Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Bruke mikrofluidikk og fluorescensmikroskopi til å studere monteringsdynamikken til enkelt actinfilamenter og bunter

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63891
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université Paris Cité, CNRS, Institut Jacques Monod

Summary

Vi presenterer protokoller for enkle aktinfilamentmikrofluidiske analyser, i kombinasjon med fluorescensmikroskopi, som gjør det mulig for en å nøyaktig overvåke individuelle aktinfilamenter i sanntid mens man sekvensielt utsetter dem for forskjellige proteinløsninger.

Abstract

For å dechiffrere de komplekse molekylære mekanismene som regulerer montering og demontering av aktinfilamenter, er det en stor ressurs å overvåke individuelle reaksjoner lever i godt kontrollerte forhold. For å gjøre det har levende enkeltfilamenteksperimenter dukket opp de siste 20 årene, for det meste ved hjelp av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi, og har gitt en trove av viktige resultater. I 2011, for å ytterligere utvide mulighetene for disse eksperimentene og for å unngå tilbakevendende problematiske artefakter, introduserte vi enkel mikrofluidikk i disse analysene. Denne studien beskriver vår grunnleggende protokoll, der individuelle aktinfilamenter er forankret i den ene enden til den passiverte coverlipoverflaten, samsvarer med strømmen, og kan etterfølgende eksponeres for forskjellige proteinløsninger. Vi presenterer også protokollene for spesifikke applikasjoner og forklarer hvordan kontrollerte mekaniske krefter kan brukes, takket være den viskøse dra av den flytende løsningen. Vi fremhever de tekniske forbeholdene til disse eksperimentene og presenterer kort mulige utviklinger basert på denne teknikken. Disse protokollene og forklaringene, sammen med dagens tilgjengelighet av brukervennlig mikrofluidikkutstyr, bør tillate ikke-spesialister å implementere denne analysen i laboratoriene sine.

Introduction

Montering og demontering av aktinfilamenter og aktinfilamentnettverk styres av flere biokjemiske reaksjoner og avhenger av den mekaniske konteksten. For å få innsikt i disse komplekse mekanismene er det uvurderlig å kunne observere individuelle reaksjoner på individuelle filamenter (i tilstrekkelig store antall). I løpet av de siste tiårene har observasjonen av dynamiske aktinfilamenter i sanntid, for det meste ved hjelp av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi, dukket opp som en nøkkelteknikk og har gitt en imponerende liste over resultater som ikke kunne ha blitt oppnådd med bulkløsning biokjemiske analyser1.

For å oppnå dette må man opprettholde fluorescerende merkede aktinfilamenter nær overflaten av mikroskopdekslene mens man utsetter dem for løsninger av aktinbindende proteiner (ABPer), som også kan merkes fluorescerende. Dette gir et middel til å overvåke hendelser som finner sted på individuelle filamenter under godt kontrollerte biokjemiske forhold, og dermed kvantifisere reaksjonshastigheter. En rekke spesifikke begrensninger bør imidlertid vurderes. Kunstig vedlikehold av filamenter nær overflaten, ofte takket være flere forankringspunkter eller ved å bruke et trengselmiddel som metylcellulose, kan endre deres oppførsel (f.eks. forårsaker pauser i polymerisasjonen og depolymerisering2). Det kan være utfordrende å spore konturen til hver filament, spesielt hvis nye filamenter eller filamentfragmenter akkumuleres innen synsfeltet over tid. Reaksjonene skjer i et begrenset volum der konsentrasjonen av aktinmonomerer og ABPer kan variere over tid, noe som potensielt gjør det vanskelig å utlede nøyaktige hastighetskonstanter. Endelig er det vanskelig å fornye eller endre løsningen av ABPer på mindre enn 30 s og vil ofte føre til inhomogent proteininnhold i prøven.

For litt over 10 år siden, inspirert av det som allerede var gjort for å studere individuelle Deoxyribonucleic Acid (DNA) tråder3, introduserte vi en ny teknikk basert på mikrofluidikk for å observere og manipulere individuelle aktinfilamenter4. Det gjør det mulig å omgå de nevnte begrensningene i klassiske enkeltfilamentteknikker. I disse mikrofluidikkanalysene dyrkes aktinfilamenter fra spektrrin-aktinfrø adsorbert på dekslene. Filamenter er dermed forankret i den ene enden bare til bunnen av mikrofluidisk kammer og svinger over overflaten uten å stikke. Filamenter samsvarer med strømmen av innkommende løsninger, og letter dermed overvåkingen av konturlengden og opprettholder dem i et grunt område over dekslene der TIRF kan brukes. Ulike løsninger strømmes samtidig inn i kammeret uten blanding, og filamentene kan eksponeres for dem sekvensielt og raskt.

Her foreslår vi en rekke grunnleggende protokoller for å sette opp mikrofluidikkanalyser i laboratoriet. Deksler og mikrofluidikkkamre kan tilberedes på forhånd (på en halv dag), og selve eksperimentet, hvor flere biokjemiske forhold kan testes, gjøres på mindre enn en dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikrofluidisk kammerpreparat

  1. Velg en SU-8 master mold med flere kammermønstre. Typiske kamre er kryssformede med tre viker og ett uttak, 20 μm høyt og 800 μm bredt (figur 1). Slike masterformer kan kjøpes fra eksterne selskaper eller gjøres i akademiske laboratorier (f.eks. Gicquel, Y. et al.5).
  2. Plasser tape rundt kanten av formen.
    1. Sett ~50 cm lang, 19 mm bred, standard gjennomsiktig kontortape (se Materialbord) på en benk, klebrig side opp. Plasser formen vertikalt i den ene enden og langs midtlinjen av båndet.
    2. Rull formen til den andre enden av båndet for å lage en 1 cm kant rundt formen. Brett ned båndet over bunnen av formen.
  3. Forbered polydimetylsiloksan (PDMS) oppløsning.
    1. I en engangsveiefat helles direkte 25-30 g PDMS-base (Materialbord). Tilsett 10 % vekt/vekt PDMS herdemiddel (Materialliste) med en pasteurpipette av engangsplast.
    2. Bland manuelt og grundig med en plastpinne. Forsikre deg om at herdemiddelet er godt innlemmet i PDMS-basen, selv om om omrøring skaper mange bobler.
  4. Degas PDMS-oppløsningen i en vakuumdesiccator (Materialbord) i minst 5 minutter ved romtemperatur (RT). Bobler vil ekspandere, stige til overflaten og briste når vakuumet er ødelagt.
  5. Hell PDMS-løsningen over SU-8-formen. Bruk en plastpinne til å skrape og overføre så mye av blandingen som mulig.
  6. Degas PDMS for andre gang (5 min i vakuumdesiccator). Pass på å kvitte seg med de fleste bobler (noen få små bobler på toppoverflaten er fine).
  7. Plasser formen i en ovn ved 70 °C i minst 5 timer for at PDMS skal retikulere og størkne.
  8. Fjern faste PDMS-kamre fra formen.
    FORSIKTIG: Silisiumskiver for SU-8-former er ekstremt skjøre, så det må utvises stor forsiktighet ved separering av PDMS fra wafere. Arbeid på en hard, flat overflate og hold skiven flatt på overflaten.
    1. Med et barberblad, lag et sirkulært kutt i PDMS, ca 1 cm fra kanten av formen. Alle mønstre må være minst 0,5 cm inne i kuttet. Skrell forsiktig av den sentrale PDMS-blokken med milde slepebåter.
      FORSIKTIG: Når du skreller av, må du holde SU-8-formen flatt på benken for å unngå å bryte den.
    2. Plasser PDMS på ren aluminiumsfolie, den støpte overflaten mot aluminiumsfolien, for å beskytte overflaten mot støv og for å gjøre mønstrene mer synlige.
  9. Velg og kutt et kammer med et barberblad minst 0,5 cm fra mønsteret. Den resulterende PDMS-blokken er rundt 0,5 cm høy, 1,5 cm bred og 3 cm lang. Pierce tre viker og ett uttak med en biopsi punch 0,75 mm I.D. (Tabell over materialer).
  10. Rengjør PDMS-kammeret med ultrarent etanol (materialbord) og lufttørk ved hjelp av en sikkerhetsblåser (Materialbord). Plasser PDMS med mønsteret vendt opp i en ren Petri-tallerken, og lukk parabolen med lokket.

2. Glassdekslerlip rengjøring

MERK: Her er en standard coverlip rengjøringsprosedyre, basert på en rekke sonikeringstrinn, detaljert. Andre glassdekslerlip-rengjøringsprosedyrer er beskrevet i mange andre publikasjoner som kan oppnå tilsvarende tilfredsstillende resultater 6,7,8,9.

  1. Plasser 10-20 deksler (40 mm lange) på en Polytetrafluoreetylenholder (PTFE). Soniker dekslene i 0,5 L 2% glassrengjøringsløsning (Materialbord) i et 1 L glassbeger (35 °C, 30 min).
  2. Kast glassrengjøringsløsningen og skyll dekslene grundig med dH2O i minst tre påfølgende 0,5 L bad.
  3. Forbered 0,5 L 2 M KOH i et 1 L glassbeger. Soniker dekslene i KOH (RT, 30 min). Kast KOH og skyll dekslene med dH2O i minst tre 0,5 L bad.
    FORSIKTIG: Bruk egnet sikkerhetsbeskyttelsesutstyr for laboratoriet (hansker, briller og labfrakk).
  4. Overfør og soniker dekslene i 0,5 L ultrarent etanol (RT, 30 min). Deksler kan holdes i etanol i opptil 2 uker. Lukk begeret med termoplastisk film (Materialbord) for å forhindre fordampning. Tørk dekslene med luftstrøm før bruk.

3. MONTERING AV PDMS-kammer

  1. Forvarm varmeplaten til 100 °C. Legg opptil tre rensede PDMS-kamre og glassdeksler i en ren Petri-tallerken. Plasser den åpne Petri-retten i en dyp Ultrafiolett (UV) rengjøringsmiddel (λ = 185 nm, se Materialbord) og utsett den for UV-lys i 3-5 min.
    MERK: Alternativt kan PDMS-kamre og deksler bli utsatt for luft- eller oksygenplasma i 30 s.
  2. Plasser PDMS-kammeret forsiktig over dekslene. Pass på at de to overflatene som ble satt i kontakt ble direkte eksponert for UV. PDMS fester seg automatisk til glasset og kammeret blir godt synlig.
  3. For å fjerne all luft som sitter fast i PDMS-coverlip-grensesnittet, trykker du forsiktig på overflaten med en finger. For en strammere binding, trykk sterkere over hjørner og sider. Pass på at taket på kammeret ikke kommer i kontakt med glassoverflaten.
  4. Plasser kammeret med glassbunnen vendt mot varmeplaten ved 100 °C i 5 minutter. Etter dette trinnet blir glass-PDMS-bindingene permanente, og kamre kan bare brukes en gang. Bruk kammeret umiddelbart eller oppbevar det i en ren Petri-tallerken i opptil en uke.

4. [VALGFRITT] Direkte passivisering og funksjonalisering

MERK: Avhengig av bruksområdet kan kamrene passiviseres og funksjonaliseres enten når de er koblet til den mikrofluidiske kontrollenheten (se Materialfortegnelse) eller ved å injisere løsninger manuelt direkte inn i kammeret med en pipette før den kobles til den mikrofluidiske enheten. Sistnevnte gir fordelen av å konsumere mindre reagens og unngå potensiell forurensning ved å strømme løsningen gjennom polyeter eter keton (PEEK) rør av mikrofluidisk enhet. I alle de følgende trinnene injiseres løsninger ved å stikke pipettespissen direkte inn i stikkontakten. For å unngå å lage bobler inne i kammeret, må du sørge for å ha en liten dråpe som stikker ut av pipettespissen når du kobler spissen til utløpet av PDMS-kammeret. På samme måte fjerner du pipettespissen før hele volumet er injisert.

  1. Injiser 20 μL PLL-PEG (1 mg/ml i fosfatbufret saltvann (PBS)). Inkuber i minst 1 time (eller over natten) på RT. For å unngå fordampning, plasser PDMS-kammeret i en fuktig boks (f.eks. en tom spissboks med vann i det nedre rommet og PDMS-kammeret på spissplattformen).
  2. Injiser 20 μL 100 pM spektrin-aktinfrø (i F-buffer, se tabell 1 og tabell 2). Vent ikke mer enn 1 min. Juster frøkonsentrasjonen og timingen for å justere frøoverflatetettheten, høy nok til stor statistikk og lav nok til at filamenter ikke overlapper.
    MERK: Alternativt, hvis spectrin-aktinfrø ikke er tilgjengelige, bruk biotin-funksjonaliserte korte filamentsegmenter som vil bli immobilisert på en streptavidin-belagt dekslelip 9,10.
  3. [VALGFRITT] Injiser 20 μL 5 % bovint serumalbumin (BSA) i F-buffer. La på RT i 10 min.
  4. [VALGFRITT] Injiser 20 μL 1 mg/ml β-kasein i F-buffer. La på RT i 10 min.
    MERK: Følg trinn 4.3 og/eller 4.4 for å passivisere kammeret ytterligere. Valget av passivisering avhenger av proteinene som brukes og fungerer ikke like bra på alle ABPer. Ved bruk av aktin alene er PLL-PEG eller BSA tilstrekkelig.

5. Koble til mikrofluidisk enhet

MERK: Bruk et trykkbasert mikrofluidisk system med opptil fire kanaler for å kontrollere strømmer i det mikrofluidiske kammeret (figur 1A, se materialtabell). For å unngå bobler som dannes i mikrofluidisk rør og perturbing strømningsstabilitet, degas alle løsninger. Plasser 5 ml dH20 og 10 ml F-bufferlager i en vakuumdesiccator koblet til en vakuumpumpe (ultimate vakuum <250 mbar) og degas i minst 1 time ved RT.

  1. Skyll innløp + utløpsslanger med dH2O (500 μL, 300 mbar).
  2. Fyll alle 2 ml reservoarrør (se Materialtabell) med 300 μL F-buffer. Sett trykket til 300 mbar og la fem til åtte dråper gå til spille. Gjenta for hver kanal og sett trykket til 0.
  3. Koble til utløpet og skyll kammeret mye.
    1. Still trykket for reservoarrøret 4 (utløp) på 50 mbar. Når en dråpe kommer ut fra slangeenden, kobler du slangen til utløpet av PDMS-kammeret. Væsken fyller kammeret og kommer ut av alle innløp.
    2. [VALGFRITT] Hvis kammeret har blitt direkte passivert (avsnitt 4), sett trykket til 100 mbar for å skylle kammeret med 50-100 μL F-buffer (3-5 min). Fjern overflødig væske ved innløp med et rengjøringsvev.
    3. Sett trykket til 20 mbar.
  4. Koble til innløp.
    1. Still inn trykket for reservoarrøret 1 til 50 mbar. For å unngå å introdusere luftbobler, må du sørge for at en dråpe kommer ut av slangen og PDMS-innløpet.
    2. Koble slangen til innløp 1 (de to dråpene slås sammen ved tilkobling). Sett trykket på 30 mbar.
    3. Gjenta trinn 5.4.1-5.4.2 for å koble til innløp 2 og 3.
  5. Sett trykket på alle innløp til 20 mbar og utløpstrykket til 0 mbar. Kontroller at strømningshastighetene i innløpene er omtrent like (se feilsøkingsdelen).

Figure 1
Figur 1: Injisere løsninger gjennom et mikrofluidisk kammer. (A) Standard mikrofluidisk oppsett for enkeltaksjefilamenteksperimenter. Proteinløsninger, plassert i reservoar 1-3, skyves inn i kammeret ved å justere trykket i gassfasen. De genererte strømningshastighetene måles av strømningsmålere. Inne i de mikrofluidiske kamrene blander og opptar ikke løsninger plass avhengig av det relative trykket som påføres (her, lik trykk på alle innløp). Typiske dimensjoner: reservoarrør inneholder opptil 2 ml løsning. PEEK-slangen (0,25 mm indre diameter) kobler reservoarene til strømningsmålerne (etter 10 cm rør) og deretter til PDMS-kammeret (etter ytterligere 70 cm). Silisiumrør og slangekoblinger i rustfritt stål brukes til å koble PEEK-slangen til PDMS-innløpene. Den viktigste mikrofluidiske kanalen er 20-60 μm høy, rundt 1 mm bred og 1 cm lang. (B,C) Strømningsprofiler inne i mikrofluidisk kammer. (B) Væsken genererer en parabolsk profil over kammerhøyden: v(z) = 6z(h-z)R/h3w, hvor t og w er kammerhøyden og -bredden, og R er den totale strømningshastigheten. Bunn: Enkelt aktinfilament polymerisert fra overflateforankret spektrin-aktinfrø. (C) Når kammerbredden er betydelig større enn høyden, er strømmen nesten jevn over kammeret, bortsett fra på PDMS-overflatene, hvor den går til null. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

6. Konfigurere oppsettet med standard strømningshastigheter

MERK: Det datastyrte trykksystemet gjør det enkelt og presist justering av trykket til alle innløp/uttak som er koblet til PDMS-kammeret, og dermed kontroll av innkommende og utgående strømningshastigheter. Forhåndsinnstilte konfigurasjoner kan lagres og slås på/av med ett enkelt museklikk. Nedenfor er de anbefalte konfigurasjonene (med mindre annet er oppgitt, er utløpstrykket satt til 0 mbar). Se tabell 3 for forventede strømningshastigheter for disse forhåndsinnstilte konfigurasjonene. Trykket som er angitt her, må justeres avhengig av kammergeometrien og systemkonfigurasjonen.

  1. Endring: Bruk denne forhåndsinnstillingen når du endrer ett eller flere reservoar(er). Det skaper en mild bakoverstrømning i slangen av interesse for å forhindre at bobler introduseres.
    1. Sett alle innløpstrykk til 12 mbar og utløpstrykk til 5 mbar (figur 2B).
  2. High Flow 'All': Bruk denne forhåndsinnstillingen til raskt å injisere tre løsninger parallelt. De vil nå kammeret innen 4 min.
    1. Sett alle innløpstrykk til 150 mbar.
  3. High Flow 'x': Bruk denne forhåndsinnstillingen til raskt å injisere en løsning. Det vil nå kammeret innen 3 min (figur 3A-C).
    1. Sett innløpstrykket 'x' til 150 mbar (~15 μL/min). Trykket i de andre innløpene er justert til rundt 100 mbar, slik at den resulterende strømningshastigheten i disse innløpene er ~ 500 nL / min.
  4. Mid Flow 'All': Bruk denne forhåndsinnstillingen til å sette systemet på pause.
    1. Sett alle innløpene til 20 mbar (figur 2A).
  5. Mid Flow 'x': Bruk denne forhåndsinnstillingen til å la løsningen 'x' fylle ut det meste av hovedkanalbredden (se figur 2C, D), samtidig som du begrenser de andre innløpsløsningene til kanalsidene. Aktinfilamenter i kammeret vil dermed bli utsatt for den biokjemiske tilstanden som bare pålegges av løsning 'x'.
    1. Sett innløpstrykket "x" til 12 mbar. Still trykket i de andre innløpene og juster til ~ 9 mbar, slik at deres respektive strømningshastigheter er ~ 150 nL / min.

Figure 2
Figur 2: Trykket som påføres hvert reservoar styrer skilleveggen/romlig fordeling av løsninger inne i mikrofluidisk kammer. (A) Med likt trykk på reservoarene opptar hver løsning en tredjedel av kammeret. (B) Ved bytte av reservoarrør (her reservoar 3) faller det effektive trykket ned til null, noe som skaper en bakoverstrømning. (C,D) Hvis du øker det relative trykket på et av reservoarene, kan glassoverflaten bli eksponert for én enkelt løsning. Synsfeltet midt i kammeret kan ses sekvensielt på løsning 1 og 2 ved å veksle mellom konfigurasjon Mid Flow 1 (C) og Mid Flow 2 (D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

7. Endre løsning 'x'

MERK: Som vist i figur 3A-C er det viktig å huske på at det tar minutter å strømme fra et reservoarrør til hovedkanalen i kammeret. Denne minimale "døde" tiden pålegges av væskevolumet i slangen og strømningsprofilen i slangen (figur 3A-C).

  1. Forbered 200-300 μL oppløsning i et nytt reservoarrør. Still inn trykket på Endre innstilling (se avsnitt 6).
  2. Skru av reservoarrøret til innløpet 'x'. Løsningen i slangen vil sakte strømme bakover, fra kammeret til den frie slangespissen. Den målte strømningshastigheten blir negativ (figur 2B).
  3. Når en liten dråpe har dannet seg på slangespissen, skru inn det nye røret med den friske løsningen. Når røret er riktig strammet til trykksystemet, går innløpets strømningshastighet tilbake til positivt.
  4. Sett trykkinnstillingen til Høystrøm 'x'.
  5. Avhengig av mikrofluidisk konfigurasjon og kammergeometri, vent i 3-5 min for at løsningen skal fylle ut slangen og nå kammeret fullt ut.
  6. [VALGFRITT] Følg denne prosessen ved å måle økningen i fluorescens over tid (figur 3C).

Figure 3
Figur 3: Forsinket ankomst av løsninger fra reservoarene til PDMS-kammeret og rask endring av biokjemiske forhold. (A-C) Forsinket ankomst av løsninger fra reservoarene til PDMS-kammeret. (A) Avhengig av kammergeometrien, rørlengden og det påførte trykket ved innløpet(e), er erstatning av en løsning av en annen ikke øyeblikkelig. Etter å ha endret reservoarrøret til en som inneholder en fluorescerende løsning (0 min), fyller løsningen gradvis slangen (0,4 min) og PDMS-kammeret (1-2 min). Veiledende timing er gitt for et 150 mbar påført trykk, 80 cm PEEK-rør og et 1600 μm bredt, 20 μm høyt PDMS-kammer. (B) Den parabolske strømningsprofilen inne i PEEK-slangen genererer en effektiv gradient av fluorescens langs rørradiialprofilen og inne i kammeret (se også figur 1B). (C) Forsinket ankomst av løsninger kan kvantifiseres ved å måle bakgrunnseeporescenssignalet i kammeret som en funksjon av tid. Eksperimentelle forhold: 0,5 μM 10% Alexa-568-merket G-aktin injiseres med 150 mbar gjennom en strømningsmåler og 80 cm PEEK-rør. (D,E) Rask endring av biokjemiske forhold. (D) Mønster av innkommende løsninger under to mellomstrømsforhold. (E) Økning i bakgrunnsfluorescens som en avlesning av aktinkonsentrasjon. Tid t = 0 er angitt som utbruddet av fluorescensøkning. Løsning 1: 0,5 μM 10 % Alexa-488-merket G-aktin, løsning 2: F-buffer. (C,E) PDMS-kammer: 20 μm høyt og 1600 μm bredt. Epifluorescensintensiteten, ~ 2 μm over overflaten, ble kvantifisert ved å beregne gjennomsnittet av signalet over hele synsfeltet, normalisert til 0 i fravær av fluorofor og 1 med maksimal intensitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

8. Grunnleggende enkeltfilamenteksperiment: Adenosindifosfat (ADP)-aktin piggete endedepolymerisering

MERK: Denne delen forutsetter et ikke-funksjonelt kammer (kun avsnitt 5). Hvis kammeret er direkte funksjonalisert (avsnitt 4), starter du på trinn 8.4.

  1. Overflatefunksjonalisering med aktinfilamentfrø:
    1. Endre oppløsning 3 til 200 μL 50 pM spektrin-aktinfrø11 i F-buffer (se pkt. 7).
      MERK: Alternativt, hvis spectrin-aktinfrø ikke er tilgjengelige, kan man bruke biotin-funksjonaliserte korte filamentsegmenter som vil bli immobilisert på en streptavidin-belagtcoverlip (se 9,10 for detaljer).
    2. Injiser i 2 min med Høy strømning 3.
      MERK: Juster konsentrasjonen og tiden avhengig av den endelige frøtettheten.
  2. Overflate passivisering:
    1. Bytt rør 3 med 300 μL 5% BSA i F-buffer.
    2. Injiser i 5 min ved Høystrøm 3, etterfulgt av 5 min ved Mid Flow 3. I løpet av dette andre trinnet, reduser trykket i kanal 1 og 2 til 7-8 mbar for å få en tellerstrøm ~ -100 nL / min, slik at hele kammerflatene er BSA passivated.
      MERK: Siden BSA-løsningen er mer viskøs, må trykket justeres tilsvarende.
  3. Bytt rør 3 til F-buffer og skyll kanalen (5 min, høystrøm 3).
  4. Forbered følgende 200-300 μL løsninger, alle proteiner blir fortynnet i F-buffer:
    Inntak 1, polymerisasjonsløsning: 1 μM 10% Alexa-488 merket G-aktin, 1 μM profilin (tabell 1).
    Inntak 2, aldringsløsning: 0,15 μM 10% Alexa-488 merket G-aktin.
    Innløp 3, depolymeriseringsløsning: Bare F-buffer.
    MERK: Profilin brukes her for å forhindre spontan kjernedannelse og for å opprettholde en konstant konsentrasjon av G-aktin.
  5. Bytt rør 1 til 3 (avsnitt 7). Injiser ved hjelp av forhåndsinnstillingen Høy strømning alle i 3-4 min. De tre løsningene har nå fylt PEEK-slangen og nådd kammeret (figur 3A). Glassoverflaten kan utsettes for en hvilken som helst innløpsløsning uten dødtid (<1 s, figur 3D,E).
  6. Slå på mikroskopet. Still inn innstillingene: 150 mW 488 nm eksitasjonslaser med 10% -20% effekt, 100-200 ms kameraeksponeringstid, 200-300 nm TIRF penetrasjonsdybde, 60x mål. Disse innstillingene brukes i hele manuskriptet.
  7. Filamentpolymerisering (figur 4A):
    1. Sett trykkinnstillingen på Midtstrøm 1 i ~10 min.
    2. [VALGFRITT] Registrer polymerisasjon (1 ramme/20 s, TIRF). Filamenter skal polymeriseres ved rundt 10 underenheter/sekund (sub/s)1,12.
  8. Aldring av filament: Sett trykkinnstillingen til Midtstrøm 2 i 15 min. Ved den kritiske konsentrasjonen vil 0,15 μM G-aktin, filamentlengden forbli konstant, og filamenter vil vende seg til >99% ADP-F-actin4.
  9. Depolymerisering (figur 4A):
    1. Start oppkjøpet på 1 ramme/5 s, i epifluorescence-modus. Siden det er en svært lav fluorescensbakgrunn i kanal 2 og 3, er det ikke nødvendig å bruke TIRF.
    2. Etter en til to bilder bytter du til Mid Flow 3. Filamenter skal depolymerere ved rundt 10 under/s (referanse12).
  10. For å tilbakestille eksperimentet, bryt alle fluorescerende merkede filamenter ved å kontinuerlig utsette dem for laseren med maksimal effekt i ~ 2 min. For å teste forskjellige forhold, endre løsning 1, 2 eller 3 og injiser dem (High Flow, 3-4 min). Gjenta trinn 8.7-8.9.

9. Andre enkeltfilamenteksperimenter

  1. Testing av interaksjoner mellom ABPer og F-aktin
    MERK: Mikrofluidikk har blitt brukt til å kvantifisere aktiviteten til flere sidebindende ABPer, for eksempel cofilin, tropomyosin og Arp2/3. Følge protokollen i avsnitt 8:
    1. Endre kanal 3 til fluorescerende ABP av interesse for F-buffer. Injiser (høy strømning 3, 3 min).
    2. Filamentpolymerisering: Sett trykkinnstillingen til Midtstrøm 1 i 10 min.
    3. ABP-binding: Start oppkjøpet med TIRF. Juster bildefrekvensen avhengig av ABP-konsentrasjonen. Etter 1-2 bilder bytter du til Mid Flow 3.
      MERK: Avhengig av ABP kan det også være mulig å raskt (f.eks. i mindre enn 5 s) bytte til Mid Flow 2 for å redusere bakgrunnsfluorescensen ytterligere når du tar et bilde.
    4. ABP unbinding: Mens du fortsetter oppkjøpet, bytt til Mid Flow 2.
  2. Polymerisering med formin i den frie piggenden
    MERK: Formins har vist seg å påvirke filament piggete end polymerisering. Mikrofluidikk er spesielt tilpasset for å måle forminbinding og ubinding priser og deres innvirkning på filament forlengelse.
    1. Forbered følgende løsninger:
      Kanal 1: 10 nM formin i F-buffer (tabell 1).
      Kanal 2: 1 μM 10% Alexa-488 merket G-aktin, 4 μM profilin.
      Kanal 3: F-buffer.
    2. Bytt rør 1, 2 og 3 (avsnitt 7). Injiser ved hjelp av forhåndsinnstillingen Høy strømning alle i 3-4 min.
    3. Start filamentpolymerisering: Sett trykkinnstillingen til Midtstrøm 2 i 2 min.
    4. Forminbinding til filament pigget ende: Sett trykkinnstillingene til Mid Flow 1 i 30 s.
    5. Forminmediert polymerisasjon: Sett trykkinnstillingen til Midtstrøm 2. Med formin mDia1 i piggbent enden, bør filamenter polymerisere på rundt 50 sub / s 13,14,15.
  3. Polymerisasjon/depolymerisering fra overflateforankret formin
    MERK: Polymerisasjons- og depolymeriseringsratene for formin-dekorerte piggender har vist seg å avhenge av spenningen som påføres filamentet. I mikrofluidikk genererer friksjonen av væskestrømmen langs filamentsiden en spenning proporsjonal med filamentlengden og til strømningshastigheten14,16.
    1. Bruk metoden i avsnitt 8 som er beskrevet ovenfor, og erstatt trinn 8.1, 8.2 og 8.3 for overflate passivasjon med:
      1. Bytt rør 3 til 1 μg/ml anti-Hans antistoff i F-buffer. Injiser i 2 min med Høy strømning 3.
      2. Bytt rør 3 med 5% BSA i F-buffer. Injiser i 5 min ved Høystrøm 3, etterfulgt av 5 min ved Mid Flow 3. I løpet av dette andre trinnet, reduser trykket i kanal 1 og 2 til 7-8 mbar for å få en tellerstrøm ~ -100 nL / min slik at hele kammerflatene er BSA passivated.
      3. Endre rør 3 til 100 nM Hans tagget formin i F-buffer. Injiser i 5 min med Høy strømning 3. Bytt rør 3 med F-buffer. Injiser i 5 min med High Flow 3 for å sikre at det ikke er noen formins igjen i slangen.
    2. Forbered og injiser følgende løsninger (200-300 μL hver, i F-buffer):
      Kanal 1: 1 μM 10% Alexa-488 merket G-aktin.
      Kanal 2: 1 μM umerket G-aktin, 4 μM profilin.
      Kanal 3: Bare F-buffer.
    3. Filamentkjernedannelse: Utsett de overflateforankrete forminene for G-aktin (innstilling av Mid Flow 1).
    4. Filamentpolymerisering: Utsett kammeret for profilin-aktin ved hjelp av Mid Flow 2.
    5. Start oppkjøpet: 1 ramme/2 s, epifluorescens. Med formin mDia1 skal filamenter polymeriseres ved 50-80 sub / s, avhengig av filamentlengden og strømningshastigheten14.
    6. Filament depolymerisering: Start oppkjøpet (1 ramme/4 s, epifluorescence). Etter 1-2 rammer, eksponer filamentene for F-buffer, Mid Flow 3. Med formin mDia1 skal filamenter depolymerere ved 5-15 sub / s, avhengig av filamentlengden og strømningshastigheten14.
  4. Aktinfilamenter med segmenter uten etikett
    MERK: Actin fluorescerende merking skaper flere gjenstander, for eksempel pauser under depolymerisering17 og endret tropomyosinbinding18. En løsning for disse artefaktene er å bruke mikrofluidikk til å sette sammen filamenter som viser segmenter uten etikett.
    1. Klargjør og injiser følgende løsninger (200-300 μL i F-buffer):
      Kanal 1: 1 μM umerket G-aktin, 1 μM profilin.
      Kanal 2: 0,3 μM 10% Alexa-488 merket G-aktin.
    2. Eksponer overflaten sekvensielt for kanal 2 (5 min), kanal 1 (10 min) og kanal 2 (15 min) for å generere ADP-aktin umerkede segmenter med fluorescerende merkede segmenter i hver ende.
  5. Barbed ende-forankrede filamenter med gelsolin
    MERK: Med spektrin-aktinfrø polymeriserer filamenter i deres frie piggende mens den spisse enden stabiliseres av spektrin-aktinfrøet. Et alternativ er å forankre filamenter med en piggete end capper som gelsolin.
    1. Forbered en F-aktinløsning på 4 μM 10% Alexa-488 merket G-aktin i 20 μL F-buffer. La aktin spontant nukleere og polymerisere ved RT i minst 30 minutter på benken. Vikle røret i aluminiumsfolie for å beskytte det mot lys.
    2. I mellomtiden forbereder du det mikrofluidiske kammeret og passiverer overflaten med en blanding av 5% BSA og 1% biotin-BSA (se trinn 8.2).
    3. Skyll kanal 3 med F-buffer (2 min ved høystrøm 3). Injiser 10 μg/ml nøytravidin i F-buffer (4 min ved høystrøm 3).
    4. Bytt rør til:
      Kanal 1: 10 nM biotin-gelsolin (Tabell 1).
      Kanal 2: F-buffer.
      Kanal 3: 0,4 μM prepolymerisert F-aktin.
    5. Injiser alle løsningene sammen ved hjelp av High Flow All-innstillingen i 3 min.
    6. Utsett hele kammeret for gelsolin (Mid Flow 1, 30 s).
    7. Fest filamenter til overflaten (Lav strømning 3: Kanal 3 ved 3 mbar, Kanal 1 og 2 ved ~2 mbar, i ca. 2 min).
    8. [VALGFRITT] Hvis filamenttettheten er for lav, gjentar du trinn 9.5.6 og 9.5.7.
    9. Spiss sluttdepolymerisering: Start oppkjøpet (1 ramme/30 s, epifluorescence). Etter 1-2 bilder, eksponer filamenter kun for buffer, Mid Flow 2. Filamenter skal depolymerere på rundt 0,2 under/s.

10. Fascinindusert filamentbuntdannelse og demontering av ADF/cofilin

MERK: For å danne aktinfilamentbunter, sørg for å ha en tilstrekkelig høy filamentfrøtetthet på overflaten av kammeret. Når de utsettes for fascinprotein, vil nærliggende filamenter som svinger lateralt, bli dynamisk kryssbundet av fascinproteiner. Som fascin raskt unbinds fra filament side19, fascin må være konstant til stede i den viktigste flytende løsningen for å opprettholde filament bunting.

  1. Følg trinn 8.1-8.3.
  2. Klargjør følgende løsninger (200-300 μL i F-buffer):
    Kanal 1, polymerisasjonsløsning: 1 μM 10% Alexa-488 merket G-aktin, 1 μM profilin.
    Kanal 2, Bunteløsning: 200 nM fascin (tabell 1), 0,15 μM 10% Alexa-488 merket G-aktin.
    Kanal 3, Demonteringsløsning: 200 nM ADF/cofilin (tabell 1), 100 nM fascin, 0,15 μM 10 % Alexa-488 merket G-aktin.
  3. Bytt rør 1 til 3 (avsnitt 7). Injiser ved hjelp av forhåndsinnstillingen Høy strømning alle i 3-4 min.
  4. Filamentpolymerisering: Sett trykkinnstillingen til Mid Flow 1 i ~10 min. Polymerisasjon kan avbildes med TIRF.
  5. Filamentbunting (figur 4C): Start bildeanskaffelse (1 ramme/5 s, epifluorescens). Etter 1-2 rammer setter du trykkinnstillingen til Midtstrøm 2 og observerer filamentbunling.
  6. Buntfragmentering: Start bildeanskaffelse (1 ramme/5 s, epifluorescens). Etter 1-2 rammer setter du trykkinnstillingen til Midtstrøm 3 og observerer den kofilininduserte demonteringen av både enkeltfilamenter og bunter.

11. Mikrofluidisk rengjøringsprosedyre for enheter

MERK: For å unngå forurensning fra ett eksperiment til et annet, er det viktig å rengjøre og tørke alle slangene og strømningsmålerne grundig etter hvert eksperiment.

  1. Koble alle rør fra PDMS-kammeret og kast kammeret.
  2. For å rengjøre PEEK-rør og strømningsmålere, tape slangen ender i et tomt 15 ml plastrør og injiser følgende løsninger ved maksimalt trykk til reservoaret er nesten tomt:
    400 μL F-buffer.
    400 μL 0,5 M NaOH.
    400 μL rent vann.
    200 μL isopropanol.
  3. Skift ut med et tomt reservoar og blås luft til slangene er helt tørre (~2-4 min, maksimalt trykk).

12. Bildeanalyse

MERK: Selv om dette manuskriptet fokuserer på metoden for å montere, manipulere og visualisere enkeltaksinfilamenter i mikrofluidikk, er det en kort metode for å analysere oppkjøpte filmer her. Analysen utføres på 16-biters bilder ved hjelp av ImageJ, etter avsnitt 8.

  1. Bildebehandling er minimal:
    1. Importer bildestakken for polymerisasjon eller depolymerisering.
    2. [VALGFRITT] Homogeniser bildeintensiteten med funksjonen Trekk fra bakgrunn (standardinnstillinger (dvs. 'Rullende kuleradius' = 50 piksler)). Dette er spesielt nyttig hvis bakgrunnsfluorescensen endres i løpet av en film, eller hvis fluorescensbelysning ikke er homogen over synsfeltet.
    3. Juster lysstyrke og kontrast (bakgrunn nær null, filamenter nær maksimum).
  2. Opprett filament kymograph:
    1. Velg en filament som ikke stanser midlertidig, bryter eller kobler fra. Ikke velg basert på ellers virkemåte. Tegn en linje 1-2 bildepunkter over (Rett linje-verktøy ). Lagre filamentnummeret (Legg til i ROI Manager).
    2. Bruke funksjonen Reslice (stykkeantall: 5 piksler). Beregn maksimal intensitet (funksjon Zprojection).
  3. Mål polymerisasjons-/depolymeriseringshastigheten:
    1. På kymografien tegner du en linje langs filamentbarbenden (Rett linje-verktøyet , figur 4A). Mål linjebredden og -høyden (funksjon Mål).
  4. Gjenta trinn 12.2-12.3 over flere filamenter. Beregn polymerisasjons-/depolymeriseringsratene (figur 4A):
    Equation 1, der v er frekvensen (i sub/s), w linjebredden (piksler), pix bildepunktstørrelsen (nm), h linjehøyden (rammer) og dt tiden mellom delbildene (i sekundet). Her tilsvarer 2,7 nm det effektive bidraget fra en aktinunderenhet til filamentlengden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For alle forsøkene beskrevet ovenfor, bør fluorescerende merket aktinfilamenter være tydelig synlige, med god kontrast, som indikerer lav bakgrunnsfluorescens fra overflaten (figur 4, se Tilleggsfil 1 for feilsøking av vanlige problemer). Actin filaments bør heller ikke holde seg til overflaten: Når den dominerende strømningshastigheten er lav, bør aktinfilamentenes laterale svingninger være merkbare når man observerer dem levende og la en tydelig bestemme at de bare er forankret av en av endene. På samme måte, når du bruker TIRF-avbildning, bør deres vertikale svingninger være synlige ved endringer i intensitet langs lengde og tid. Avhengig av de anvendte strømningshastighetene, kan det hende man må justere TIRF-penetrasjonsdybden for å optimalisere bildekvaliteten til aktinfilamentene anskaffet av TIRF.

Ved eksponering av filamenter for polymerisasjonsforhold (se avsnitt 8), bør filamentforlengelse være vanlig (dvs. forlengelsen på slutten av filamentet hindres ikke av overflateinteraksjon eller permanent stikkende). I tillegg bør den målte filamentbarberede forlengelseshastigheten samsvare med forventet verdi i henhold til aktinkonsentrasjonen i røret 1,20, noe som indikerer at rørløsningen har blitt riktig strømmet opp til det mikrofluidiske kammeret (figur 4A). På samme måte, når de utsettes for en bufferløsning, bør filamenter depolymerere jevnt med en hastighet som gjenspeiler deres ADP-innhold4 (figur 4A). Når du utsetter allerede dyrkede aktinfilamenter for en løsning av fluorescerende merket cofilin, vil cofilinklynger bli nukleert og vokse mot både spisse og piggede ender (figur 4B) i en hastighet som er avhengig av cofilinkonsentrasjonen. Ved vurdering av en potensiell krysskoblingsaktivitet av en ABP, for eksempel fascin (figur 4C), vil nærliggende aktinfilamenter som danner bunter lett bli oppdaget av deres høyere fluorescensintensitet og en endring i deres laterale svingninger.

Væskestrømmen påfører en viskøs friksjonskraft på aktinfilamenter som er forankret til overflaten av mikrofluidisk kammer. Friksjonskraftkoeffisienten på F-aktin er η = 6,10-4 pN·s/μm2, uttrykt per filamentmikronlengde14. Ved mellomstrømningshastigheter, som filamenthøyden svinger rundt et konstant gjennomsnitt på 250 nm over overflaten, finnes det en kraftgradient fra den frittflytende enden opp til filamentforankringspunktet. Man kan derfor beregne den påførte spenningen når som helst langs filamentet, ved hjelp av F = 6ηπLv, der v er den lokale strømningshastigheten 250 nm over overflaten (figur 1B) og L er nedstrøms filamentsegmentlengde (dvs. fra det vurderte punktet opp til den frie enden). For høyere strømningshastigheter er filamentets gjennomsnittshøyde ikke konstant, men øker lineært fra forankringspunktet til den frie enden, forblir under 250 nm i gjennomsnitt, og vil variere avhengig av strømningshastighetene, og dermed føre til en mer kompleks spenningskraftprofil langsfilamentet 21.

Figure 4
Figur 4: Representative resultater. Typiske eksperimenter der aktinfilamenter polymeriseres fra spektrrin-aktinfrø og eksponeres for forskjellige ABPer. For klarhetens skyld vises bare en brøkdel av synsfeltet. (A) Utfall fra det grunnleggende polymerisasjonsdepolymeriseringseksperimentet (§ 8). Filamenter polymeriseres med en løsning på 0,8 μM 10% Alexa-488 merket G-aktin, i alderen 15 min for å konvertere alle underenheter til ADP-aktin (ikke vist), og depolymeriseres bare når de utsettes for F-buffer. Bunn: kymografier som brukes til å kvantifisere polymerisasjons- og depolymeriseringsratene. Ervervet ved 1 ramme/5 s, 200 ms eksponeringstid, 150 mW 488 nm laser med 9% effekt, TIRF (laser penetrasjon dybde 250 nm). (B) Fragmentering av enkelt aktinfilamenter med 500 nM mCherry-cofilin-1. Actin er merket med ATP-ATTO48822 (gul) og cofilin-1 er smeltet sammen til mCherry (blå). Topp: brøkdel av et synsfelt. Merk: proteinaggregater på overflaten. Bunn: kymografi som viser bindingen av cofilin-1 til en filament (pilspisser viser cofilin-1 domenekjernehendelser), noe som fører til en fragmenteringshendelse (lynsymbol). Anskaffet ved 1 ramme / 4 s, 200 ms eksponering, 150 mW 488 nm laser ved 16% og 100 mW 561 nm laser ved 12% effekt, epifluorescence. (C) Bunting av aktinfilamenter ved fascin (pkt. 10.5). Filamenter ble først polymerisert med 0,8 μM 5% Alexa-488 merket G-aktin og buntet med 200 nM fascin. Sammenlignet med enkle filamenter, vises filamentbunter to til tre ganger lysere og ikke helt på linje med strømmen. Anskaffet ved 1 ramme /10 s, 200 ms eksponering, 20% 200 W Mercury lampe intensitet, epifluorescence. (A-C) Bakgrunnen ble trukket fra imageJs ad hoc-funksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protein navn art Uniprot ref (sekvens) original rensingsprotokollref. Kommentarer
aktin kanin P68135 (full lengde) 23 For fluorescerende merking, se ref 24
profilin1 menneske P07737 (full lengde) 25 se også ref 11
Spectrin-aktin frø menneske N/a 26, 27 se også ref 11
cofilin1 mus P18760 (full lengde) 28
gelsolin menneske P06396 (full lengde) 29
mDia1 formin mus O08808 (aa 552–1255) 13 mer detaljert protokoll i ref 24
fascin1 menneske Q16658 (full lengde) 30

Tabell 1: Aktin- og aktinbindende proteiner 23,24,25,26,27,28,29,30

Reagent konsentrasjon
Tris-HCl pH 7.4 5 mM
KCl 50 mM
MgCl2 1 mM
EGTA 0,2 mM
Atp 0,2 mM
DTT 10 mM
DABCO 1 mM

Tabell 2: F-buffersammensetning. DABCO og en relativt høy konsentrasjon av DTT brukes til å begrense fotoindusert skade på filamenter på grunn av lyseksponering under fluorescensmikroskopieksperimenter.

Angi navn Trykk (mBar) Strømningshastighet (nL/min)
Maksimalt trykk 300 ~ 30 000 (i dominerende kanal)
Høyt trykk 150 ~ 15 000 (i dominerende kanal)
Midttrykk 12 ~ 1500 (i dominerende kanal)
'Endre' trykk 12 for alle innløp,
5 for uttak		 ~ 500 (i hvert innløp)

Tabell 3: Korrespondanse mellom anvendt trykk og målte strømningshastigheter. De resulterende strømningshastighetene avhenger sterkt av det eksperimentelle oppsettet. Verdier er gitt for et mikrofluidisk kammer med en 1 cm lang hovedkanal av tverrsnitt 20 μm x 800 μm (høyde x bredde), koblet til hvert reservoar med 80 cm lange PEEK-rør.

Tilleggsfil 1: Klassiske problemer, årsaker og løsninger. De opplevde ofte problemer når de jobbet med mikrofluidikk og / eller enkelt aktinfilamenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammenlignet med standard enkeltfilamentmetoder der aktinfilamenter er forankret til overflaten med flere punkter langs lengden eller opprettholdt nær den av et trengselmiddel som metylcellulose, gir mikrofluidikk en rekke fordeler. Siden interaksjoner med overflaten er minimale, unngås de kunstige pausene disse interaksjonene kan indusere under både forlengelse og depolymerisering. Filamentene er justert av strømmen, parallelt med hverandre, letter overvåkingen og målingen av lengdene. Løsningen rundt filamentene fornyes stadig, og utsetter dem for konstante proteinkonsentrasjoner. Å kunne raskt (<1 s, figur 3D,E) bytte mellom forskjellige proteinløsninger som filamentene er utsatt for, gjør at man kan utføre tidskontrollerte sekvensielle eksperimenter, som ofte er avgjørende for kinetiske studier. Til slutt kan det viskøse draget som utøves av den flytende løsningen på filamentene utnyttes til å påføre kontrollert mekanisk stress på filamentene (Representative Results-delen). Man bør merke seg at moderate væskestrømmer (Mid Flow-trykkinnstillinger) bringer filamenter nær nok overflaten (~ 250 nm) til å effektivt avbilde dem med TIRF mens de genererer minimal spenning (<1 pN)14.

Sammenlignet med klassiske enkeltfilamentanalyser, vil mikrofluidikk imidlertid kreve større mengder proteinløsninger: vanligvis noen få 100 μL, når et standardeksperiment kunne gjøres med mindre enn 10 μL. Dette kan være en begrensning når du bruker dyrebare proteiner. Klassiske eksperimenter kan brukes til å etablere relevante eksperimentelle forhold (f.eks. absolutte eller relative konsentrasjoner av forskjellige proteiner) før du starter en rekke mikrofluidiske eksperimenter. En annen begrensning, som for alle andre enkeltfilamentteknikker in vitro, kommer fra den ufullkomne passivasjonen av dekslene. Reproduserbarhet i dekslerlip rengjøring og binding av passivasjonslaget (BSA, PEGylation, etc.) er alltid vanskelig å kontrollere. En ett-trinns passivasjonsteknikk basert på PEG-silan overflatebehandling har blitt den valgte teknikken i mange laboratorier 7,15. Som sådan kan den effektive tettheten av filamentfrø variere mellom eksperimenter med omtrent to ganger, selv når de gjentas så nøyaktig som mulig. Man bør sikte på et tilfredsstillende utvalg av filament overflatetetthet og være forberedt på å gjenta eksperimentet om nødvendig. Vanlige problemer ved arbeid med mikrofluidikk og/eller enkeltaksinfilamenter er omtalt i Tilleggsfil 1.

For den grunnleggende protokollen som presenteres her, bør man merke seg at spectrin-aktinfrø, som kan betraktes som korte stabiliserte filamenter, er tilfeldig orientert når de holder seg til overflaten. Som en konsekvens, når filamentene som vokser fra disse frøene stemmer overens med strømmen, vil deres del nærmest frøet være skarpt bøyd, hver med sin egen vinkel. Lengden over hvilke filamenter som er bøyd er vanligvis svært liten når filamenter blir utsatt for midt eller høye strømmer. Faktisk vil denne lengden generelt være mindre enn diffraksjonsgrensen (~ 200 nm) og vil dermed ikke lett bli oppdaget. Det er viktig at ABP-ene som er følsomme for filamentkurvatur, vil binde seg og fungere annerledes i denne svært bøyde regionen. For å unngå skjevheter, er det enkleste å utelukke denne regionen fra analysen21.

Før vi begynte å bruke mikrofluidikk for å manipulere og visualisere enkelt aktinfilamenter, hadde den allerede blitt brukt til å studere enkelt-DNA-filamenter3, som er langt mer fleksible. Dette kan gi opphav til bemerkelsesverdige forskjeller, da strømmen dramatisk kan slappe av DNA og endre den tilsynelatende lengden dramatisk. Mikrofluidikk kan også brukes, veldig likt metoden som presenteres her, for å studere mikrotubuler; Disse er mye stivere, men kan likevel gjøres for å tilpasse seg strømmen for å måle deres forlengelse og depolymerisering, dra nytte av den raske bryteren av forhold31,32, eller bøyes av en vinkelrett strømning for å måle mikrotubul plastisitet7.

Vi har her presentert protokollen for det grunnleggende eksperimentet, hvor filamenter bare er forankret i den ene enden og hvor strømningsretningen i synsfeltet er den samme gjennom hele eksperimentet. Disse to egenskapene kan varieres. For eksempel kan filamenter forankres av flere punkter for å generere en annen kraftprofil langs filamentet. På samme måte kan strømningsretningen varieres (i nærheten av krysset mellom inngangskanalene, i strømningskammeret) for å bøye filamenter lokalt, da den uanmeldte delen vil peke i en annen retning enn det forankrede filamentsegmentet21. Filamenter som strekker seg fra tilfeldig forankrede spektrinfrø kan også utsettes for krysskoblingsproteiner for å danne bunter33 (se avsnitt 10). Ved å kombinere mikrofluidikk med andre teknikker (mikropatterning, optisk pinsett, etc.) eller designe mikrofluidiske kamre med rom for å endre strømningslinjer, kan flere konfigurasjoner opprettes for å studere spesifikk ABP-aktivitet på enkeltfilamenter eller for å danne små aktinnettverk34. Antall kombinasjoner, sammen med fordelen og allsidigheten av mikrofluidikk, tilbyr mange verktøy til forskere for å dechiffrere den romlige-temporale reguleringen av aktinnettverk i molekylær skala.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi er takknemlige for B. Ladoux og R.-M. Mège lab for bruk av UV-renere utstyr, og J. Heuvingh og 0. du Roure for den første opplæringen vi fikk om å forberede former på silisiumskiver og gi tips om mikrofluidikk. Vi anerkjenner finansiering fra European Research Council Grant StG-679116 (til A.J.) og Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin and Conformin (til G.R.-L.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-Casein Merck C6905 Used at 8 mg/mL
Biopsy punch (with plunger) Ted Pella 15115-2 ID 0.75 mm, OD 1.07 mm
Biotin-BSA Merck A8549 Used at 1 mg/mL
BSA Merck A8022 Used at 50 mg/mL
Coverslip Mini-Rack
Teflon holder		 Invitrogen C14784 for 8 coverslips
Coverslips 22x40mm
Thickness #1.5		 Menzel Gläser 631-1370
DABCO Merck D27802 component in f-buffer
DTT Euromedex EU0006-D component in f-buffer
Ester NHS Alexa Fluor 488 Invitrogen A20000 Fluorophore for actin labeling on Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific 21338 To biotinylate actin on Lys328
Hellmanex III Hellma 9-307-011-4-507 Glass cleaning detergent
ImageJ NIH N/A open source software
Laboport KNF 811kn.18 vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)
Magic invisible tape Scotch 7100024666 standard transparent office tape
Micrewtube Simport T341-6T 2 mL microfluidic reservoir tubes
Microfluidic device Part 1: Flow Unit S Fluigent FLU-S-D-PCKB Flowmeter
Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL Fluigent 14002001PCK Reservoir holder
Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ Fluigent EZ-11000001
EZ-00345001		 Pressure controller
Model 42 - UVO-Cleaner Jelight Inc. 42-220 Ultraviolet cleaner
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 Jena Bioscience NU-805-488 ATP-ATTO used to label actin
neutravidin Thermo Scientific 31000
PLL-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) Use at 1 mg/mL in PBS.
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer Dow Corning 1673921 Contains PDMS base and curing agent
Polyetheretherketone (PEEK) tubing Merck Z226661 “Blue” : I.D. = 0.25 mm
Safety blow gun Coilhose Pneumatics 700-S filtered air
Silicon tubing VWR 228-0701P connect PEEK to coupler
Stainless steel catheter coupler Prime Bioscience SC22/15 Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing
Thermoplastic film Sigma Aldrich PM996 Standard "parafilm"
Ultrapure ethanol VWR 64-17-5
Ultrasonic cleaning bath VWR USC200TH To accomodate 1 L beakers
Vacuum dessicator SP Bel-Art F42022-0000 to degas the PDMS or solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).
  2. Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).
  3. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  4. Jégou, A., et al. Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin. PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).
  5. Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
  6. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  7. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  8. Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins. Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).
  9. Funk, J., et al. Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth. eLife. 8, 50963 (2019).
  10. Pandit, N. G., et al. Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).
  11. Wioland, H., et al. ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends. Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).
  12. Pollard, T. D., Mooseker, M. S. Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores. The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).
  13. Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin. Cell. 124 (2), 423-435 (2006).
  14. Jégou, A., Carlier, M. -F., Romet-Lemonne, G. Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments. Nature Communications. 4, 1883 (2013).
  15. Breitsprecher, D., et al. Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging. Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).
  16. Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).
  17. Niedermayer, T., et al. Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).
  18. Gateva, G., et al. Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro. Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).
  19. Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia. Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).
  20. Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. The Journal of Cell Biology. 103, Pt 2 2747-2754 (1986).
  21. Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).
  22. Colombo, J., et al. A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics. Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).
  23. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  24. Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly. Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).
  25. Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms. European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).
  26. Lin, D. C., Lin, S. Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).
  27. Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments. The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).
  28. Kremneva, E., et al. Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres. Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).
  29. Le Clainche, C., Carlier, M. -F. Actin-based motility assay. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 12 1-20 (2004).
  30. Vignjevic, D., et al. Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).
  31. Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. eLife. 5, 13470 (2016).
  32. Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
  33. Suzuki, E. L., et al. Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity. Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).
  34. Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).

Tags

Biokjemi utgave 183
Bruke mikrofluidikk og fluorescensmikroskopi til å studere monteringsdynamikken til enkelt actinfilamenter og bunter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wioland, H., Ghasemi, F.,… More

Wioland, H., Ghasemi, F., Chikireddy, J., Romet-Lemonne, G., Jégou, A. Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63891, doi:10.3791/63891 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter