所有溶液一起注射3分钟。
- 将整个腔室暴露于明胶（中流1，30秒）。
- 将细丝附着在表面上（低流量3：通道3在3毫巴，通道1和2在〜2毫巴，约2分钟）。
- [可选]如果灯丝密度太低，请重复步骤9.5.6和9.5.7。
- 尖端解聚：开始采集（1帧/30秒，落射荧光）。1-2 帧后，仅将灯丝暴露在缓冲液 中，即中流 2。细丝应在0.2亚/秒左右解聚。
10. ADF/共纤维蛋白诱导的细丝束形成和拆卸
注意：要形成肌动蛋白细丝束，请确保在腔室表面具有足够高的细丝种子密度。当暴露于迷素蛋白时，横向波动的邻近细丝将被附着素蛋白动态交联。由于迷链迅速从灯丝侧19解绑，因此迷链必须不断存在于主流动溶液中，以保持灯丝捆绑。
- 按照步骤 8.1-8.3 操作。
- 准备以下溶液（200-300μL在F缓冲液中）：
通道1，聚合溶液：1 μM 10% Alexa-488标记G-肌动蛋白，1 μM脯蛋白。
通道2，捆绑溶液：200 nM迷霉素（表1），0.15μM 10%Alexa-488标记G-肌动蛋白。
通道 3，拆卸溶液：200 nM ADF/cofilin（表 1），100 nM 挂型，0.15 μM 10% Alexa-488 标记 G-肌动蛋白。 - 更换试管 1 至 3（第 7 节）。使用 “高流量全部” 预设进行注射，持续 3-4 分钟。
- 灯丝聚合：将压力设置设置为 中流1 约10分钟。聚合可以用TIRF成像。
- 灯丝捆绑（图4C）：开始图像采集（1帧/5秒，落射荧光）。1-2帧后，将压力设置设置为 中流2 ，并观察灯丝捆绑。
- 束碎片：开始图像采集（1帧/5秒，落射荧光）。在1-2个框架之后，将压力设置设置为 中流3 ，并观察cofilin诱导的单个细丝和束的拆卸。
11. 微流控装置清洗程序
注意：为避免从一个实验到另一个实验的任何污染，在每次实验后广泛清洁并完全干燥所有管道和流量计至关重要。
- 断开所有管路与 PDMS 腔室的连接，然后丢弃腔室。
- 要清洁PEEK管路和流量计，请将管子末端用胶带固定在空的15 mL塑料管中，并在最大压力下注入以下溶液，直到储液槽几乎为空：
400 μL F缓冲液。
400微升0.5 M萘乙酸钠。
400 μL 纯水。
200μL异丙醇。 - 更换为空储液罐并吹气，直到管道完全干燥（约2-4分钟，最大压力）。
12. 图像分析
注意：虽然本文重点介绍了在微流体中组装，操作和可视化单个肌动蛋白丝的方法，但此处提供了分析所采集电影的简要方法。分析是使用ImageJ对16位图像执行的，如第8节所示。
- 图像处理是最小的：
- 导入聚合或解聚图像堆栈。
- [可选]使用功能 减去背景 均匀化图像强度（默认设置（即“滚动球半径”= 50像素））。如果背景荧光在电影放映过程中发生变化，或者如果荧光照明在视场上不均匀，则此功能特别有用。
- 调整亮度和对比度（背景接近零，灯丝接近最大值）。
- 创建灯丝闭表：
- 选择不会暂停、断裂或分离的灯丝。否则，请勿根据行为进行选择。在上面绘制一条 1-2 像素的线（直线工具）。保存灯丝编号（在 ROI 管理器中添加）。
- 应用函数 “复刻” （切片计数：5 像素）。计算最大强度（函数 Z 投影）。
- 测量聚合/解聚速率：
- 在基蚊仪上，沿着细丝倒钩端画一条线（直线 工具， 图4A）。测量线宽和线高（功能 测量）。
- 在多个灯丝上重复步骤12.2-12.3。计算聚合/解聚速率（图4A）：
，其中 v 是速率（以子/秒为单位）， w 是线宽（像素）， 像素 大小是像素大小 （nm）， h 是行高（帧）， dt 是帧之间的时间（以秒为单位）。在这里，2.7nm对应于肌动蛋白亚基对灯丝长度的有效贡献。
，其中 v 是速率（以子/秒为单位）， w 是线宽（像素）， 像素 大小是像素大小 （nm）， h 是行高（帧）， dt 是帧之间的时间（以秒为单位）。在这里，2.7nm对应于肌动蛋白亚基对灯丝长度的有效贡献。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
对于上述所有实验，荧光标记的肌动蛋白丝应清晰可见，具有良好的对比度，表明表面的背景荧光较低（图4，请参阅 补充文件1 以解决常见问题）。肌动蛋白细丝也不应粘附在表面上：当显性流速较低时，当观察它们活着时，肌动蛋白丝的横向波动应该是可感知的，并允许人们清楚地确定它们仅由其末端之一锚定。同样，当使用TIRF成像时，它们的垂直波动应该通过其长度和时间的强度变化可见。根据施加的流速，可能需要调整TIRF穿透深度，以优化TIRF获取的肌动蛋白丝的图像质量。
当长丝暴露于聚合条件（见第8节）时，长丝伸长率应规则（即，细丝末端的伸长率不受表面相互作用或永久粘附的阻碍）。此外，根据管内肌动蛋白浓度1，20测量的细丝倒钩端伸长率应与预期值相匹配，表明管溶液已正确流向微流控室（图4A）。同样，当暴露于缓冲溶液中时，灯丝应以反映其ADP含量4的速率稳定解聚（图4A）。当将已经生长的肌动蛋白细丝暴露于荧光标记的科菲林溶液中时，科菲林簇将被成核并以依赖于科菲林浓度的速率向尖端和倒钩端生长（图4B）。当评估ABP的潜在交联活性时，例如迷霉素（图4C），形成束的近距离肌动蛋白细丝将很容易通过其较高的荧光强度和横向波动的变化来检测。
液体流动对锚定在微流体室表面的肌动蛋白细丝施加粘性摩擦力。F-肌动蛋白上的摩擦力系数η = 6.10-4 pN·s/μm2，以每根细丝微米长度14表示。在中间流速下，当灯丝高度在表面上方250 nm的恒定平均值附近波动时，从自由浮动端到灯丝锚定点存在力梯度。因此，可以使用F = 6ηπLv计算沿灯丝任何点的施加张力，其中v是表面上方250 nm的局部流速（图1B），L是下游灯丝段长度（即从考虑的点到自由端）。对于较高的流速，灯丝平均高度不是恒定的，而是从锚定点到自由端线性增加，平均保持在250nm以下，并且将根据流速而变化，从而导致沿灯丝21的更复杂的张力分布。
图 4：具有代表性的结果。在典型的实验中，肌动蛋白细丝从光谱蛋白 - 肌动蛋白种子聚合并暴露于不同的ABP。 为了清楚起见，仅显示视野的一小部分。（A） 基本聚合-解聚实验的结果（第8节）。将长丝与0.8μM 10%Alexa-488标记的G-肌动蛋白溶液聚合，陈化15分钟以将所有亚基转化为ADP-肌动蛋白（未显示），并且仅在暴露于F缓冲液时解聚。底部：用于量化聚合和解聚速率的缩影图。在1帧/5秒，200 ms曝光时间，150 mW 488 nm激光器（9%功率下）TIRF（激光穿透深度250 nm）下采集。（B）单个肌动蛋白丝被500 nM m樱桃 - 共纤啉-1碎裂。肌动蛋白被标记为ATP-ATTO48822 （黄色），而科菲林-1与樱桃（蓝色）融合。顶部：视野的分数。注意：蛋白质聚集在表面上。底部：显示共纤林-1与灯丝结合的缩影图（箭头显示共纤林-1结构域成核事件），导致碎裂事件（闪电符号）。在 1 帧/4 秒、200 ms 曝光、150 mW 488 nm 激光（16%） 和 100 mW 561 nm 激光（12% 功率）下采集，落射荧光。（C） 用迷链捆绑肌动蛋白丝（第10.5节）。首先将长丝与0.8 μM 5%标记的G-肌动蛋白Alexa-488聚合，并与200 nM迷霉素捆绑。与单丝相比，灯丝束看起来亮度高出两到三倍，并且与流动不完全对齐。在1帧/10秒，200 ms曝光，20%200 W汞灯强度，落射荧光下采集。（自动对照）背景是用ImageJ的临时功能减去的。 请点击此处查看此图的大图。
| 蛋白质名称 | 物种 | 单倍引用（序列） | 原始纯化方案参考 | 评论 |
| 肌动蛋白 | 兔 | P68135 （全长） | 23 | 有关荧光标记，请参见参考文献 24 |
| 普罗菲林1 | 人 | P07737 （全长） | 25 | 另见参考文献 11 |
| 光谱蛋白-肌动蛋白种子 | 人 | 不适用 | 26, 27 | 另见参考文献 11 |
| 科菲林1 | 鼠 | P18760 （全长） | 28 | |
| 明胶 | 人 | P06396 （全长） | 29 | |
| 米迪亚1福明 | 鼠 | O08808 （aa 552–1255） | 13 | 参考文献 24 中更详细的实验方案 |
| 迷恋1 | 人 | Q16658 （全长） | 30 |
表1：肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白23，24，25，26，27，28，29，30
| 试剂 | 浓度 |
| 三盐酸 pH 值 7.4 | 5 米 |
| 氯化钾 | 50 米 |
| 氯化镁 | 1 百万 |
| 埃格塔 | 0.2 米 |
| 断续器 | 0.2 米 |
| 断续器 | 10 百万 |
| 达布科 | 1 百万 |
表2：F缓冲液组成。 DABCO和相对高浓度的DTT用于限制荧光显微镜实验期间由于光暴露而对灯丝的光诱导损伤。
| 设置名称 | 压力（毫巴） | 流量（无升/分钟） |
| 最大压力 | 300 | ~ 30 000 （在主频道中） |
| 高压 | 150 | ~ 15 000 （在主频道中） |
| 中压 | 12 | ~ 1500 （在主通道中） |
| “改变”压力 | 12 个用于所有入口， 5 个插座 |
~ 500 （在每个入口中） |
表 3：施加压力与测量流速之间的对应关系。 由此产生的流速很大程度上取决于实验设置。给出了具有1 cm长的主通道，横截面为20μm x 800μm（高x宽）的微流体室的值，该储液槽与每个储液槽相连，具有80 cm长的PEEK管。
补充文件1：经典问题，原因和解决方案。 他们在使用微流体和/或单个肌动蛋白细丝时经常遇到问题。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
与标准的单丝方法相比，肌动蛋白细丝沿其长度通过多个点锚定在表面上或通过甲基纤维素等拥挤剂保持靠近表面，微流体具有许多优点。由于与表面的相互作用很小，因此避免了在伸长和解聚过程中这些相互作用可能引起的人为停顿。灯丝按流动对齐，彼此平行，便于监控和测量长度。细丝周围的溶液不断更新，使它们暴露于恒定的蛋白质浓度。能够在细丝暴露的不同蛋白质溶液之间快速（<1秒， 图3D，E）切换，可以进行时间控制的序贯实验，这通常有助于动力学研究。最后，可以利用流动溶液对灯丝施加的粘性阻力，在灯丝上施加受控的机械应力（代表性结果部分）。应该注意的是，中等流体流动（中流 压力设置）使细丝足够接近表面（〜250nm），以便用TIRF有效地成像它们，同时产生最小的张力（<1 pN）14。
然而，与经典的单丝测定相比，微流体将需要更大体积的蛋白质溶液：通常为几100μL，而标准实验可以用少于10μL完成。当使用珍贵的蛋白质时，这可能是一个限制。经典实验可用于在开始一系列微流体实验之前帮助建立相关的实验条件（例如，不同蛋白质的绝对或相对浓度）。与体外的任何其他单丝技术一样，另一个限制来自盖玻片表面的不完全钝化。盖玻片清洁和钝化层结合（BSA，PEGY化等）的再现性总是难以控制。基于PEG-硅烷表面处理的一步式钝化技术已成为许多实验室的首选技术7，15。因此，长丝种子的有效密度在实验之间可能会有大约两倍的差异，即使尽可能准确地重复也是如此。人们应该瞄准一个令人满意的灯丝表面密度范围，并准备在需要时重复实验。在处理微流体和/或单个肌动蛋白丝时遇到的常见问题在补充文件1中讨论。
对于这里介绍的基本方案，应该注意光谱蛋白 - 肌动蛋白种子，可以被视为短的稳定细丝，当它们粘附在表面上时是随机定向的。因此，当从这些种子生长的细丝与流动对齐时，它们最接近种子的部分将被急剧弯曲，每个都有自己的角度。当灯丝暴露于中流或高流量时，细丝弯曲的长度通常非常小。事实上，这个长度通常小于衍射极限（~200nm），因此不容易被检测到。重要的是，对灯丝曲率敏感的ABP将在这个高度弯曲的区域以不同的方式结合和功能。为避免结果偏倚，最简单的方法是从分析21中排除该区域。
在我们开始使用微流体来操纵和可视化单个肌动蛋白丝之前，它已经用于研究单个DNA细丝3，它们更加灵活。这可能会产生显着的差异，因为流动可以显着地展开DNA并显着改变其表观长度。微流体也可用于研究微管，与此处介绍的方法非常相似;它们更硬，但仍然可以与流动对齐，以便利用条件31，32的快速切换来测量它们的伸长率和解聚性，或者通过垂直流动弯曲以测量微管可塑性7。
我们在这里介绍了基本实验的协议，其中细丝仅由一端锚定，并且在整个实验过程中视野中的流动方向相同。这两个特征可以改变。例如，细丝可以由多个点锚定，以便沿细丝产生不同的力分布。同样，流动方向可以改变（在入口通道之间的连接处附近，在流动室中）以局部弯曲细丝，因为未固定的部分将指向与锚定细丝段21不同的方向。从随机锚定的光谱蛋白 - 肌动蛋白种子中伸长的细丝也可以暴露于交联蛋白以形成束33 （见第10节）。通过将微流体与其他技术（微图案化，光学镊子等）相结合或设计具有隔室的微流体室以修改流线，可以创建多种配置以研究单个细丝上的特定ABP活性或形成小型肌动蛋白网络34。组合的数量，加上微流体的优势和多功能性，为研究人员提供了许多工具，以便破译分子尺度上肌动蛋白网络的时空调节。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢拉杜克斯和拉多姆。梅格实验室使用他们的紫外线清洁设备，以及J.休文和0。du Roure接受的关于在硅晶圆上准备模具的初步培训，并提供有关微流体的提示。我们感谢欧洲研究理事会拨款StG-679116（授予AJ）和国家研究基金的资助，以资助肌肉酸和顺应蛋白（授予G.R.-L.）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Casein | Merck | C6905 | Used at 8 mg/mL |
| Biopsy punch (with plunger) | Ted Pella | 15115-2 | ID 0.75 mm, OD 1.07 mm |
| Biotin-BSA | Merck | A8549 | Used at 1 mg/mL |
| BSA | Merck | A8022 | Used at 50 mg/mL |
| Coverslip Mini-Rack Teflon holder |
Invitrogen | C14784 | for 8 coverslips |
| Coverslips 22x40mm Thickness #1.5 |
Menzel Gläser | 631-1370 | |
| DABCO | Merck | D27802 | component in f-buffer |
| DTT | Euromedex | EU0006-D | component in f-buffer |
| Ester NHS Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | Fluorophore for actin labeling on Lys328. |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21338 | To biotinylate actin on Lys328 |
| Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | Glass cleaning detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | open source software |
| Laboport | KNF | 811kn.18 | vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar) |
| Magic invisible tape | Scotch | 7100024666 | standard transparent office tape |
| Micrewtube | Simport | T341-6T | 2 mL microfluidic reservoir tubes |
| Microfluidic device Part 1: Flow Unit S | Fluigent | FLU-S-D-PCKB | Flowmeter |
| Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL | Fluigent | 14002001PCK | Reservoir holder |
| Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ | Fluigent | EZ-11000001 EZ-00345001 |
Pressure controller |
| Model 42 - UVO-Cleaner | Jelight Inc. | 42-220 | Ultraviolet cleaner |
| N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 | Jena Bioscience | NU-805-488 | ATP-ATTO used to label actin |
| neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| PLL-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | Use at 1 mg/mL in PBS. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer | Dow Corning | 1673921 | Contains PDMS base and curing agent |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing | Merck | Z226661 | “Blue” : I.D. = 0.25 mm |
| Safety blow gun | Coilhose Pneumatics | 700-S | filtered air |
| Silicon tubing | VWR | 228-0701P | connect PEEK to coupler |
| Stainless steel catheter coupler | Prime Bioscience | SC22/15 | Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing |
| Thermoplastic film | Sigma Aldrich | PM996 | Standard "parafilm" |
| Ultrapure ethanol | VWR | 64-17-5 | |
| Ultrasonic cleaning bath | VWR | USC200TH | To accomodate 1 L beakers |
| Vacuum dessicator | SP Bel-Art | F42022-0000 | to degas the PDMS or solutions |
References
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