Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Microfluïdica en fluorescentiemicroscopie gebruiken om de assemblagedynamiek van single actinefilamenten en -bundels te bestuderen

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63891
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université Paris Cité, CNRS, Institut Jacques Monod

Summary

We presenteren protocollen voor eenvoudige actinefilamentmicrofluïdische assays, in combinatie met fluorescentiemicroscopie, waarmee men individuele actinefilamenten in realtime nauwkeurig kan volgen terwijl ze sequentieel worden blootgesteld aan verschillende eiwitoplossingen.

Abstract

Om de complexe moleculaire mechanismen te ontcijferen die de assemblage en demontage van actinefilamenten reguleren, is het een grote aanwinst om individuele reacties live in goed gecontroleerde omstandigheden te monitoren. Om dit te doen, zijn er de afgelopen 20 jaar levende single-filament experimenten ontstaan, meestal met behulp van total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie, en hebben ze een schat aan belangrijke resultaten opgeleverd. In 2011, om de mogelijkheden van deze experimenten verder uit te breiden en terugkerende problematische artefacten te voorkomen, introduceerden we eenvoudige microfluïdica in deze testen. Deze studie beschrijft ons basisprotocol, waarbij individuele actinefilamenten aan één uiteinde worden verankerd aan het gepassiveerde coverslipoppervlak, worden uitgelijnd met de stroom en achtereenvolgens kunnen worden blootgesteld aan verschillende eiwitoplossingen. We presenteren ook de protocollen voor specifieke toepassingen en leggen uit hoe gecontroleerde mechanische krachten kunnen worden toegepast, dankzij de viskeuze weerstand van de stromende oplossing. We belichten de technische kanttekeningen van deze experimenten en presenteren kort mogelijke ontwikkelingen op basis van deze techniek. Deze protocollen en verklaringen, samen met de huidige beschikbaarheid van eenvoudig te gebruiken microfluïdica-apparatuur, moeten niet-specialisten in staat stellen deze test in hun laboratoria te implementeren.

Introduction

De assemblage en demontage van actinefilamenten en actinefilamentnetwerken worden gecontroleerd door verschillende biochemische reacties en zijn afhankelijk van de mechanische context. Om inzicht te krijgen in deze complexe mechanismen is het van onschatbare waarde om individuele reacties op individuele filamenten (in voldoende grote aantallen) te kunnen waarnemen. In de afgelopen decennia is de observatie van dynamische actinefilamenten in realtime, meestal met behulp van total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie, naar voren gekomen als een belangrijke techniek en heeft een indrukwekkende lijst van resultaten opgeleverd die niet konden worden verkregen met biochemische testen met bulkoplossing1.

Om dit te bereiken, moet men fluorescerend gelabelde actinefilamenten dicht bij het oppervlak van de microscoopdeksels houden terwijl ze worden blootgesteld aan oplossingen van actinebindende eiwitten (ABPs), die ook fluorescerend kunnen worden gelabeld. Dit biedt een middel om gebeurtenissen die plaatsvinden op individuele filamenten in goed gecontroleerde biochemische omstandigheden te volgen en zo de reactiesnelheden te kwantificeren. Er moet echter rekening worden gehouden met een aantal specifieke beperkingen. Het kunstmatig dicht bij het oppervlak houden van filamenten, vaak dankzij meerdere verankeringspunten of door het gebruik van een verdringingsmiddel zoals methylcellulose, kan hun gedrag veranderen (bijvoorbeeld pauzes veroorzaken in hun polymerisatie en depolymerisatie2). Het volgen van de contouren van elk filament kan een uitdaging zijn, vooral als nieuwe filamenten of filamentfragmenten zich in de loop van de tijd ophopen in het gezichtsveld. De reacties vinden plaats in een eindig volume waar de concentratie van actinemonomeren en ABP's in de loop van de tijd kan variëren, waardoor het mogelijk moeilijk wordt om nauwkeurige snelheidsconstanten af te leiden. Ten slotte is het vernieuwen of wijzigen van de oplossing van ABPs moeilijk te bereiken in minder dan 30 s en zal het vaak leiden tot een inhomogeen eiwitgehalte in het monster.

Iets meer dan 10 jaar geleden, geïnspireerd door wat er al werd gedaan om individuele Desoxyribonucleïnezuur (DNA) strengen3 te bestuderen, introduceerden we een nieuwe techniek op basis van microfluïdica om individuele actinefilamenten te observeren en te manipuleren4. Het stelt men in staat om de bovengenoemde beperkingen van klassieke single-filament technieken te omzeilen. In deze microfluïdische assays worden actinefilamenten gekweekt uit spectrine-actinezaden die op de coverslip zijn geadsorbeerd. Filamenten worden dus aan één uiteinde alleen aan de onderkant van de microfluïdische kamer verankerd en fluctueren boven het oppervlak zonder te plakken. Filamenten stemmen zich af op de stroom van binnenkomende oplossingen, waardoor de bewaking van hun contourlengte wordt vergemakkelijkt en ze in een ondiep gebied boven de afdekplaat worden gehouden waar TIRF kan worden gebruikt. Verschillende oplossingen worden tegelijkertijd in de kamer gestroomd zonder te mengen, en de filamenten kunnen er sequentieel en snel aan worden blootgesteld.

Hier stellen we een reeks basisprotocollen voor om single-actine-filament microfluïdica-testen in het laboratorium op te zetten. Coverslips en microfluïdicakamers kunnen van tevoren worden voorbereid (in een halve dag) en het experiment zelf, waarbij verschillende biochemische omstandigheden kunnen worden getest, wordt in minder dan een dag uitgevoerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Microfluïdische kamervoorbereiding

  1. Selecteer een SU-8 master mal met verschillende kamerpatronen. Typische kamers zijn kruisvormig met drie inlaten en één uitlaat, 20 μm hoog en 800 μm breed (figuur 1). Dergelijke mastermallen kunnen worden gekocht bij externe bedrijven of worden gemaakt in academische laboratoria (bijv. Gicquel, Y. et al.5).
  2. Plaats tape rond de rand van de mal.
    1. Leg ~50 cm lang, 19 mm breed, standaard transparante kantoortape (zie Materiaaltabel) op een bank, plakkerige kant naar boven. Plaats de mal verticaal aan het ene uiteinde en langs de middellijn van de tape.
    2. Rol de mal naar het andere uiteinde van de tape om een rand van 1 cm rond de mal te creëren. Vouw de tape over de onderkant van de mal neer.
  3. Bereid polydimethylsiloxaan (PDMS) oplossing.
    1. Giet in een wegwerpweegschaal direct 25-30 g PDMS-basis (Materiaaltabel). Voeg 10% gewicht/gewicht PDMS-uithardingsmiddel (Materiaaltabel) toe met een plastic pasteurpipet voor eenmalig gebruik.
    2. Meng handmatig en grondig met een plastic stokje. Zorg ervoor dat het uithardingsmiddel goed is opgenomen in de PDMS-basis, zelfs als roeren veel bubbels creëert.
  4. Ontgas de PDMS-oplossing in een vacuümdesiccator (Materiaaltabel) gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Bubbels zullen uitzetten, naar de oppervlakte stijgen en barsten wanneer het vacuüm wordt verbroken.
  5. Giet de PDMS-oplossing over de SU-8-matrijs. Gebruik een plastic stokje om zoveel mogelijk van het mengsel te schrapen en over te brengen.
  6. Ontgas PDMS voor een tweede keer (5 min in de vacuümdesiccator). Zorg ervoor dat je de meeste bubbels verwijdert (een paar kleine bubbels aan de bovenkant zijn prima).
  7. Plaats de vorm in een oven op 70 °C gedurende ten minste 5 uur zodat het PDMS netvormig kan worden en stolt.
  8. Verwijder massieve PDMS-kamers uit de mal.
    LET OP: Siliciumwafers voor SU-8-mallen zijn uiterst kwetsbaar, dus er moet uitgebreid op worden gelet bij het scheiden van de PDMS van wafers. Werk op een hard, vlak oppervlak en houd de wafer plat op het oppervlak.
    1. Maak met een scheermesje een cirkelvormige snede in het PDMS, op ongeveer 1 cm afstand van de rand van de mal. Alle patronen moeten minstens 0,5 cm in de snede zitten. Pel het centrale PDMS-blok voorzichtig af met zachte rukken.
      LET OP: Houd bij het afbladderen de SU-8-mal plat op het bankblad om te voorkomen dat deze breekt.
    2. Plaats PDMS op schone aluminiumfolie, het gegoten oppervlak tegenover de aluminiumfolie, om het oppervlak te beschermen tegen stof en om patronen zichtbaarder te maken.
  9. Kies en snijd een kamer met een scheermesje op minstens 0,5 cm afstand van het patroon. Het resulterende PDMS-blok is ongeveer 0,5 cm hoog, 1,5 cm breed en 3 cm lang. Doorprik drie inlaten en één uitlaat met een biopsiepons 0,75 mm I.D. (Materiaaltabel).
  10. Reinig de PDMS-kamer met ultrapuur ethanol (Materiaaltabel) en droog aan de lucht met een veiligheidspistool (Materiaaltabel). Plaats het PDMS met het patroon naar boven in een schone petrischaal en sluit de schaal met het deksel.

2. Glazen afdekkingslip reiniging

OPMERKING: Hier wordt een standaard coverslip-reinigingsprocedure, gebaseerd op een reeks ultrasoonapparaatstappen, gedetailleerd beschreven. Andere glasdekselreinigingsprocedures zijn beschreven in vele andere publicaties die vergelijkbare bevredigende resultaten kunnen bereiken 6,7,8,9.

  1. Plaats 10-20 coverslips (40 mm lang) op een polytetrafluorethyleen (PTFE) houder (materiaaltabel). Soniceer de coverslips in 0,5 L van 2% glasreinigingsoplossing (Materiaaltabel) in een glazen bekerglas van 1 L (35 °C, 30 min).
  2. Gooi de glasreinigingsoplossing weg en spoel de coverslips uitgebreid af met dH2O in ten minste drie opeenvolgende baden van 0,5 l.
  3. Bereid 0,5 L van 2 M KOH in een glazen bekerglas van 1 L. Soniceer de coverslips in KOH (RT, 30 min). Gooi KOH weg en spoel de coverslips af met dH2O in ten minste drie baden van 0,5 L.
    LET OP: Gebruik geschikte laboratoriumveiligheidsbeveiligingsmiddelen (handschoenen, bril en laboratoriumjas).
  4. Breng de coverslips over en soniceer ze in 0,5 l ultrapuur ethanol (RT, 30 min). Coverslips kunnen tot 2 weken in ethanol worden bewaard. Sluit het bekerglas met thermoplastische folie (Materiaaltafel) om verdamping te voorkomen. Droog voor gebruik de coverslip met luchtstroom.

3. PDMS kamerassemblage

  1. Verwarm de hete plaat voor op 100 °C. Plaats maximaal drie gereinigde PDMS-kamers en glazen afdekplaten in een schone petrischaal. Plaats de open petrischaal in een diepe ultraviolette (UV) reiniger (λ = 185 nm, zie materiaaltabel) en stel deze gedurende 3-5 minuten bloot aan UV-licht.
    OPMERKING: Als alternatief kunnen PDMS-kamers en coverslips gedurende 30 s worden blootgesteld aan lucht of zuurstofplasma.
  2. Plaats de PDMS-kamer voorzichtig over de coverslip. Zorg ervoor dat de twee oppervlakken die in contact zijn gebracht, direct zijn blootgesteld aan UV. Het PDMS kleeft automatisch aan het glas en de kamer wordt duidelijk zichtbaar.
  3. Om lucht te verwijderen die vastzit op de PDMS-coverslip-interface, drukt u heel voorzichtig met een vinger op het oppervlak. Druk voor een strakkere hechting sterker op hoeken en zijkanten. Zorg ervoor dat het plafond van de kamer niet in contact komt met het glazen oppervlak.
  4. Plaats de kamer met de glazen bodem naar de kookplaat gericht op 100 °C gedurende 5 minuten. Na deze stap worden de glas-PDMS-bindingen permanent en kunnen kamers slechts één keer worden gebruikt. Gebruik de kamer onmiddellijk of bewaar deze maximaal een week in een schone petrischaal.

4. [OPTIONEEL] Directe passivering en functionalisatie

OPMERKING: Afhankelijk van de toepassing kunnen kamers worden gepassiveerd en gefunctionaliseerd, hetzij eenmaal aangesloten op het microfluïdische besturingsapparaat (zie Materiaaltabel) of door oplossingen handmatig rechtstreeks in de kamer te injecteren met een pipet voordat deze op het microfluïdische apparaat wordt aangesloten. Dit laatste biedt het voordeel van het consumeren van minder reagens en het vermijden van potentiële verontreiniging door de oplossing door de polyetheretherketon (PEEK) -buis van het microfluïdische apparaat te laten stromen. In alle volgende stappen worden oplossingen geïnjecteerd door de pipetpunt direct in de uitlaat te steken. Om te voorkomen dat er bubbels in de kamer ontstaan, moet u ervoor zorgen dat er een klein druppeltje uit de pipetpunt steekt wanneer u de punt in de uitlaat van de PDMS-kamer steekt. Verwijder ook de pipetpunt voordat het volledige volume is geïnjecteerd.

  1. Injecteer 20 μL PLL-PEG (1 mg/ml in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)). Incubeer minimaal 1 uur (of een nacht) bij RT. Om verdamping te voorkomen, plaatst u de PDMS-kamer in een vochtige doos (bijvoorbeeld een lege tipbox met water in het onderste compartiment en de PDMS-kamer op het tip-holding platform).
  2. Injecteer 20 μL 100 pM spectrine-actinezaden (in F-buffer, zie tabel 1 en tabel 2). Wacht niet langer dan 1 minuut. Pas de zaadconcentratie en timing aan om de dichtheid van het zaadoppervlak af te stemmen, hoog genoeg voor grote statistieken en laag genoeg voor filamenten om elkaar niet te overlappen.
    OPMERKING: Als alternatief, als spectrine-actinezaden niet beschikbaar zijn, gebruik dan biotine-gefunctionaliseerde korte filamentsegmenten die worden geïmmobiliseerd op een streptavidin-gecoate coverslip 9,10.
  3. [OPTIONEEL] Injecteer 20 μL 5% runderserumalbumine (BSA) in F-buffer. Laat het bij RT voor 10 min.
  4. [OPTIONEEL] Injecteer 20 μL 1 mg/ml β-caseïne in F-buffer. Laat het bij RT voor 10 min.
    OPMERKING: Volg stap 4.3 en/of 4.4 om de kamer verder te passiveren. De keuze van de passivering hangt af van de gebruikte eiwitten en werkt niet op alle ABP's even goed. Bij gebruik van actine alleen is PLL-PEG of BSA voldoende.

5. Sluit een microfluïdisch apparaat aan

OPMERKING: Gebruik een op druk gebaseerd microfluïdisch systeem met maximaal vier kanalen om de stromen in de microfluïdische kamer te regelen (figuur 1A, zie materiaaltabel). Om te voorkomen dat zich bellen vormen in de microfluïdische slang en de stabiliteit van de stroming verstoren, ontgas alle oplossingen. Plaats 5 ml dH20 en 10 ml F-buffervoorraad in een vacuümdesiccator aangesloten op een vacuümpomp (ultiem vacuüm <250 mbar) en ontgas gedurende ten minste 1 uur bij RT.

  1. Spoelinlaten + uitlaatslangen met dH2O (500 μL, 300 mbar).
  2. Vul alle reservoirbuizen van 2 ml (zie materiaaltabel) met 300 μL F-buffer. Zet de druk op 300 mbar en laat vijf tot acht druppels verloren gaan. Herhaal dit voor elk kanaal en stel de druk in op 0.
  3. Sluit de uitlaat aan en spoel de kamer uitgebreid af.
    1. Stel de druk voor de reservoirbuis 4 (uitlaat) in op 50 mbar. Zodra er een druppel uit het uiteinde van de buis komt, sluit u de buis aan op de uitlaat van de PDMS-kamer. De vloeistof vult zich in de kamer en komt uit alle inlaten.
    2. [OPTIONEEL] Als de kamer direct is gepassiveerd (sectie 4), stel dan de druk in op 100 mbar om de kamer te spoelen met 50-100 μL F-buffer (3-5 min). Verwijder de overtollige vloeistof bij inlaten met een reinigingsdoekje.
    3. Stel de druk in op 20 mbar.
  4. Sluit inlaten aan.
    1. Stel de druk voor de reservoirbuis in op 1 tot 50 mbar. Om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan, moet u ervoor zorgen dat er een druppel uit de slang en de PDMS-inlaat komt.
    2. Sluit de slang aan op inlaat 1 (de twee druppels versmelten bij het verbinden). Stel de druk in op 30 mbar.
    3. Herhaal stap 5.4.1-5.4.2 om de inlaten 2 en 3 aan te sluiten.
  5. Stel de druk van alle inlaten in op 20 mbar en de uitlaatdruk op 0 mbar. Zorg ervoor dat de stroomsnelheden in de inlaten ongeveer gelijk zijn (zie sectie Problemen oplossen).

Figure 1
Figuur 1: Injecteren van oplossingen door een microfluïdische kamer. (A) Standaard microfluïdische opstelling voor experimenten met enkelvoudige actinefilamenten. Eiwitoplossingen, geplaatst in reservoirs 1-3, worden in de kamer geduwd door de druk in de gasfase aan te passen. De gegenereerde debieten worden gemeten door debietmeters. In de microfluïdische kamers mengen oplossingen zich niet en nemen ze ruimte in beslag, afhankelijk van de toegepaste relatieve druk (hier gelijke druk op alle inlaten). Typische afmetingen: reservoirbuizen bevatten maximaal 2 ml oplossing. PEEK-buizen (0,25 mm binnendiameter) verbinden de reservoirs met de stroommeters (na 10 cm buis) en vervolgens met de PDMS-kamer (na nog eens 70 cm). Siliconen buizen en roestvrijstalen buiskoppelingen worden gebruikt om de PEEK-buis aan te sluiten op de PDMS-inlaten. Het belangrijkste microfluïdische kanaal is 20-60 μm hoog, ongeveer 1 mm breed en 1 cm lang. (B,C) Stromingsprofielen in de microfluïdische kamer. (B) De vloeistof genereert een parabolisch profiel over de kamerhoogte: v(z) = 6z(h-z)R/h3w, waarbij h en w de kamerhoogte en -breedte zijn en R het totale debiet. Bodem: Enkel actine filament gepolymeriseerd uit oppervlakte-verankerde spectrine-actine zaden. (C) Wanneer de breedte van de kamer aanzienlijk groter is dan de hoogte, is de stroom bijna uniform over de kamer, behalve op de PDMS-oppervlakken, waar deze naar nul gaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. De opstelling configureren met standaard debieten

OPMERKING: Het computergestuurde druksysteem maakt een eenvoudige en nauwkeurige aanpassing van de drukken van alle inlaten/uitlaatgassen die op de PDMS-kamer zijn aangesloten, mogelijk, waardoor de inkomende en uitgaande stroomsnelheden worden geregeld. Vooraf ingestelde configuraties kunnen met één muisklik worden opgeslagen en in- en uitgeschakeld. Hieronder staan de aanbevolen configuraties (tenzij anders vermeld, is de uitlaatdruk ingesteld op 0 mbar). Zie tabel 3 voor verwachte stroomsnelheden voor deze vooraf ingestelde configuraties. De hier aangegeven drukken moeten worden aangepast afhankelijk van de kamergeometrie en systeemconfiguratie.

  1. Wijzigen: gebruik deze voorinstelling bij het wijzigen van een of meer reservoir(s). Het creëert een milde achterwaartse stroming in de slang van belang om het introduceren van bubbels te voorkomen.
    1. Stel alle inlaatdrukken in op 12 mbar en de uitlaatdruk op 5 mbar (figuur 2B).
  2. High Flow 'All': Gebruik deze preset om snel drie oplossingen parallel te injecteren. Ze bereiken de kamer binnen 4 minuten.
    1. Stel alle inlaatdrukken in op 150 mbar.
  3. High Flow 'x': Gebruik deze preset om snel een oplossing te injecteren. Het bereikt de kamer binnen 3 minuten (figuur 3A-C).
    1. Stel de inlaat 'x'-druk in op 150 mbar (~15 μL/min). De druk in de andere inlaten wordt aangepast tot ongeveer 100 mbar, zodat het resulterende debiet in deze inlaten ~500 nL/min is.
  4. Mid Flow 'All': Gebruik deze preset om het systeem te pauzeren.
    1. Stel alle inlaten in op 20 mbar (figuur 2A).
  5. Mid Flow 'x': Gebruik deze voorinstelling om de oplossing 'x' het grootste deel van de breedte van het hoofdkanaal te laten invullen (zie Figuur 2C,D), terwijl de andere inlaatoplossingen tot de kanaalzijden worden beperkt. Actinefilamenten in de kamer zullen dus worden blootgesteld aan de biochemische toestand die alleen door oplossing 'x' wordt opgelegd.
    1. Stel de inlaat 'x'-druk in op 12 mbar. Stel de druk in de andere inlaten in en pas deze aan op ~ 9 mbar, zodat hun respectieve stroomsnelheden ~ 150 nL / min zijn.

Figure 2
Figuur 2: De druk die op elk reservoir wordt uitgeoefend, regelt de verdeling/ruimtelijke verdeling van oplossingen in de microfluïdische kamer. (A) Bij gelijke druk op de reservoirs neemt elke oplossing een derde van de kamer in beslag. (B) Bij het verwisselen van een reservoirbuis (hier reservoir 3) daalt de effectieve druk tot nul, waardoor een achterwaartse stroom ontstaat. (C,D) Het verhogen van de relatieve druk op een van de reservoirs maakt blootstelling van het glasoppervlak aan een enkele oplossing mogelijk. Het gezichtsveld in het midden van de kamer kan sequentieel worden blootgesteld aan oplossingen 1 en 2 door af te wisselen tussen configuratie Mid Flow 1 (C) en Mid Flow 2 (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Oplossing 'x' wijzigen

OPMERKING: Zoals weergegeven in figuur 3A-C, is het belangrijk om in gedachten te houden dat het minuten duurt voordat oplossingen van een reservoirbuis naar het hoofdkanaal van de kamer stromen. Deze minimale 'dode' tijd wordt opgelegd door het vloeistofvolume in de buis en het stroomprofiel in de buis (figuur 3A-C).

  1. Bereid 200-300 μL oplossing in een nieuwe reservoirbuis. Stel de druk in op Instelling wijzigen (zie rubriek 6).
  2. Schroef de reservoirbuis van inlaat 'x' los. De oplossing in de buis zal langzaam naar achteren stromen, van de kamer naar de vrije buispunt. Het gemeten debiet wordt negatief (figuur 2B).
  3. Zodra zich een klein druppeltje heeft gevormd aan de buispunt, schroeft u de nieuwe buis in met de verse oplossing. Zodra de buis correct is vastgedraaid aan het druksysteem, keert het debiet van de inlaat terug naar positief.
  4. Stel de drukinstelling in op High Flow 'x'.
  5. Afhankelijk van de microfluïdische configuratie en kamergeometrie, wacht u 3-5 minuten totdat de oplossing de buis volledig heeft opgevuld en de kamer heeft bereikt.
  6. [OPTIONEEL] Volg dit proces door de toename van fluorescentie in de loop van de tijd te meten (figuur 3C).

Figure 3
Figuur 3: Vertraagde aankomst van oplossingen uit de reservoirs naar de PDMS-kamer en snelle verandering van biochemische omstandigheden. (A-C) Vertraagde aankomst van oplossingen van de reservoirs naar de PDMS-kamer. (A) Afhankelijk van de kamergeometrie, de buislengte en de uitgeoefende druk bij de inlaat(en), is de vervanging van de ene oplossing door een andere niet onmiddellijk. Na het veranderen van de reservoirbuis in een buis met een fluorescerende oplossing (0 min), vult de oplossing geleidelijk de buis (0,4 min) en de PDMS-kamer (1-2 min). Indicatieve timing wordt gegeven voor een 150 mbar toegepaste druk, 80 cm PEEK-buis en een 1600 μm brede, 20 μm hoge PDMS-kamer. (B) Het parabolische stromingsprofiel in de PEEK-buis genereert een effectieve gradiënt van fluorescentie langs het radiale profiel van de buis en in de kamer (zie ook figuur 1B). (C) Vertraagde aankomst van oplossingen kan worden gekwantificeerd door het achtergrondeposekscentiesignaal in de kamer te meten als functie van de tijd. Experimentele omstandigheden: 0,5 μM 10% Alexa-568-gelabelde G-actine wordt geïnjecteerd met 150 mbar via een flowmeter en 80 cm PEEK-buizen. (D,E) Snelle verandering van biochemische omstandigheden. (D) Patroon van binnenkomende oplossingen in twee Mid Flow-omstandigheden. (E) Toename van de fluorescentie op de achtergrond als uitlezing van de actineconcentratie. Tijd t = 0 wordt ingesteld als het begin van fluorescentie toeneemt. Oplossing 1: 0,5 μM 10% Alexa-488-gelabelde G-actine, oplossing 2: F-buffer. (C,E) PDMS-kamer: 20 μm hoog en 1600 μm breed. De epifluorescentie-intensiteit, ~ 2 μm boven het oppervlak, werd gekwantificeerd door het signaal over het volledige gezichtsveld te gemiddelden, genormaliseerd tot 0 in afwezigheid van fluorofoor en 1 met maximale intensiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

8. Basis single filament experiment: Adenosine difosfaat (ADP)-actine prikkeldraad en depolymerisatie

OPMERKING: Deze sectie gaat uit van een niet-gefunctionaliseerde kamer (alleen sectie 5). Als de kamer direct is gefunctionaliseerd (sectie 4), begin dan bij stap 8.4.

  1. Oppervlakte functionalisatie met actine filament zaden:
    1. Vervang oplossing 3 tot 200 μL van 50 pM spectrine-actinezaden11 in F-buffer (zie rubriek 7).
      OPMERKING: Als alternatief, als spectrine-actinezaden niet beschikbaar zijn, kan men biotine-gefunctionaliseerde korte filamentsegmenten gebruiken die worden geïmmobiliseerd op een streptavidin-gecoate coverslip (zie 9,10 voor details).
    2. Injecteer gedurende 2 minuten met High Flow 3.
      OPMERKING: Pas de concentratie en tijd aan, afhankelijk van de uiteindelijke zaaddichtheid.
  2. Oppervlaktepassivering:
    1. Wisselbuis 3 met 300 μL van 5% BSA in F-buffer.
    2. Injecteer gedurende 5 minuten bij High Flow 3, gevolgd door 5 min bij Mid Flow 3. Verlaag tijdens deze tweede stap de druk in kanalen 1 en 2 tot 7-8 mbar om een tegenstroom van ~ -100 nL / min te krijgen, zodat de hele kameroppervlakken BSA-gepassiveerd zijn.
      OPMERKING: Omdat de BSA-oplossing stroperiger is, moet de druk dienovereenkomstig worden aangepast.
  3. Wissel buis 3 naar F-buffer en spoel het kanaal af (5 min, High Flow 3).
  4. Bereid de volgende 200-300 μL-oplossingen, waarbij alle eiwitten worden verdund in F-buffer:
    Inlaat 1, polymerisatieoplossing: 1 μM 10% Alexa-488 gelabeld G-actine, 1 μM profiline (tabel 1).
    Inlaat 2, verouderingsoplossing: 0,15 μM 10% Alexa-488 gelabeld G-actine.
    Inlaat 3, depolymerisatieoplossing: alleen F-buffer.
    OPMERKING: Profilin wordt hier gebruikt om spontane nucleatie te voorkomen en om een constante concentratie van G-actine te handhaven.
  5. Wisselbuizen 1 tot en met 3 (rubriek 7). Injecteer met behulp van de High Flow All preset gedurende 3-4 min. De drie oplossingen hebben nu de PEEK-buis gevuld en de kamer bereikt (figuur 3A). Het glasoppervlak kan zonder dode tijd worden blootgesteld aan elke inlaatoplossing (<1 s, figuur 3D, E).
  6. Schakel de microscoop in. Stel de instellingen in: 150 mW 488 nm excitatielaser op 10% -20% vermogen, 100-200 ms camerabelichtingstijd, 200-300 nm TIRF-penetratiediepte, 60x objectief. Deze instellingen worden in het hele manuscript gebruikt.
  7. Filamentpolymerisatie (figuur 4A):
    1. Stel de drukinstelling in op Mid Flow 1 gedurende ~10 min.
    2. [OPTIONEEL] Record polymerisatie (1 frame/20 s, TIRF). Filamenten moeten polymeriseren bij ongeveer 10 subeenheden/seconde (sub/s)1,12.
  8. Filamentveroudering: Stel de drukinstelling in op Mid Flow 2 gedurende 15 minuten. Bij de kritische concentratie, 0,15 μM G-actine, blijft de filamentlengte constant en worden filamenten >99% ADP-F-actine4.
  9. Depolymerisatie (figuur 4A):
    1. Start de acquisitie met 1 frame/5 s, in epifluorescentiemodus. Omdat er een zeer lage fluorescentieachtergrond is in kanalen 2 en 3, is het niet nodig om TIRF te gebruiken.
    2. Schakel na één tot twee frames over naar Mid Flow 3. Filamenten moeten depolymeriseren met ongeveer 10 sub/s (referentie12).
  10. Om het experiment te resetten, breekt u alle fluorescerend gelabelde filamenten door ze continu bloot te stellen aan de laser met maximaal vermogen gedurende ~ 2 minuten. Om verschillende omstandigheden te testen, vervangt u oplossingen 1, 2 of 3 en injecteert u ze (High Flow, 3-4 min). Herhaal stap 8.7-8.9.

9. Andere experimenten met één filament

  1. Testen van de interacties van ABP's met F-actine
    OPMERKING: Microfluïdica is met succes gebruikt om de activiteit van verschillende zijbindende ABP's te kwantificeren, zoals cofiline, tropomyosine en Arp2/3. Volgens het protocol in paragraaf 8:
    1. Verander kanaal 3 naar de fluorescerende ABP van belang in F-buffer. Injecteren (High Flow 3, 3 min).
    2. Filamentpolymerisatie: Stel de drukinstelling in op Mid Flow 1 gedurende 10 min.
    3. ABP binding: Start acquisitie met TIRF. Pas de framesnelheid aan afhankelijk van de ABP-concentratie. Schakel na 1-2 frames over naar Mid Flow 3.
      OPMERKING: Afhankelijk van de ABP kan het ook mogelijk zijn om snel (bijvoorbeeld voor minder dan 5 s) over te schakelen naar Mid Flow 2 om de achtergrondfluorescentie bij het maken van een afbeelding verder te verminderen.
    4. ABP ontkoppelen: Schakel tijdens het voortzetten van de overname over naar Mid Flow 2.
  2. Polymerisatie met formin aan het vrije prikkeldraaduiteinde
    OPMERKING: Van formins is aangetoond dat ze de polymerisatie van filamentbarbecuede-uiteinden beïnvloeden. Microfluïdica is speciaal aangepast om formin bindings- en unbindingssnelheden en hun impact op filamentverlenging te meten.
    1. Bereid de volgende oplossingen voor:
      Kanaal 1: 10 nM formin in F-buffer (tabel 1).
      Kanaal 2: 1 μM 10% Alexa-488 gelabeld G-actine, 4 μM profiline.
      Kanaal 3: F-buffer.
    2. Wisselbuizen 1, 2 en 3 (sectie 7). Injecteer met behulp van de High Flow All preset gedurende 3-4 min.
    3. Filamentpolymerisatie initiëren: Stel de drukinstelling in op Mid Flow 2 gedurende 2 minuten.
    4. Formin binding aan filament barbed end: Stel de drukinstellingen in op Mid Flow 1 gedurende 30 s.
    5. Formin-gemedieerde polymerisatie: Stel de drukinstelling in op Mid Flow 2. Met formin mDia1 aan hun prikkeldraadeinde zouden filamenten moeten polymeriseren bij ongeveer 50 sub/s 13,14,15.
  3. Polymerisatie/depolymerisatie van oppervlakteverankerde voorgrond
    OPMERKING: De polymerisatie- en depolymerisatiesnelheden van met voormin versierde prikkeldraaduiteinden zijn afhankelijk van de spanning die op het filament wordt uitgeoefend. In microfluïdica genereert de wrijving van de vloeistofstroom langs de filamentzijde een spanning die evenredig is met de filamentlengte en met de stroomsnelheid14,16.
    1. Gebruik de hierboven beschreven methode in rubriek 8 en vervang stap 8.1, 8.2 en 8.3 voor oppervlaktepassivering door:
      1. Wisselbuis 3 tot 1 μg/ml anti-His antilichaam in F-buffer. Injecteer gedurende 2 minuten met High Flow 3.
      2. Wisselbuis 3 met 5% BSA in F-buffer. Injecteer gedurende 5 minuten bij High Flow 3, gevolgd door 5 min bij Mid Flow 3. Verlaag tijdens deze tweede stap de druk in kanalen 1 en 2 tot 7-8 mbar om een tegenstroom van ~ -100 nL / min te krijgen, zodat de hele kameroppervlakken BSA-gepassiveerd zijn.
      3. Wisselbuis 3 naar 100 nM His-tagged formin in F-buffer. Injecteer gedurende 5 minuten met High Flow 3. Wissel buis 3 met F-buffer. Injecteer gedurende 5 minuten met High Flow 3 om ervoor te zorgen dat er geen formins in de slang achterblijven.
    2. Bereid en injecteer de volgende oplossingen (elk 200-300 μL, in F-buffer):
      Kanaal 1: 1 μM 10% Alexa-488 gelabeld G-actine.
      Kanaal 2: 1 μM ongelabeld G-actine, 4 μM profiline.
      Kanaal 3: Alleen F-buffer.
    3. Filamentnucleatie: Stel de aan het oppervlak verankerde forminen bloot aan G-actine (instelling Mid Flow 1).
    4. Filamentpolymerisatie: Stel de kamer bloot aan profilin-actine met behulp van Mid Flow 2.
    5. Start acquisitie: 1 frame/2 s, epifluorescentie. Met formin mDia1 moeten filamenten polymeriseren met 50-80 sub / s, afhankelijk van de filamentlengte en het debiet14.
    6. Filament depolymerisatie: Start acquisitie (1 frame/4 s, epifluorescentie). Stel na 1-2 frames de filamenten bloot aan F-buffer, Mid Flow 3. Bij formin mDia1 moeten filamenten depolymeriseren bij 5-15 sub/s, afhankelijk van de filamentlengte en het debiet14.
  4. Actinefilamenten met ongelabelde segmenten
    OPMERKING: Actine fluorescerende etikettering creëert verschillende artefacten, zoals pauzes tijdens depolymerisatie17 en veranderde tropomyosinebinding18. Een tijdelijke oplossing voor deze artefacten is om microfluïdica te gebruiken om filamenten samen te stellen die ongelabelde segmenten weergeven.
    1. Bereid en injecteer de volgende oplossingen (200-300 μL in F-buffer):
      Kanaal 1: 1 μM ongelabeld G-actine, 1 μM profiline.
      Kanaal 2: 0,3 μM 10% Alexa-488 met het label G-actine.
    2. Stel het oppervlak sequentieel bloot aan kanaal 2 (5 min), kanaal 1 (10 min) en kanaal 2 (15 min) om ADP-actine ongelabelde segmenten te genereren met fluorescerend gelabelde segmenten aan elk uiteinde.
  5. Prikkeldraadeindgeankerde filamenten met gelsolin
    OPMERKING: Met spectrine-actinezaden polymeriseren filamenten aan hun vrije prikkeldraaduiteinde, terwijl het puntige uiteinde wordt gestabiliseerd door het spectrine-actinezaad. Een alternatief is om filamenten te verankeren met een prikkeldraadafsluiter zoals gelsolin.
    1. Bereid een F-actine-oplossing van 4 μM 10% Alexa-488 gelabeld G-actine in 20 μL F-buffer. Laat de actine spontaan nucleeren en polymeriseren bij RT gedurende ten minste 30 minuten op de bank. Wikkel de buis in aluminiumfolie om hem te beschermen tegen licht.
    2. Bereid ondertussen de microfluïdische kamer voor en passiveer het oppervlak met een mengsel van 5% BSA en 1% biotine-BSA (zie stap 8.2).
    3. Spoel kanaal 3 met F-buffer (2 min bij High Flow 3). Injecteer 10 μg/ml neutravidine in F-buffer (4 min bij High Flow 3).
    4. Verander buizen in:
      Kanaal 1: 10 nM biotine-gelsolin (tabel 1).
      Kanaal 2: F-buffer.
      Kanaal 3: 0,4 μM voorgepolymeriseerd F-actine.
    5. Injecteer alle oplossingen samen met behulp van de High Flow All-instelling gedurende 3 minuten.
    6. Stel de hele kamer bloot aan gelsolin (Mid Flow 1, 30 s).
    7. Bevestig filamenten aan het oppervlak (Low Flow 3: Kanaal 3 op 3 mbar, kanalen 1 en 2 op ~ 2 mbar, gedurende ongeveer 2 minuten).
    8. [OPTIONEEL] Als de filamentdichtheid te laag is, herhaalt u stap 9.5.6 en 9.5.7.
    9. Puntige einddepolymerisatie: Start acquisitie (1 frame/30 s, epifluorescentie). Stel filamenten na 1-2 frames alleen bloot aan buffer, Mid Flow 2. Filamenten moeten depolymeriseren bij ongeveer 0,2 sub/s.

10. Fascin-geïnduceerde filamentbundelvorming en -demontage door ADF/cofilin

OPMERKING: Om actinefilamentbundels te vormen, moet u ervoor zorgen dat u een voldoende hoge filamentzaaddichtheid aan het oppervlak van de kamer heeft. Bij blootstelling aan fascin-eiwit zullen naburige filamenten die lateraal fluctueren dynamisch worden verbonden door fascin-eiwitten. Omdat fascin snel loskomt van de filamentzijde19, moet fascin constant aanwezig zijn in de hoofdstroomoplossing om filamentbundeling te behouden.

  1. Volg de stappen 8.1-8.3.
  2. Bereid de volgende oplossingen (200-300 μL in F-buffer):
    Kanaal 1, polymerisatieoplossing: 1 μM 10% Alexa-488 gelabeld G-actine, 1 μM profiline.
    Kanaal 2, Bundeloplossing: 200 nM fascin (tabel 1), 0,15 μM 10% Alexa-488 gelabeld G-actine.
    Kanaal 3, Demontage-oplossing: 200 nM ADF/cofilin (tabel 1), 100 nM fascin, 0,15 μM 10% Alexa-488 gelabeld G-actine.
  3. Wisselbuizen 1 tot en met 3 (rubriek 7). Injecteer met behulp van de High Flow All preset, gedurende 3-4 min.
  4. Filamentpolymerisatie: Stel de drukinstelling in op Mid Flow 1 gedurende ~ 10 min. Polymerisatie kan worden afgebeeld met TIRF.
  5. Filamentbundeling (figuur 4C): Begin met beeldacquisitie (1 frame/5 s, epifluorescentie). Stel na 1-2 frames de drukinstelling in op Mid Flow 2 en observeer filamentbundeling.
  6. Bundelfragmentatie: Start beeldacquisitie (1 frame/5 s, epifluorescentie). Stel na 1-2 frames de drukinstelling in op Mid Flow 3 en observeer de door cofilin geïnduceerde demontage van zowel enkele filamenten als bundels.

11. Microfluïdische reinigingsprocedure voor apparaten

OPMERKING: Om verontreiniging van het ene experiment naar het andere te voorkomen, is het van cruciaal belang om alle slangen en stroommeters na elk experiment uitgebreid te reinigen en volledig te drogen.

  1. Koppel alle slangen los van de PDMS-kamer en gooi de kamer weg.
  2. Om PEEK-buizen en flowmeters te reinigen, plakt u de uiteinden van de buis in een lege plastic buis van 15 ml en injecteert u de volgende oplossingen op maximale druk totdat het reservoir bijna leeg is:
    400 μL F-buffer.
    400 μL van 0,5 M NaOH.
    400 μL zuiver water.
    200 μL isopropanol.
  3. Vervang door een leeg reservoir en blaas lucht totdat de slangen volledig droog zijn (~ 2-4 min, maximale druk).

12. Beeldanalyse

OPMERKING: Hoewel dit manuscript zich richt op de methode om enkelvoudige actinefilamenten in microfluïdica samen te stellen, te manipuleren en te visualiseren, wordt hier een korte methode gegeven om verworven films te analyseren. De analyse wordt uitgevoerd op 16-bits afbeeldingen, met behulp van ImageJ, volgens sectie 8.

  1. Beeldbehandeling is minimaal:
    1. Importeer de polymerisatie- of depolymerisatieafbeeldingsstack.
    2. [OPTIONEEL] Homogeniseer de beeldintensiteit met functie Achtergrond aftrekken (standaardinstellingen (d.w.z. 'Rollende balstraal' = 50 pixels)). Dit is met name handig als de achtergrondfluorescentie in de loop van een film verandert of als de fluorescentieverlichting niet homogeen is over het gezichtsveld.
    3. Pas de helderheid en het contrast aan (achtergrond in de buurt van nul, filamenten in de buurt van maximaal).
  2. Maak filament kymograaf:
    1. Selecteer een filament dat niet pauzeert, breekt of losmaakt. Selecteer niet op basis van anderszins gedrag. Teken een lijn 1-2 pixels boven (rechte lijn ). Sla het filamentnummer op ( ROI Manager toevoegen).
    2. Pas de functie Reslice toe (aantal segmenten: 5 pixels). Bereken de maximale intensiteit (functie Zprojection).
  3. Meet de polymerisatie/depolymerisatiesnelheid:
    1. Teken op de kymograaf een lijn langs het uiteinde van de filamentbarbecue (Straight Line-gereedschap , figuur 4A). Meet de lijnbreedte en -hoogte (functie Meten).
  4. Herhaal stap 12.2-12.3 over meerdere filamenten. Bereken de polymerisatie-/depolymerisatiesnelheden (figuur 4A):
    Equation 1, waarbij v de snelheid is (in sub/s), w de lijnbreedte (pixels), pix de pixelgrootte (nm), h de lijnhoogte (frames) en dt de tijd tussen frames (in seconde). Hier komt 2,7 nm overeen met de effectieve bijdrage van een actine-subeenheid aan de filamentlengte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voor alle hierboven beschreven experimenten moeten fluorescerend gelabelde actinefilamenten duidelijk zichtbaar zijn, met een goed contrast, wat wijst op een lage achtergrondfluorescentie vanaf het oppervlak (figuur 4, zie aanvullend bestand 1 voor het oplossen van veelvoorkomende problemen). Actinefilamenten mogen ook niet aan het oppervlak kleven: wanneer de dominante stroomsnelheid laag is, moeten de laterale fluctuaties van de actinefilamenten waarneembaar zijn wanneer ze live worden waargenomen en moet men duidelijk kunnen vaststellen dat ze alleen aan een van hun uiteinden zijn verankerd. Evenzo moeten bij het gebruik van TIRF-beeldvorming hun verticale fluctuaties zichtbaar zijn door veranderingen in intensiteit gedurende hun lengte en tijd. Afhankelijk van de toegepaste stroomsnelheden, kan het nodig zijn om de TIRF-penetratiediepte aan te passen om de beeldkwaliteit van de actinefilamenten die door TIRF worden verkregen te optimaliseren.

Bij blootstelling van filamenten aan polymerisatieomstandigheden (zie rubriek 8) moet de rek van filamenten regelmatig plaatsvinden (d.w.z. de rek aan het einde van de gloeidraad wordt niet belemmerd door oppervlakte-interactie of permanent plakken). Bovendien moet de gemeten rek van het prikkeldraadeind overeenkomen met de verwachte waarde volgens de actineconcentratie in de buis 1,20, wat aangeeft dat de buisoplossing correct naar de microfluïdische kamer is gestroomd (figuur 4A). Evenzo moeten filamenten, wanneer ze worden blootgesteld aan een bufferoplossing, gestaag depolymeriseren met een snelheid die hun ADP-gehalteweerspiegelt 4 (figuur 4A). Bij het blootstellen van reeds gekweekte actinefilamenten aan een oplossing van fluorescerend gelabeld cofiline, zullen cofilinclusters nucleair zijn en groeien naar zowel de puntige als de prikkeldraad (figuur 4B) met een snelheid die afhankelijk is van de cofilineconcentratie. Bij het beoordelen van een potentiële cross-linking activiteit van een ABP, zoals fascin (figuur 4C), zullen nabijgelegen actinefilamenten die bundels vormen gemakkelijk worden gedetecteerd door hun hogere fluorescentie-intensiteit en een verandering in hun laterale fluctuaties.

De vloeistofstroom oefent een viskeuze wrijvingskracht uit op actinefilamenten die zijn verankerd aan het oppervlak van de microfluïdische kamer. De wrijvingskrachtcoëfficiënt op F-actine is η = 6,10-4 pN·s/μm2, uitgedrukt per filamentmicronlengte14. Bij tussende stroomsnelheden, aangezien de gloeidraadhoogte rond een constant gemiddelde van 250 nm boven het oppervlak schommelt, bestaat er een krachtgradiënt van het vrij zwevende uiteinde tot aan het ankerpunt van de gloeidraad. Men kan daarom de toegepaste spanning op elk punt langs de gloeidraad berekenen, met behulp van F = 6ηπLv, waarbij v de lokale stroomsnelheid is 250 nm boven het oppervlak (figuur 1B) en L de stroomafwaartse filamentsegmentlengte is (d.w.z. van het beschouwde punt tot aan het vrije uiteinde). Voor hogere stroomsnelheden is de gemiddelde hoogte van de gloeidraad niet constant, maar neemt lineair toe van het verankeringspunt naar het vrije uiteinde, blijft gemiddeld onder de 250 nm en zal variëren afhankelijk van de stroomsnelheden, wat leidt tot een complexer spanningskrachtprofiel langs de gloeidraad21.

Figure 4
Figuur 4: Representatieve resultaten. Typische experimenten waarbij actinefilamenten worden gepolymeriseerd uit spectrine-actinezaden en worden blootgesteld aan verschillende ABP's. Voor de duidelijkheid wordt slechts een fractie van het gezichtsveld getoond. (A) Resultaat van het basispolymerisatie-depolymerisatie-experiment (sectie 8). Filamenten worden gepolymeriseerd met een oplossing van 0,8 μM 10% Alexa-488 gelabeld G-actine, gerijpt gedurende 15 minuten om alle subeenheden om te zetten in ADP-actine (niet weergegeven), en gedepolymeriseerd wanneer ze alleen worden blootgesteld aan F-buffer. Onder: kymografen die worden gebruikt om de polymerisatie- en depolymerisatiesnelheden te kwantificeren. Verkregen bij 1 frame/5 s, 200 ms belichtingstijd, 150 mW 488 nm laser bij 9% vermogen, TIRF (laserpenetratiediepte 250 nm). B) Fragmentatie van enkelvoudige actinefilamenten met 500 nM mCherry-cofilin-1. Actine is gelabeld met ATP-ATTO48822 (geel) en cofilin-1 is gefuseerd met mCherry (blauw). Boven: fractie van een gezichtsveld. Opmerking: eiwitaggregaten op het oppervlak. Onder: kymograaf die de binding van cofiline-1 aan een filament toont (pijlpunten tonen cofilin-1 domeinnucleatiegebeurtenissen), wat leidt tot een fragmentatiegebeurtenis (bliksemsymbool). Verkregen bij 1 frame/4 s, 200 ms belichting, 150 mW 488 nm laser bij 16% en 100 mW 561 nm laser bij 12% vermogen, epifluorescentie. C) Bundeling van actinefilamenten per fascin (punt 10.5). Filamenten werden eerst gepolymeriseerd met 0,8 μM 5% Alexa-488 gelabeld G-actine en gebundeld met 200 nM fascin. In vergelijking met enkele filamenten lijken filamentbundels twee- tot drievoudig helderder en niet perfect uitgelijnd met de stroom. Verworven bij 1 frame/10 s, 200 ms blootstelling, 20% 200 W Kwiklampintensiteit, epifluorescentie. (A-C) De achtergrond werd afgetrokken met de ad hoc functie van ImageJ. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Eiwit naam soort Uniprot ref (volgorde) origineel zuiveringsprotocol ref. Opmerkingen
Actin konijn P68135 (volledige lengte) 23 Voor fluorescerende etikettering, zie ref 24
Profilin1 menselijk P07737 (volledige lengte) 25 zie ook ref 11
Spectrine-actine zaad menselijk N.v.t 26, 27 zie ook ref 11
Cofilin1 muis P18760 (volledige lengte) 28
gelsolin menselijk P06396 (volledige lengte) 29
mDia1 voorgrond muis O08808 (aa 552-1255) 13 meer gedetailleerd protocol in ref 24
fascin1 menselijk Q16658 (volledige lengte) 30

Tabel 1: Actine- en actinebindende eiwitten 23,24,25,26,27,28,29,30

Reagens concentratie
Tris-HCl pH 7,4 5mM
Kcl 50m
MgCl2 1 mM
EGTA 0,2 mM
Atp 0,2 mM
DTT 10m
Dabco 1 mM

Tabel 2: F-buffersamenstelling. DABCO en een relatief hoge concentratie DTT worden gebruikt om foto-geïnduceerde schade aan filamenten als gevolg van blootstelling aan licht tijdens fluorescentiemicroscopie-experimenten te beperken.

Namen instellen Druk (mBar) Debiet (nL/min)
Maximale druk 300 ~ 30 000 (in dominant kanaal)
Hoge druk 150 ~ 15 000 (in dominant kanaal)
Middendruk 12 ~ 1500 (in dominant kanaal)
'Verander' druk 12 voor alle inlaten,
5 voor outlet		 ~ 500 (in elke inlaat)

Tabel 3: Overeenstemming tussen uitgeoefende drukken en gemeten debieten. De resulterende stroomsnelheden zijn sterk afhankelijk van de experimentele opstelling. Waarden worden gegeven voor een microfluïdische kamer met een 1 cm lang hoofdkanaal van doorsnede 20 μm x 800 μm (hoogte x breedte), verbonden met elk reservoir met 80 cm lange PEEK-buis.

Aanvullend bestand 1: Klassieke problemen, oorzaken en oplossingen. Ze ondervonden vaak problemen bij het werken met microfluïdica en / of enkelvoudige actinefilamenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vergeleken met standaard single-filament methoden waarbij actinefilamenten op meerdere punten over hun lengte aan het oppervlak worden verankerd of er dicht bij worden gehouden door een verdringingsmiddel zoals methylcellulose, biedt microfluïdica een aantal voordelen. Omdat interacties met het oppervlak minimaal zijn, worden de kunstmatige pauzes die deze interacties kunnen induceren tijdens zowel rek als depolymerisatie vermeden. De filamenten worden uitgelijnd door de stroom, parallel aan elkaar, waardoor hun monitoring en de meting van hun lengtes wordt vergemakkelijkt. De oplossing rond de filamenten wordt voortdurend vernieuwd, waardoor ze worden blootgesteld aan constante eiwitconcentraties. Door snel (<1 s, figuur 3D, E) te kunnen schakelen tussen verschillende eiwitoplossingen waaraan de filamenten worden blootgesteld, kan men tijdgestuurde sequentiële experimenten uitvoeren, die vaak instrumenteel zijn voor kinetische studies. Ten slotte kan de viskeuze weerstand die door de stromende oplossing op de filamenten wordt uitgeoefend, worden gebruikt om gecontroleerde mechanische spanning op de filamenten uit te oefenen (sectie Representatieve resultaten). Men moet opmerken dat gematigde vloeistofstromen (Mid Flow drukinstellingen) filamenten dicht genoeg bij het oppervlak brengen (~ 250 nm) om ze efficiënt in beeld te brengen met TIRF terwijl ze minimale spanning genereren (<1 pN)14.

In vergelijking met klassieke single-filament assays zullen microfluïdica echter grotere volumes eiwitoplossingen vereisen: meestal een paar 100 μL, wanneer een standaardexperiment kan worden gedaan met minder dan 10 μL. Dit kan een beperking zijn bij het gebruik van kostbare eiwitten. Klassieke experimenten kunnen worden gebruikt om de relevante experimentele omstandigheden (bijvoorbeeld absolute of relatieve concentraties van verschillende eiwitten) vast te stellen voordat een reeks microfluïdische experimenten wordt gestart. Een andere beperking, zoals voor alle andere single-filament technieken in vitro, komt van de onvolmaakte passivering van het coverslip oppervlak. De reproduceerbaarheid bij het reinigen en binden van de passiveringslaag (BSA, PEGylation, etc.) is altijd moeilijk te controleren. Een eenstaps passiveringstechniek op basis van PEG-silaan oppervlaktebehandeling is in veel laboratoria de voorkeurstechniek geworden 7,15. Als zodanig kan de effectieve dichtheid van filamentzaden tussen experimenten ongeveer tweevoudig variëren, zelfs wanneer ze zo nauwkeurig mogelijk worden herhaald. Men moet streven naar een bevredigend bereik van de oppervlaktedichtheid van de filamenten en bereid zijn om het experiment indien nodig te herhalen. Veel voorkomende problemen bij het werken met microfluïdica en/of enkelvoudige actinefilamenten worden besproken in aanvullend dossier 1.

Voor het basisprotocol dat hier wordt gepresenteerd, moet men opmerken dat spectrine-actinezaden, die kunnen worden gezien als korte gestabiliseerde filamenten, willekeurig georiënteerd zijn terwijl ze aan het oppervlak kleven. Als gevolg hiervan, als de filamenten die uit deze zaden worden gekweekt, uitlijnen met de stroom, zal hun deel dat het dichtst bij het zaad ligt scherp worden gebogen, elk met zijn eigen hoek. De lengte waarover filamenten worden gebogen is meestal erg klein wanneer filamenten worden blootgesteld aan middelhoge of hoge stromen. In feite zal deze lengte over het algemeen kleiner zijn dan de diffractielimiet (~ 200 nm) en zal dus niet gemakkelijk worden gedetecteerd. Belangrijk is dat de ABP's die gevoelig zijn voor filamentkromming anders zullen binden en functioneren in dit sterk gebogen gebied. Om vertekenende resultaten te voorkomen, is het eenvoudigste om dit gebied uit te sluiten van de analyse21.

Voordat we microfluïdica begonnen te gebruiken om enkelvoudige actinefilamenten te manipuleren en te visualiseren, werd het al gebruikt om enkele DNA-filamenten3 te bestuderen, die veel flexibeler zijn. Dit kan aanleiding geven tot opmerkelijke verschillen, omdat de stroom dna dramatisch kan afwikkelen en de schijnbare lengte drastisch kan veranderen. Microfluïdica kan ook worden gebruikt, zeer vergelijkbaar met de hier gepresenteerde methode, om microtubuli te bestuderen; deze zijn veel stijver, maar kunnen niettemin worden afgestemd op de stroom om hun rek en depolymerisatie te meten, gebruikmakend van de snelle wisseling van omstandigheden31,32, of worden gebogen door een loodrechte stroom om de plasticiteit van microtubuli te meten7.

We hebben hier het protocol voor het basisexperiment gepresenteerd, waarbij filamenten slechts aan één uiteinde worden verankerd en waarbij de stroomrichting in het gezichtsveld gedurende het hele experiment hetzelfde is. Deze twee kenmerken kunnen worden gevarieerd. Filamenten kunnen bijvoorbeeld door meerdere punten worden verankerd om een ander krachtprofiel langs het filament te genereren. Evenzo kan de stroomrichting worden gevarieerd (in de buurt van de kruising tussen de ingangskanalen, in de stroomkamer) om filamenten lokaal te buigen, omdat het niet-geanchoreerde deel in een andere richting wijst dan het verankerde filamentsegment21. Filamenten die langwerpig zijn uit willekeurig verankerde spectrine-actinezaden kunnen ook worden blootgesteld aan cross-linking eiwitten om bundels te vormen33 (zie rubriek 10). Door microfluïdica te combineren met andere technieken (micropattterning, optische pincetten, enz.) of door microfluïdische kamers met compartimenten te ontwerpen om stromingslijnen te wijzigen, kunnen meerdere configuraties worden gemaakt om specifieke ABP-activiteit op afzonderlijke filamenten te bestuderen of om kleine actinenetwerken te vormen34. Het aantal combinaties, samen met het voordeel en de veelzijdigheid van microfluïdica, biedt onderzoekers veel handvatten om de spatio-temporele regulatie van actinenetwerken op moleculaire schaal te ontcijferen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgments

We zijn de B. Ladoux en R.-M. dankbaar. Mège lab voor het gebruik van hun UV-reiniger apparatuur, en J. Heuvingh en 0. du Roure voor de initiële training die we kregen over het bereiden van mallen op siliciumwafers en het geven van tips over microfluïdica. We erkennen financiering van European Research Council Grant StG-679116 (aan A.J.) en Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin en Conformin (aan G.R.-L.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-Casein Merck C6905 Used at 8 mg/mL
Biopsy punch (with plunger) Ted Pella 15115-2 ID 0.75 mm, OD 1.07 mm
Biotin-BSA Merck A8549 Used at 1 mg/mL
BSA Merck A8022 Used at 50 mg/mL
Coverslip Mini-Rack
Teflon holder		 Invitrogen C14784 for 8 coverslips
Coverslips 22x40mm
Thickness #1.5		 Menzel Gläser 631-1370
DABCO Merck D27802 component in f-buffer
DTT Euromedex EU0006-D component in f-buffer
Ester NHS Alexa Fluor 488 Invitrogen A20000 Fluorophore for actin labeling on Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific 21338 To biotinylate actin on Lys328
Hellmanex III Hellma 9-307-011-4-507 Glass cleaning detergent
ImageJ NIH N/A open source software
Laboport KNF 811kn.18 vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)
Magic invisible tape Scotch 7100024666 standard transparent office tape
Micrewtube Simport T341-6T 2 mL microfluidic reservoir tubes
Microfluidic device Part 1: Flow Unit S Fluigent FLU-S-D-PCKB Flowmeter
Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL Fluigent 14002001PCK Reservoir holder
Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ Fluigent EZ-11000001
EZ-00345001		 Pressure controller
Model 42 - UVO-Cleaner Jelight Inc. 42-220 Ultraviolet cleaner
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 Jena Bioscience NU-805-488 ATP-ATTO used to label actin
neutravidin Thermo Scientific 31000
PLL-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) Use at 1 mg/mL in PBS.
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer Dow Corning 1673921 Contains PDMS base and curing agent
Polyetheretherketone (PEEK) tubing Merck Z226661 “Blue” : I.D. = 0.25 mm
Safety blow gun Coilhose Pneumatics 700-S filtered air
Silicon tubing VWR 228-0701P connect PEEK to coupler
Stainless steel catheter coupler Prime Bioscience SC22/15 Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing
Thermoplastic film Sigma Aldrich PM996 Standard "parafilm"
Ultrapure ethanol VWR 64-17-5
Ultrasonic cleaning bath VWR USC200TH To accomodate 1 L beakers
Vacuum dessicator SP Bel-Art F42022-0000 to degas the PDMS or solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).
  2. Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).
  3. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  4. Jégou, A., et al. Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin. PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).
  5. Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
  6. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  7. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  8. Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins. Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).
  9. Funk, J., et al. Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth. eLife. 8, 50963 (2019).
  10. Pandit, N. G., et al. Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).
  11. Wioland, H., et al. ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends. Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).
  12. Pollard, T. D., Mooseker, M. S. Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores. The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).
  13. Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin. Cell. 124 (2), 423-435 (2006).
  14. Jégou, A., Carlier, M. -F., Romet-Lemonne, G. Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments. Nature Communications. 4, 1883 (2013).
  15. Breitsprecher, D., et al. Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging. Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).
  16. Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).
  17. Niedermayer, T., et al. Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).
  18. Gateva, G., et al. Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro. Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).
  19. Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia. Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).
  20. Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. The Journal of Cell Biology. 103, Pt 2 2747-2754 (1986).
  21. Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).
  22. Colombo, J., et al. A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics. Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).
  23. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  24. Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly. Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).
  25. Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms. European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).
  26. Lin, D. C., Lin, S. Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).
  27. Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments. The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).
  28. Kremneva, E., et al. Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres. Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).
  29. Le Clainche, C., Carlier, M. -F. Actin-based motility assay. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 12 1-20 (2004).
  30. Vignjevic, D., et al. Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).
  31. Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. eLife. 5, 13470 (2016).
  32. Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
  33. Suzuki, E. L., et al. Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity. Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).
  34. Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).

Tags

Biochemie Nummer 183
Microfluïdica en fluorescentiemicroscopie gebruiken om de assemblagedynamiek van single actinefilamenten en -bundels te bestuderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wioland, H., Ghasemi, F.,… More

Wioland, H., Ghasemi, F., Chikireddy, J., Romet-Lemonne, G., Jégou, A. Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63891, doi:10.3791/63891 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter