Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63891
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université Paris Cité, CNRS, Institut Jacques Monod

Summary

Basit aktin filament mikroakışkan tahlilleri için, floresan mikroskobu ile birlikte, bireysel aktin filamentlerini gerçek zamanlı olarak doğru bir şekilde izlemeyi ve sırayla farklı protein çözeltilerine maruz bırakmayı sağlayan protokoller sunuyoruz.

Abstract

Aktin filamentlerinin montajını ve sökülmesini düzenleyen karmaşık moleküler mekanizmaları deşifre etmek için, iyi kontrol edilen koşullarda yaşayan bireysel reaksiyonları izlemek büyük bir varlıktır. Bunu yapmak için, son 20 yılda, çoğunlukla toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak canlı tek filament deneyleri ortaya çıkmış ve bir dizi önemli sonuç sağlamıştır. 2011 yılında, bu deneylerin olanaklarını daha da genişletmek ve tekrarlayan sorunlu eserlerden kaçınmak için, bu testlere basit mikroakışkanlar getirdik. Bu çalışma, bireysel aktin filamentlerinin pasifleştirilmiş örtü kayma yüzeyine bir ucuyla tutturulduğu, akışla hizalandığı ve farklı protein çözeltilerine art arda maruz bırakılabildiği temel protokolümüzü detaylandırmaktadır. Ayrıca belirli uygulamalar için protokolleri sunuyoruz ve akan çözeltinin viskoz sürtünmesi sayesinde kontrollü mekanik kuvvetlerin nasıl uygulanabileceğini açıklıyoruz. Bu deneylerin teknik uyarılarını vurguluyoruz ve bu tekniğe dayanan olası gelişmeleri kısaca sunuyoruz. Bu protokoller ve açıklamalar, günümüzde kullanımı kolay mikroakışkan ekipmanlarının mevcudiyeti ile birlikte, uzman olmayanların bu testi laboratuvarlarında uygulamalarına izin vermelidir.

Introduction

Aktin filamentlerinin ve aktin filament ağlarının montajı ve sökülmesi, çeşitli biyokimyasal reaksiyonlarla kontrol edilir ve mekanik bağlama bağlıdır. Bu karmaşık mekanizmalar hakkında fikir edinmek için, bireysel filamentler üzerindeki bireysel reaksiyonları (yeterince büyük sayılarda) gözlemleyebilmek paha biçilmezdir. Son yıllarda, dinamik aktin filamentlerinin gerçek zamanlı olarak, çoğunlukla toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak gözlemlenmesi, anahtar bir teknik olarak ortaya çıkmış ve toplu çözelti biyokimyasal tahlilleri ile elde edilemeyen sonuçların etkileyici bir listesini sağlamıştır1.

Bunu başarmak için, floresan olarak etiketlenmiş aktin filamentlerini mikroskop kapağının yüzeyine yakın tutmak ve bunları floresan olarak etiketlenebilen aktin bağlayıcı proteinlerin (ABP'ler) çözeltilerine maruz bırakmak gerekir. Bunu yapmak, iyi kontrol edilen biyokimyasal koşullarda bireysel filamentlerde meydana gelen olayları izlemek ve böylece reaksiyon hızlarını ölçmek için bir araç sağlar. Bununla birlikte, bir dizi özel sınırlama dikkate alınmalıdır. Filamentlerin yüzeye yakın yapay olarak korunması, genellikle birden fazla sabitleme noktası sayesinde veya metilselüloz gibi bir kalabalık ajan kullanarak, davranışlarını değiştirebilir (örneğin, polimerizasyon ve depolimerizasyonda duraklamalara neden olabilir2). Her bir filamentin konturunu izlemek, özellikle de zaman içinde görüş alanında yeni filamentler veya filament parçaları birikirse, zor olabilir. Reaksiyonlar, aktin monomerlerinin ve ABP'lerin konsantrasyonunun zamanla değişebileceği sonlu bir hacimde gerçekleşir ve potansiyel olarak doğru hız sabitlerinin elde edilmesini zorlaştırır. Son olarak, ABP'lerin çözeltisinin yenilenmesi veya değiştirilmesi 30 saniyeden daha kısa sürede elde etmek zordur ve genellikle numunede homojen olmayan protein içeriğine yol açacaktır.

10 yıldan biraz daha uzun bir süre önce, bireysel Deoksiribonükleik Asit (DNA) iplikçikleri3'ü incelemek için zaten yapılanlardan esinlenerek, bireysel aktin filamentlerini gözlemlemek ve manipüle etmek için mikroakışkanlara dayanan yeni bir teknik sunduk4. Klasik tek filament tekniklerinin yukarıda belirtilen sınırlamalarını aşmaya izin verir. Bu mikroakışkan tahlillerinde, aktin filamentleri, kapak kayması üzerine adsorbe edilen spektrin-aktin tohumlarından yetiştirilir. Filamentler böylece bir uçtan sadece mikroakışkan odanın dibine sabitlenir ve yapışmadan yüzeyin üzerinde dalgalanır. Filamentler, gelen çözeltilerin akışıyla aynı hizadadır, böylece kontur uzunluklarının izlenmesini kolaylaştırır ve bunları TIRF'nin kullanılabileceği kapak kaymasının üzerindeki sığ bir bölgede tutar. Farklı çözeltiler aynı anda karıştırmadan odaya akar ve filamentler bunlara sırayla ve hızlı bir şekilde maruz bırakılabilir.

Burada, laboratuvarda tek aktin-filament mikroakışkan testleri oluşturmak için bir dizi temel protokol öneriyoruz. Kapaklar ve mikroakışkan odaları önceden hazırlanabilir (yarım gün içinde) ve birkaç biyokimyasal koşulun test edilebileceği deneyin kendisi bir günden daha kısa sürede yapılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikroakışkan oda hazırlığı

  1. Birkaç hazne desenine sahip bir SU-8 ana kalıp seçin. Tipik odalar, 20 μm yüksekliğinde ve 800 μm genişliğinde üç giriş ve bir çıkış ile çapraz şekillidir (Şekil 1). Bu tür ana kalıplar harici şirketlerden satın alınabilir veya akademik laboratuvarlarda yapılabilir (örneğin, Gicquel, Y. ve ark.5).
  2. Bandı kalıbın kenarına yerleştirin.
    1. ~50 cm uzunluğunda, 19 mm genişliğinde, standart şeffaf ofis bandını (bkz. Malzeme Tablosu) yapışkan tarafı yukarı doğru bir tezgahın üzerine koyun. Kalıbı dikey olarak bir uca ve bandın orta çizgisi boyunca yerleştirin.
    2. Kalıbın etrafında 1 cm'lik bir kenarlık oluşturmak için kalıbı bandın diğer ucuna yuvarlayın. Bandı kalıbın dibine katlayın.
  3. Polidimetilsiloksan (PDMS) çözeltisi hazırlayın.
    1. Tek kullanımlık bir tartım kabında, doğrudan 25-30 g PDMS tabanı dökün (Malzeme Tablosu). Tek kullanımlık plastik Pasteur pipetle %10 ağırlık/ağırlık PDMS kürleme maddesi (Malzeme Tablosu) ekleyin.
    2. Plastik bir çubukla manuel ve iyice karıştırın. Kürleme maddesinin, karıştırma çok sayıda kabarcık oluştursa bile, PDMS tabanına iyi bir şekilde dahil edildiğinden emin olun.
  4. PDMS çözeltisini oda sıcaklığında (RT) en az 5 dakika boyunca vakumlu bir kurutucuda (Malzeme Tablosu) gazdan arındırın. Kabarcıklar genişleyecek, yüzeye çıkacak ve vakum kırıldığında patlayacaktır.
  5. PDMS çözeltisini SU-8 kalıbının üzerine dökün. Karışımın mümkün olduğunca çoğunu kazımak ve aktarmak için plastik bir çubuk kullanın.
  6. PDMS'yi ikinci kez gazdan arındırın (vakumlu kurutucuda 5 dakika). Çoğu kabarcıktan kurtulduğunuzdan emin olun (üst yüzeydeki birkaç küçük kabarcık iyidir).
  7. PDMS'nin retiküle olması ve katılaşması için kalıbı 70 °C'de en az 5 saat boyunca bir fırına yerleştirin.
  8. Katı PDMS odalarını kalıptan çıkarın.
    DİKKAT: SU-8 kalıpları için silikon gofretler son derece kırılgandır, bu nedenle PDMS'yi gofretlerden ayırırken kapsamlı özen gösterilmelidir. Sert, düz bir yüzey üzerinde çalışın ve gofreti yüzeyde düz tutun.
    1. Bir tıraş bıçağı ile, PDMS'de, kalıbın kenarından yaklaşık 1 cm uzakta dairesel bir kesim yapın. Tüm desenler kesimin içinde en az 0,5 cm olmalıdır. Merkezi PDMS bloğunu nazik römorkörlerle yavaşça soyun.
      DİKKAT: Soyulurken, kırılmasını önlemek için SU-8 kalıbını tezgahın üzerinde düz tutun.
    2. PDMS'yi, yüzeyini tozdan korumak ve desenleri daha görünür hale getirmek için alüminyum folyoya bakan kalıplanmış yüzey olan temiz alüminyum folyo üzerine yerleştirin.
  9. Desenden en az 0,5 cm uzakta jilet bıçağı olan bir oda seçin ve kesin. Ortaya çıkan PDMS bloğu yaklaşık 0,5 cm yüksekliğinde, 1,5 cm genişliğinde ve 3 cm uzunluğundadır. Biyopsi zımba 0.75 mm ID (Malzeme Tablosu) ile üç giriş ve bir çıkış delin.
  10. PDMS odasını ultra saf etanol (Malzeme Tablosu) ile temizleyin ve güvenli bir üfleme tabancası (Malzeme Tablosu) kullanarak hava ile kurutun. PDMS'yi deseni yukarı bakacak şekilde temiz bir Petri kabına yerleştirin ve kabı kapağıyla kapatın.

2. Cam kapak kapağı temizliği

NOT: Burada, bir dizi sonikasyon adımına dayanan standart bir kapak kapağı temizleme prosedürü detaylandırılmıştır. Diğer cam kapak temizleme prosedürleri, benzer tatmin edici sonuçlar elde edebilecek diğer birçok yayında tanımlanmıştır 6,7,8,9.

  1. Bir Politetrafloroetilen (PTFE) tutucu üzerine 10-20 kapak kapağı (40 mm uzunluğunda) yerleştirin (Malzeme Tablosu). Kapakları 1 L cam beherde (35 ° C, 30 dakika) 0,5 L% 2 cam temizleme çözeltisinde (Malzeme Tablosu) sonikleştirin.
  2. Cam temizleme solüsyonunu atın ve kapakları dH2O ile en az üç ardışık 0,5 L banyoda yoğun bir şekilde durulayın.
  3. 1 L'lik bir cam beherde 0,5 L 2 M KOH hazırlayın. Kapak fişlerini KOH olarak sonikleştirin (RT, 30 dk). KOH'yi atın ve kapakları dH2O ile en az üç 0,5 L banyoda durulayın.
    DİKKAT: Uygun laboratuvar güvenliği koruma ekipmanlarını (eldivenler, gözlükler ve laboratuvar önlüğü) kullanın.
  4. Kapakları 0,5 L ultra saf etanol (RT, 30 dakika) içinde aktarın ve sonikleştirin. Kapaklar 2 haftaya kadar etanolde tutulabilir. Buharlaşmayı önlemek için beheri termoplastik filmle (Malzeme Tablosu) kapatın. Kullanmadan önce, kapak kaymasını hava akımı ile kurulayın.

3. PDMS oda montajı

  1. Sıcak plakayı önceden 100 °C'ye ısıtın. Üç adede kadar temizlenmiş PDMS haznesini ve cam kapakları temiz bir Petri kabına yerleştirin. Açık Petri kabını derin bir Ultraviyole (UV) temizleyiciye (λ = 185 nm, Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin ve 3-5 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın.
    NOT: Alternatif olarak, PDMS odaları ve kapakları 30 saniye boyunca havaya veya oksijen plazmasına maruz kalabilir.
  2. PDMS odasını yavaşça kapak kapağının üzerine yerleştirin. Temas eden iki yüzeyin doğrudan UV'ye maruz kaldığından emin olun. PDMS otomatik olarak cama yapışır ve hazne açıkça görünür hale gelir.
  3. PDMS-coverslip arayüzünde sıkışan havayı gidermek için, yüzeye parmağınızla çok nazikçe bastırın. Daha sıkı bir yapıştırma için, köşelere ve kenarlara daha güçlü bir şekilde bastırın. Odanın tavanının cam yüzeyle temas etmediğinden emin olun.
  4. Odayı, cam tabanı sıcak plakaya bakacak şekilde 5 dakika boyunca 100 °C'ye yerleştirin. Bu adımdan sonra, cam-PDMS bağları kalıcı hale gelir ve odalar sadece bir kez kullanılabilir. Odayı hemen kullanın veya bir haftaya kadar temiz bir Petri kabında saklayın.

4. [İSTEĞE BAĞLI] Doğrudan pasivasyon ve işlevselleştirme

NOT: Uygulamaya bağlı olarak, hazneler mikroakışkan kontrol cihazına bağlandıktan sonra ( Malzeme Tablosuna bakınız) veya mikroakışkan cihaza bağlanmadan önce çözeltileri doğrudan bir pipetle birlikte odaya manuel olarak enjekte ederek pasifleştirilebilir ve işlevselleştirilebilir. İkincisi, daha az reaktif tüketme ve çözeltiyi mikroakışkan cihazın polieter eter keton (PEEK) borusundan geçirerek potansiyel kontaminasyonu önleme avantajı sunar. Aşağıdaki tüm adımlarda, pipet ucu doğrudan prize yapıştırılarak çözeltiler enjekte edilir. Haznenin içinde kabarcıklar oluşmasını önlemek için, ucu PDMS haznesinin çıkışına takarken pipet ucundan küçük bir damlacık yapıştığından emin olun. Aynı şekilde, tüm hacim enjekte edilmeden önce pipet ucunu çıkarın.

  1. 20 μL PLL-PEG enjekte edin (Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 mg/mL). RT'de en az 1 saat (veya bir gecede) inkübe edin. Buharlaşmayı önlemek için, PDMS haznesini nemli bir kutuya yerleştirin (örneğin, alt bölmede su bulunan boş bir uç kutusu ve uç tutma platformundaki PDMS haznesi).
  2. 20 μL 100 pM spektrin-aktin tohumu enjekte edin (F-tamponunda, bakınız Tablo 1 ve Tablo 2). En fazla 1 dakika bekleyin. Tohum yüzey yoğunluğunu, büyük istatistikler için yeterince yüksek ve filamentlerin üst üste binmemesi için yeterince düşük olacak şekilde ayarlamak için tohum konsantrasyonunu ve zamanlamasını ayarlayın.
    NOT: Alternatif olarak, spektrin-aktin tohumları mevcut değilse, streptavidin kaplı bir kapak parçası 9,10 üzerinde hareketsiz hale getirilecek biyotin işlevselleştirilmiş kısa filament segmentleri kullanın.
  3. [İSTEĞE BAĞLI] F-tamponuna 20 μL %5 sığır serum albümini (BSA) enjekte edin. RT'de 10 dakika bekletin.
  4. [İSTEĞE BAĞLI] F-tamponuna 20 μL 1 mg/mL β-kazein enjekte edin. RT'de 10 dakika bekletin.
    NOT: Odayı daha fazla pasifleştirmek için 4.3 ve/veya 4.4 adımlarını izleyin. Pasivasyon seçimi kullanılan proteinlere bağlıdır ve tüm ABP'lerde eşit derecede iyi çalışmaz. Tek başına aktin kullanıldığında, PLL-PEG veya BSA yeterlidir.

5. Mikroakışkan cihazı bağlayın

NOT: Mikroakışkan odasındaki akışları kontrol etmek için dört kanala kadar basınca dayalı bir mikroakışkan sistem kullanın (Şekil 1A, bkz. Mikroakışkan borularda kabarcıkların oluşmasını ve akış stabilitesini bozmasını önlemek için, tüm çözeltilerin gazını çözün. 5 mL dH20 ve 10 mL F-tampon stoğunu bir vakum pompasına bağlı bir vakum kurutucusuna yerleştirin (nihai vakum <250 mbar) ve RT'de en az 1 saat boyunca gazdan arındırın.

  1. Giriş ve çıkış borularını dH2O (500 μL, 300 mbar) ile durulayın.
  2. Tüm 2 mL rezervuar tüplerini (Malzeme Tablosuna bakınız) 300 μL F-tamponu ile doldurun. Basıncı 300 mbar'a ayarlayın ve beş ila sekiz damlanın boşa gitmesine izin verin. Her kanal için tekrarlayın ve basıncı 0 olarak ayarlayın.
  3. Prizi bağlayın ve odayı iyice durulayın.
    1. Rezervuar borusu 4 (çıkış) basıncını 50 mbar'a ayarlayın. Boru ucundan bir damlacık çıktığında, boruyu PDMS odasının çıkışına bağlayın. Sıvı hazneyi doldurur ve tüm girişlerden çıkar.
    2. [İSTEĞE BAĞLI] Oda doğrudan pasifleştirilmişse (bölüm 4), odayı 50-100 μL F-tamponu (3-5 dakika) ile durulamak için basıncı 100 mbar'a ayarlayın. Girişlerdeki fazla sıvıyı bir temizleme mendili ile çıkarın.
    3. Basıncı 20 mbar'a ayarlayın.
  4. Girişleri bağlayın.
    1. Rezervuar borusunun basıncını 1 ila 50 mbar olarak ayarlayın. Hava kabarcıklarının ortaya çıkmasını önlemek için, borudan ve PDMS girişinden bir damlacık çıktığından emin olun.
    2. Boruyu giriş 1'e bağlayın (bağlanırken birleşen iki damlacık). Basıncı 30 mbar'a ayarlayın.
    3. Giriş 2 ve 3'ü bağlamak için 5.4.1-5.4.2 arasındaki adımları yineleyin.
  5. Tüm girişlerin basıncını 20 mbar'a ve çıkış basıncını 0 mbar'a ayarlayın. Girişlerdeki akış hızlarının kabaca eşit olduğundan emin olun (Sorun Giderme bölümüne bakın).

Figure 1
Şekil 1: Bir mikroakışkan odasından çözeltilerin enjekte edilmesi . (A) Tek aktin filament deneyleri için standart mikroakışkan kurulumu. 1-3 rezervuarlarına yerleştirilen protein çözeltileri, gaz fazındaki basıncı ayarlayarak odaya itilir. Üretilen akış hızları debimetrelerle ölçülür. Mikroakışkan odaların içinde, çözeltiler uygulanan bağıl basınçlara bağlı olarak karışmaz ve yer kaplamaz (burada, tüm girişlerde eşit basınç). Tipik boyutlar: rezervuar tüpleri 2 mL'ye kadar çözelti içerir. PEEK borusu (0,25 mm iç çap) rezervuarları debimetrelere (10 cm borudan sonra) ve ardından PDMS odasına (70 cm sonra) bağlar. PEEK borusunu PDMS girişlerine bağlamak için silikon boru ve paslanmaz çelik boru bağlayıcılar kullanılır. Ana mikroakışkan kanal 20-60 μm yüksekliğinde, yaklaşık 1 mm genişliğinde ve 1 cm uzunluğundadır. (B,C) Mikroakışkan haznenin içindeki akış profilleri. (B) Sıvı, oda yüksekliği boyunca parabolik bir profil oluşturur: v(z) = 6z(h-z)R/h3w, burada h ve w oda yüksekliği ve genişliğidir ve R toplam akış hızıdır. Alt: Yüzeye implante spektrin-aktin tohumlarından polimerize edilmiş tek aktin filament. (C) Hazne genişliği yüksekliğinden önemli ölçüde daha büyük olduğunda, akış, sıfıra indiği PDMS yüzeyleri hariç, oda boyunca neredeyse homojendir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. Kurulumu standart akış hızlarıyla yapılandırma

NOT: Bilgisayar kontrollü basınç sistemi, PDMS odasına bağlı tüm girişlerin/çıkışların basınçlarının kolay ve hassas bir şekilde ayarlanmasını sağlar, böylece gelen ve çıkan akış hızlarının kontrolünü sağlar. Önceden ayarlanmış yapılandırmalar kaydedilebilir ve tek bir fare tıklamasıyla açılıp kapatılabilir. Aşağıda önerilen konfigürasyonlar verilmiştir (aksi belirtilmedikçe, çıkış basıncı 0 mbar olarak ayarlanmıştır). Bu önceden ayarlanmış yapılandırmalar için beklenen akış hızları için Tablo 3'e bakın. Burada belirtilen basınçlar, oda geometrisine ve sistem konfigürasyonuna bağlı olarak ayarlanmalıdır.

  1. Değiştir: Bir veya daha fazla rezervuarı değiştirirken bu hazır ayarı kullanın. Kabarcıkların ortaya çıkmasını önlemek için ilgilenilen boruda hafif bir geriye doğru akış oluşturur.
    1. Tüm giriş basınçlarını 12 mbar'a ve çıkış basıncını 5 mbar'a ayarlayın (Şekil 2B).
  2. Yüksek Akışlı 'Tümü': Üç çözümü paralel olarak hızla enjekte etmek için bu ön ayarı kullanın. 4 dakika içinde odaya ulaşacaklar.
    1. Tüm giriş basınçlarını 150 mbar'a ayarlayın.
  3. Yüksek Akışlı 'x': Bir çözeltiyi hızlı bir şekilde enjekte etmek için bu ön ayarı kullanın. 3 dakika içinde odaya ulaşacaktır (Şekil 3A-C).
    1. Giriş 'x' basıncını 150 mbar'a (~15 μL/dak) ayarlayın. Diğer girişlerdeki basınç yaklaşık 100 mbar'a ayarlanır, böylece bu girişlerde ortaya çıkan akış hızı ~ 500 nL / dak'dır.
  4. Orta Akış 'Tümü': Sistemi duraklatmak için bu hazır ayarı kullanın.
    1. Tüm girişleri 20 mbar'a ayarlayın (Şekil 2A).
  5. Orta Akış 'x': Diğer giriş çözümlerini kanal taraflarıyla kısıtlarken 'x' çözümünün ana kanal genişliğinin çoğunu doldurmasına izin vermek için bu hazır ayarı kullanın (bkz. Şekil 2C, D). Böylece odadaki aktin filamentleri sadece 'x' çözeltisi tarafından dayatılan biyokimyasal duruma maruz kalacaktır.
    1. Giriş 'x' basıncını 12 mbar'a ayarlayın. Diğer girişlerdeki basıncı ayarlayın ve ilgili akış hızları ~ 150 nL / dak olacak şekilde ~ 9 mbar'a ayarlayın.

Figure 2
Şekil 2: Her rezervuara uygulanan basınç, mikroakışkan oda içindeki çözeltilerin bölünmesini/mekansal dağılımını kontrol eder. (A) Rezervuarlara uygulanan eşit basınçla, her çözelti odanın üçte birini kaplar. (B) Bir rezervuar tüpünü değiştirirken (burada rezervuar 3), etkin basınç sıfıra düşer ve geriye doğru bir akış oluşturur. (C,D) Rezervuarlardan birindeki bağıl basıncın arttırılması, cam yüzeyin tek bir çözeltiye maruz kalmasını sağlar. Odanın ortasındaki görüş alanı, Orta Akış 1 (C) ve Orta Akış 2 (D) konfigürasyonları arasında geçiş yaparak sırasıyla çözüm 1 ve 2'ye maruz bırakılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

7. 'x' çözümünü değiştirme

NOT: Şekil 3A-C'de gösterildiği gibi, çözeltilerin bir rezervuar tüpünden odanın ana kanalına akmasının dakikalar sürdüğünü akılda tutmak önemlidir. Bu minimum 'ölü' süre, boruda bulunan sıvı hacmi ve boru içindeki akış profili tarafından uygulanır (Şekil 3A-C).

  1. Yeni bir rezervuar tüpünde 200-300 μL çözelti hazırlayın. Basıncı Ayarı değiştir olarak ayarlayın (bkz. bölüm 6).
  2. Giriş 'x' rezervuar tüpünü sökün. Borudaki çözelti, odadan serbest boru ucuna yavaşça geriye doğru akacaktır. Ölçülen akış hızı negatif olur (Şekil 2B).
  3. Boru ucunda küçük bir damlacık oluştuğunda, yeni tüpü taze çözelti ile vidalayın. Tüp basınç sistemine doğru şekilde sıkıldıktan sonra, girişin akış hızı pozitife döner.
  4. Basınç ayarını Yüksek Akış 'x' olarak ayarlayın.
  5. Mikroakışkan konfigürasyona ve oda geometrisine bağlı olarak, çözeltinin boruyu tamamen doldurması ve odaya ulaşması için 3-5 dakika bekleyin.
  6. [İSTEĞE BAĞLI] Zaman içinde floresandaki artışı ölçerek bu işlemi izleyin (Şekil 3C).

Figure 3
Şekil 3: Çözeltilerin rezervuarlardan PDMS odasına gecikmeli olarak ulaşması ve biyokimyasal koşulların hızlı değişimi. (A-C) Çözeltilerin rezervuarlardan PDMS odasına gecikmeli olarak gelmesi. (A) Oda geometrisine, boru uzunluğuna ve giriş(ler)de uygulanan basınca bağlı olarak, bir çözeltinin bir başkasıyla değiştirilmesi anlık değildir. Rezervuar tüpünü floresan çözeltisi (0 dakika) içeren bir tüpe değiştirdikten sonra, çözelti boruyu (0,4 dakika) ve PDMS odasını (1-2 dakika) kademeli olarak doldurur. 150 mbar uygulanan basınç, 80 cm PEEK boru ve 1600 μm genişliğinde, 20 μm yüksekliğinde PDMS odası için gösterge zamanlaması verilmiştir. (B) PEEK borusunun içindeki parabolik akış profili, boru radyal profili boyunca ve odanın içinde etkili bir floresan gradyanı oluşturur (ayrıca bakınız Şekil 1B). (C) Çözeltilerin gecikmeli gelişi, odanın arka plan epifloresan sinyalinin zamanın bir fonksiyonu olarak ölçülmesiyle ölçülebilir. Deneysel koşullar: 0.5 μM %10 Alexa-568 etiketli G-actin, bir debimetre ve 80 cm PEEK boru ile 150 mbar enjekte edilir. (D,E) Biyokimyasal koşulların hızlı değişimi. (D) İki Orta Akış koşulunda gelen çözümlerin modeli. (E) Aktin konsantrasyonunun okunması olarak arka plan floresansında artış. Zaman t = 0, floresan artışı başlangıcı olarak ayarlanır. Çözüm 1: 0,5 μM %10 Alexa-488 etiketli G-aktin, çözelti 2: F-tamponu. (C,E) PDMS odası: 20 μm yüksekliğinde ve 1600 μm genişliğinde. Yüzeyin ~ 2 μm yukarısındaki epifloresan yoğunluğu, sinyalin tam görüş alanı üzerindeki ortalaması alınarak ölçüldü, florofor yokluğunda 0'a ve maksimum yoğunlukta 1'e normalleştirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

8. Temel tek filament deneyi: Adenozin difosfat (ADP)-aktin dikenli uç depolimerizasyonu

NOT: Bu bölüm, işlevselleştirilmemiş bir bölme varsayar (yalnızca bölüm 5). Oda doğrudan işlevselleştirilmişse (bölüm 4), adım 8.4'ten başlayın.

  1. Aktin filament tohumları ile yüzey fonksiyonelleştirme:
    1. F-tamponunda 50 pM spektrin-aktin tohumu11'in 3 ila 200 μL çözeltisini değiştirin (bkz. bölüm 7).
      NOT: Alternatif olarak, spektrin-aktin tohumları mevcut değilse, streptavidin kaplı bir kapak parçası üzerinde hareketsiz hale getirilecek biyotin işlevselleştirilmiş kısa filament segmentleri kullanılabilir (ayrıntılar için 9,10'a bakınız).
    2. Yüksek Akışlı 3 ile 2 dakika boyunca enjekte edin.
      NOT: Son tohum yoğunluğuna bağlı olarak konsantrasyonu ve zamanı ayarlayın.
  2. Yüzey pasivasyonu:
    1. F tamponunda 300 μL %5 BSA ile tüp 3'ü değiştirin.
    2. Yüksek Akış 3'te 5 dakika, ardından Orta Akış 3'te 5 dakika boyunca enjekte edin. Bu ikinci adım sırasında, bir karşı akış ~-100 nL / dak elde etmek için kanal 1 ve 2'deki basıncı 7-8 mbar'a düşürün, böylece tüm oda yüzeyleri BSA pasifleştirilir.
      NOT: BSA çözeltisi daha viskoz olduğundan, basınçların buna göre ayarlanması gerekir.
  3. Tüp 3'ü F-tamponuna değiştirin ve kanalı durulayın (5 dakika, Yüksek Akış 3).
  4. Tüm proteinler F-tamponunda seyreltilen aşağıdaki 200-300 μL çözeltileri hazırlayın:
    Giriş 1, polimerizasyon çözeltisi: 1 μM %10 Alexa-488 etiketli G-aktin, 1 μM profilin (Tablo 1).
    Giriş 2, yaşlanma çözeltisi: 0.15 μM %10 Alexa-488 etiketli G-aktin.
    Giriş 3, depolimerizasyon çözeltisi: Sadece F-tamponu.
    NOT: Profilin burada spontan çekirdeklenmeyi önlemek ve sabit bir G-aktin konsantrasyonunu korumak için kullanılır.
  5. Tüpleri 1'den 3'e değiştirin (bölüm 7). Yüksek Akışlı Tümü ön ayarını kullanarak 3-4 dakika boyunca enjekte edin. Üç çözüm şimdi PEEK borusunu doldurdu ve odaya ulaştı (Şekil 3A). Cam yüzey, ölü zaman olmadan herhangi bir giriş çözeltisine maruz bırakılabilir (<1 s, Şekil 3D, E).
  6. Mikroskobu açın. Ayarları yapın: %10-%20 güçte 150 mW 488 nm uyarma lazeri, 100-200 ms kamera pozlama süresi, 200-300 nm TIRF penetrasyon derinliği, 60x hedef. Bu ayarlar makale boyunca kullanılmıştır.
  7. Filament polimerizasyonu (Şekil 4A):
    1. Basınç ayarını ~ 10 dakika boyunca Orta Akış 1 olarak ayarlayın.
    2. [İSTEĞE BAĞLI] Kayıt polimerizasyonu (1 çerçeve/20 sn, TIRF). Filamentler yaklaşık 10 alt birim / saniyede (alt / s) 1,12'de polimerize olmalıdır.
  8. Filament eskitme: Basınç ayarını 15 dakika boyunca Orta Akış 2 olarak ayarlayın. Kritik konsantrasyonda, 0.15 μM G-aktin, filament uzunluğu sabit kalacak ve filamentler% >99 ADP-F-aktin4'e dönüşecektir.
  9. Depolimerizasyon (Şekil 4A):
    1. Epifloresan modunda 1 kare/5 sn'de edinime başlayın. Kanal 2 ve 3'te çok düşük bir floresan arka plan olduğundan, TIRF kullanmak gerekli değildir.
    2. Bir ila iki kare sonra Orta Akış 3'e geçin. Filamentler yaklaşık 10 sub/s'de depolimerize olmalıdır (referans12).
  10. Deneyi sıfırlamak için, floresan olarak etiketlenmiş tüm filamentleri, ~ 2 dakika boyunca maksimum güçte sürekli olarak lazere maruz bırakarak kırın. Farklı koşulları test etmek için, çözelti 1, 2 veya 3'ü değiştirin ve bunları enjekte edin (Yüksek Akış, 3-4 dakika). 8.7-8.9 arasındaki adımları yineleyin.

9. Diğer tek filament deneyleri

  1. ABP'lerin F-aktin ile etkileşimlerinin test edilmesi
    NOT: Mikroakışkanlar, kofilin, tropomiyozin ve Arp2/3 gibi birkaç yan bağlayıcı ABP'nin aktivitesini ölçmek için başarıyla kullanılmıştır. Bölüm 8'deki protokolü izleyerek:
    1. Kanal 3'ü F-tamponunda ilgilenilen floresan ABP'ye değiştirin. Enjekte et (Yüksek Akış 3, 3 dk).
    2. Filament polimerizasyonu: Basınç ayarını 10 dakika boyunca Orta Akış 1 olarak ayarlayın.
    3. ABP bağlama: TIRF ile satın almaya başlayın. ABP konsantrasyonuna bağlı olarak kare hızını ayarlayın. 1-2 kare sonra Orta Akış 3'e geçin.
      NOT: ABP'ye bağlı olarak, görüntü çekerken arka plan floresansını daha da azaltmak için hızlı bir şekilde (örneğin, 5 saniyeden daha kısa sürede) Orta Akış 2'ye geçmek de mümkündür.
    4. ABP untiding: Satın almaya devam ederken Mid Flow 2'ye geçin.
  2. Serbest dikenli uçta formin ile polimerizasyon
    NOT: Forminlerin filament dikenli uç polimerizasyonunu etkilediği gösterilmiştir. Mikroakışkanlar özellikle formin bağlanma ve bağlanmama oranlarını ve bunların filament uzaması üzerindeki etkilerini ölçmek için uyarlanmıştır.
    1. Aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
      Kanal 1: F-tamponunda 10 nM formin (Tablo 1).
      Kanal 2: 1 μM %10 Alexa-488 etiketli G-aktin, 4 μM profilin.
      Kanal 3: F-tamponu.
    2. 1, 2 ve 3 numaralı tüpleri değiştirin (bölüm 7). Yüksek Akışlı Tümü ön ayarını kullanarak 3-4 dakika boyunca enjekte edin.
    3. Filament polimerizasyonunu başlatın: Basınç ayarını 2 dakika boyunca Orta Akış 2 olarak ayarlayın.
    4. Filament dikenli uca formin bağlama: Basınç ayarlarını 30 sn için Orta Akış 1 olarak ayarlayın.
    5. Formin aracılı polimerizasyon: Basınç ayarını Orta Akış 2 olarak ayarlayın. Dikenli uçlarında formin mDia1 ile, filamentler yaklaşık 50 alt / s13,14,15'te polimerize olmalıdır.
  3. Yüzeye ankrajlı forminden polimerizasyon/depolimerizasyon
    NOT: Formin süslü dikenli uçların polimerizasyon ve depolimerizasyon oranlarının, filamente uygulanan gerilime bağlı olduğu gösterilmiştir. Mikroakışkanlarda, sıvı akışının filament tarafı boyunca sürtünmesi, filament uzunluğu veakış hızı 14,16 ile orantılı bir gerilim oluşturur.
    1. Yukarıda açıklanan bölüm 8'deki yöntemi kullanarak, yüzey pasivasyonu için 8.1, 8.2 ve 8.3 numaralı adımları aşağıdakilerle değiştirin:
      1. F-tamponunda tüp 3'ü 1 μg / mL anti-His antikoruna değiştirin. Yüksek Akışlı 3 ile 2 dakika boyunca enjekte edin.
      2. F tamponunda tüp 3'ü %5 BSA ile değiştirin. Yüksek Akış 3'te 5 dakika, ardından Orta Akış 3'te 5 dakika boyunca enjekte edin. Bu ikinci adım sırasında, tüm oda yüzeylerinin BSA pasifleştirilmesi için ~-100 nL / dak'lık bir karşı akış elde etmek için kanal 1 ve 2'deki basıncı 7-8 mbar'a düşürün.
      3. Tüp 3'ü 100 nM olarak değiştirin F-tamponunda Onun etiketli formin. Yüksek Akışlı 3 ile 5 dakika boyunca enjekte edin. F tamponu ile tüp 3'ü değiştirin. Boruda formin kalmadığından emin olmak için Yüksek Akış 3 ile 5 dakika boyunca enjekte edin.
    2. Aşağıdaki çözeltileri hazırlayın ve enjekte edin (her biri 200-300 μL, F-tamponunda):
      Kanal 1: 1 μM %10 Alexa-488 etiketli G-aktin.
      Kanal 2: 1 μM etiketsiz G-aktin, 4 μM profilin.
      Kanal 3: Yalnızca F arabelleği.
    3. Filament nükleasyonu: Yüzeye tutturulmuş forminleri G-aktin'e maruz bırakın ( Orta Akış 1'i ayarlayın).
    4. Filament polimerizasyonu: Orta Akış 2 kullanarak odayı profilin-aktin'e maruz bırakın.
    5. Edinime başla: 1 kare/2 s, epifloresan. Formin mDia1 ile filamentler, filament uzunluğuna ve akış hızı14'e bağlı olarak 50-80 alt / s'de polimerize edilmelidir.
    6. Filament depolimerizasyonu: Edinime başlayın (1 kare / 4 s, epifloresan). 1-2 kare sonra, filamentleri F-tamponu, Orta Akış 3'e maruz bırakın. Formin mDia1 ile filamentler, filament uzunluğuna ve akış hızı14'e bağlı olarak 5-15 alt / s'de depolimerize edilmelidir.
  4. Etiketsiz segmentlere sahip aktin filamentleri
    NOT: Aktin floresan etiketleme, depolimerizasyon17 sırasında duraklamalar ve değiştirilmiş tropomiyozin bağlama18 gibi çeşitli artefaktlar oluşturur. Bu yapılar için geçici bir çözüm, etiketlenmemiş segmentleri görüntüleyen filamentleri birleştirmek için mikroakışkanlar kullanmaktır.
    1. Aşağıdaki çözeltileri hazırlayın ve enjekte edin (F-tamponunda 200-300 μL):
      Kanal 1: 1 μM etiketsiz G-aktin, 1 μM profilin.
      Kanal 2: 0.3 μM 10% Alexa-488 etiketli G-aktin.
    2. Her iki ucunda floresan etiketli segmentler bulunan ADP-aktin etiketsiz segmentler oluşturmak için yüzeyi sırayla kanal 2 (5 dakika), kanal 1 (10 dakika) ve kanal 2'ye (15 dakika) maruz bırakın.
  5. Gelsolinli dikenli uçtan ankrajlı filamentler
    NOT: Spektrin-aktin tohumlarında, filamentler serbest dikenli uçlarında polimerize olurken, sivri uç spektrin-aktin tohumu tarafından stabilize edilir. Bir alternatif, filamentleri jelsolin gibi dikenli bir uç kapakla sabitlemektir.
    1. 20 μL F-tamponunda 4 μM %10 Alexa-488 etiketli G-aktin içeren bir F-aktin çözeltisi hazırlayın. Aktinin RT'de kendiliğinden çekirdeklenmesine ve polimerize olmasına izin verin, tezgahta en az 30 dakika boyunca. Işıktan korumak için tüpü alüminyum folyoya sarın.
    2. Bu arada, mikroakışkan odayı hazırlayın ve yüzeyi% 5 BSA ve% 1 biotin-BSA karışımı ile pasifleştirin (bkz. adım 8.2).
    3. Kanal 3'ü F tamponu ile durulayın ( Yüksek Akış 3'te 2 dakika). F tamponuna 10 μg/mL nötravidin enjekte edin ( Yüksek Akış 3'te 4 dakika).
    4. Tüpleri şu şekilde değiştirin:
      Kanal 1: 10 nM biotin-jelsolin (Tablo 1).
      Kanal 2: F-tamponu.
      Kanal 3: 0.4 μM prepolimerize F-aktin.
    5. Yüksek Akışlı Tümü ayarını kullanarak tüm çözeltileri 3 dakika boyunca birlikte enjekte edin.
    6. Tüm odayı jelsoline maruz bırakın (Orta Akış 1, 30 s).
    7. Filamentleri yüzeye takın (Düşük Akışlı 3: 3 mbar'da Kanal 3, ~2 mbar'da Kanal 1 ve 2, yaklaşık 2 dakika boyunca).
    8. [İSTEĞE BAĞLI] Filament yoğunluğu çok düşükse, adım 9.5.6 ve 9.5.7'yi tekrarlayın.
    9. Sivri uçlu depolimerizasyon: Edinime başlayın (1 kare/30 sn, epifloresan). 1-2 kare sonra, filamentleri yalnızca arabelleğe maruz bırakın, Orta Akış 2. Filamentler yaklaşık 0.2 sub / s'de depolimerize olmalıdır.

10. ADF / kofilin ile büyüleyici kaynaklı filament demeti oluşumu ve sökülmesi

NOT: Aktin filament demetleri oluşturmak için, odanın yüzeyinde yeterince yüksek bir filament tohumu yoğunluğuna sahip olduğunuzdan emin olun. Büyüleyici proteine maruz kaldığında, yanal olarak dalgalanan komşu filamentler, büyüleyici proteinler tarafından dinamik olarak çapraz bağlanacaktır. Büyüleyici, filament tarafı19'dan hızla ayrıldığından, filament demetlenmesini sürdürmek için ana akan çözeltide sürekli olarak mevcut olmalıdır.

  1. 8.1-8.3 arasındaki adımları izleyin.
  2. Aşağıdaki çözeltileri hazırlayın (F-tamponunda 200-300 μL):
    Kanal 1, polimerizasyon çözeltisi: 1 μM %10 Alexa-488 etiketli G-aktin, 1 μM profilin.
    Kanal 2, Paketleme çözümü: 200 nM büyüleyici (Tablo 1), 0.15 μM 10% Alexa-488 etiketli G-aktin.
    Kanal 3, Sökme çözümü: 200 nM ADF / cofilin (Tablo 1), 100 nM büyüleyici, 0.15 μM% 10 Alexa-488 etiketli G-aktin.
  3. Tüpleri 1'den 3'e değiştirin (bölüm 7). Yüksek Akışlı Tümü ön ayarını kullanarak 3-4 dakika boyunca enjekte edin.
  4. Filament polimerizasyonu: Basınç ayarını ~ 10 dakika boyunca Orta Akış 1 olarak ayarlayın. Polimerizasyon TIRF ile görüntülenebilir.
  5. Filament paketleme (Şekil 4C): Görüntü yakalamayı başlatın (1 kare/5 sn, epifloresan). 1-2 kare sonra, basınç ayarını Orta Akış 2'ye ayarlayın ve filament demetlenmesini gözlemleyin.
  6. Demet parçalanması: Görüntü yakalamayı başlatın (1 kare/5 sn, epifloresan). 1-2 kare sonra, basınç ayarını Orta Akış 3'e ayarlayın ve hem tek filamentlerin hem de demetlerin kofilin kaynaklı sökülmesini gözlemleyin.

11. Mikroakışkan cihaz temizleme prosedürü

NOT: Bir deneyden diğerine herhangi bir kontaminasyonu önlemek için, her deneyden sonra tüm tüpleri ve debimetreleri kapsamlı bir şekilde temizlemek ve tamamen kurutmak çok önemlidir.

  1. Tüm boruları PDMS odasından ayırın ve odayı atın.
  2. PEEK borularını ve debimetreleri temizlemek için, boru uçlarını boş bir 15 mL plastik tüp içinde bantlayın ve rezervuar neredeyse boşalana kadar aşağıdaki çözeltileri maksimum basınçta enjekte edin:
    400 μL F-tamponu.
    400 μL 0,5 M NaOH.
    400 μL saf su.
    200 μL izopropanol.
  3. Boş bir rezervuarla değiştirin ve borular tamamen kuruyana kadar (~ 2-4 dakika, maksimum basınç) havayı üfleyin.

12. Görüntü analizi

NOT: Bu makale, mikroakışkanlarda tek aktin filamentlerini birleştirme, manipüle etme ve görselleştirme yöntemine odaklanırken, edinilen filmleri analiz etmek için kısa bir yöntem burada verilmiştir. Analiz, bölüm 8'i takip eden ImageJ kullanılarak 16 bit görüntüler üzerinde gerçekleştirilir.

  1. Görüntü işleme minimumdur:
    1. Polimerizasyon veya depolimerizasyon görüntü yığınını içe aktarın.
    2. [İSTEĞE BAĞLI] Arka Plan Çıkar işleviyle görüntü yoğunluğunu homojenleştirin (varsayılan ayarlar (ör. 'Yuvarlanan top yarıçapı' = 50 piksel)). Bu, özellikle bir film sırasında arka plan floresansı değişiyorsa veya floresan aydınlatması görüş alanı üzerinde homojen değilse kullanışlıdır.
    3. Parlaklığı ve kontrastı ayarlayın (sıfıra yakın arka plan, maksimuma yakın filamentler).
  2. Filament kymograph oluşturun:
    1. Duraklatmayan, kopmayan veya ayrılmayan bir filament seçin. Aksi takdirde davranışa göre seçim yapmayın. 1-2 piksel yukarıda bir çizgi çizin (Düz Çizgi aracı). Filament numarasını kaydedin (YG Yöneticisi'ne ekleyin).
    2. Reslice (Dilim sayısı: 5 piksel) işlevini uygulayın. Maksimum yoğunluğu hesaplayın (Zprojection fonksiyonu).
  3. Polimerizasyon/depolimerizasyon hızını ölçün:
    1. Kimografta, filament dikenli uç boyunca bir çizgi çizin (Düz Çizgi aracı, Şekil 4A). Çizgi genişliğini ve yüksekliğini ölçün ( Hesaplama işlevi).
  4. 12.2-12.3 arasındaki adımları birden çok filament üzerinde yineleyin. Polimerizasyon/depolimerizasyon oranlarını hesaplayın (Şekil 4A):
    Equation 1, burada v hızı (alt/s cinsinden), w çizgi genişliğini (piksel), pikseli piksel boyutunu (nm), h çizgi yüksekliğini (kareler) ve dt kareler arasındaki süreyi (saniye cinsinden) belirtir. Burada, 2.7 nm, bir aktin alt biriminin filament uzunluğuna etkili katkısına karşılık gelir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yukarıda açıklanan tüm deneyler için, floresan olarak etiketlenmiş aktin filamentleri, yüzeyden düşük arka plan floresansının göstergesi olan iyi kontrastla açıkça görülebilmelidir (Şekil 4, yaygın sorunların giderilmesi için Ek Dosya 1'e bakınız). Aktin filamentleri de yüzeye yapışmamalıdır: baskın akış hızı düşük olduğunda, aktin filamentlerinin yanal dalgalanmaları, onları canlı olarak gözlemlerken algılanabilir olmalı ve birinin sadece uçlarından biri tarafından demirlendiklerini açıkça belirlemesine izin vermelidir. Benzer şekilde, TIRF görüntüleme kullanırken, dikey dalgalanmaları, uzunlukları ve zamanları boyunca yoğunluktaki değişikliklerle görülmelidir. Uygulanan akış hızlarına bağlı olarak, TIRF tarafından elde edilen aktin filamentlerinin görüntü kalitesini optimize etmek için TIRF penetrasyon derinliğinin ayarlanması gerekebilir.

Filamentleri polimerizasyon koşullarına maruz bırakırken (bakınız bölüm 8), filament uzaması düzenli olmalıdır (yani, filamentin sonundaki uzama, yüzey etkileşimi veya kalıcı yapışma ile engellenmez). Ek olarak, ölçülen filament dikenli uç uzama hızı, tüpçözeltisinin mikroakışkan odaya doğru şekilde aktığını gösteren tüp 1,20'deki aktin konsantrasyonuna göre beklenen değerle eşleşmelidir (Şekil 4A). Benzer şekilde, bir tampon çözeltisine maruz kaldığında, filamentler ADP içeriği4'ü yansıtan bir hızda sabit bir şekilde depolimerize edilmelidir (Şekil 4A). Zaten yetiştirilmiş aktin filamentlerini floresan olarak etiketlenmiş bir kofilin çözeltisine maruz bırakırken, kofilin kümeleri çekirdeklendirilecek ve kofilin konsantrasyonuna bağlı bir oranda hem sivri hem de dikenli uçlara doğru büyüyecektir (Şekil 4B). Büyüleyici gibi bir ABP'nin potansiyel bir çapraz bağlanma aktivitesini değerlendirirken (Şekil 4C), demetleri oluşturan yakın aktin filamentleri, daha yüksek floresan yoğunlukları ve yanal dalgalanmalarındaki bir değişiklikle kolayca tespit edilecektir.

Sıvı akışı, mikroakışkan odanın yüzeyine tutturulmuş aktin filamentlerine viskoz bir sürtünme kuvveti uygular. F-aktin üzerindeki sürtünme kuvveti katsayısı η = 6.10-4 pN·s/μm2'dir ve filament mikron uzunluğu14 başına ifade edilir. Ara akış hızlarında, filament yüksekliği yüzeyin üzerinde sabit bir ortalama 250 nm civarında dalgalanırken, serbest yüzen uçtan filament ankraj noktasına kadar bir kuvvet gradyanı vardır. Bu nedenle, F= 6ηπLv kullanarak, filament boyunca herhangi bir noktada uygulanan gerilim hesaplanabilir, burada v, yüzeyin 250 nm üzerindeki yerel akış hızıdır (Şekil 1B) ve L, aşağı akış filament segment uzunluğudur (yani, düşünülen noktadan serbest uca kadar). Daha yüksek akış hızları için, filament ortalama yüksekliği sabit değildir, ancak ankraj noktasından serbest uca doğrusal olarak artar, ortalama 250 nm'nin altında kalır ve akış hızlarına bağlı olarak değişecektir, böylece filament21 boyunca daha karmaşık bir gerilim kuvveti profiline yol açacaktır.

Figure 4
Şekil 4: Temsili sonuçlar. Aktin filamentlerinin spektrin-aktin tohumlarından polimerize edildiği ve farklı ABP'lere maruz kaldığı tipik deneyler. Netlik uğruna, görüş alanının sadece bir kısmı gösterilir. (A) Temel polimerizasyon-depolimerizasyon deneyinin sonucu (bölüm 8). Filamentler, tüm alt birimleri ADP-aktin'e dönüştürmek için 15 dakika yaşlandırılmış% 0.8 μM 10% Alexa-488 etiketli G-aktin çözeltisi ile polimerize edilir (gösterilmemiştir) ve yalnızca F-tamponuna maruz kaldığında depolimerize edilir. Alt: polimerizasyon ve depolimerizasyon oranlarını ölçmek için kullanılan kimograflar. 1 kare/5 sn, 200 ms pozlama süresi, %9 güçte 150 mW 488 nm lazer, TIRF (lazer penetrasyon derinliği 250 nm) ile elde edilmiştir. (B) Tek aktin filamentlerinin 500 nM mCherry-cofilin-1 ile parçalanması. Aktin, ATP-ATTO48822 (sarı) ile etiketlenmiştir ve cofilin-1, mCherry (mavi) ile kaynaştırılmıştır. Üst: görüş alanının kesri. Not: yüzeyde protein agregaları. Alt: Kofilin-1'in bir filamente bağlanmasını gösteren kimograf (ok uçları kofilin-1 etki alanı çekirdeklenme olaylarını gösterir) ve parçalanma olayına (yıldırım sembolü) yol açar. 1 kare/4 sn, 200 ms pozlama, %16'da 150 mW 488 nm lazer ve %12 güçte 100 mW 561 nm lazer, epifloresan elde edilmiştir. (C) Aktin filamentlerinin büyüleyiciler tarafından toplanması (bölüm 10.5). Filamentler ilk olarak G-aktin etiketli 0.8 μM %5 Alexa-488 ile polimerize edildi ve 200 nM büyüleyici ile paketlendi. Tek filamentlerle karşılaştırıldığında, filament demetleri iki ila üç kat daha parlak görünür ve akışla mükemmel bir şekilde hizalanmaz. 1 kare/10 sn, 200 ms pozlama, %20 200 W Cıva lamba yoğunluğu, epifloresan ile elde edilir. (A-C) Arka plan, ImageJ'nin geçici işleviyle çıkarıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protein adı tür Uniprot ref (dizi) orijinal arıtma protokolü ref. Yorum
Aktin tavşan P68135 (tam uzunlukta) 23 Floresan etiketleme için, ref 24'e bakınız
profilin1 insan P07737 (tam uzunlukta) 25 Ayrıca bakınız ref 11
Spektrin-aktin tohumu insan Yok 26, 27 Ayrıca bakınız ref 11
cofilin1 fare P18760 (tam uzunlukta) 28
jelsolin insan P06396 (tam uzunlukta) 29
mDia1 formin fare O08808 (aa 552–1255) 13 ref 24'te daha ayrıntılı protokol
büyüleyici1 insan Q16658 (tam uzunlukta) 30

Tablo 1: Aktin ve aktin bağlayıcı proteinler 23,24,25,26,27,28,29,30

Reaktif konsantrasyon
Tris-HCl pH 7,4 5 mM
Kartal 50 mM
MgCl2 1 mM
cesaret 0,2 mM
Atp 0,2 mM
cesaret 10 mM
DABCO 1 mM

Tablo 2: F-tampon bileşimi. DABCO ve nispeten yüksek bir DTT konsantrasyonu, floresan mikroskobu deneyleri sırasında ışığa maruz kalma nedeniyle filamentlere foto-kaynaklı hasarı sınırlamak için kullanılır.

Adları ayarlama Basınç (mBar) Akış hızı (nL/dak)
Maksimum basınç 300 ~ 30 000 (baskın kanalda)
Yüksek basınç 150 ~ 15 000 (baskın kanalda)
Orta basınç 12 ~ 1500 (baskın kanalda)
'Değişim' baskısı Tüm girişler için 12,
Çıkış için 5		 ~ 500 (her girişte)

Tablo 3: Uygulanan basınçlar ile ölçülen akış hızları arasındaki yazışmalar. Ortaya çıkan akış hızları büyük ölçüde deney düzeneğine bağlıdır. Değerler, 80 cm uzunluğunda PEEK borulu her bir rezervuara bağlı, 1 cm uzunluğunda kesitli 20 μm x 800 μm (yükseklik x genişlik) ana kanala sahip bir mikroakışkan oda için verilir.

Ek Dosya 1: Klasik sorunlar, nedenler ve çözümler. Mikroakışkanlar ve/veya tek aktin filamentleri ile çalışırken sıklıkla sorunlarla karşılaştılar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aktin filamentlerinin uzunlukları boyunca birden fazla nokta ile yüzeye tutturulduğu veya metilselüloz gibi bir kalabalık ajan tarafından yüzeye yakın tutulduğu standart tek filament yöntemleriyle karşılaştırıldığında, mikroakışkanlar bir dizi avantaj sunar. Yüzeyle etkileşimler minimum olduğundan, bu etkileşimlerin hem uzama hem de depolimerizasyon sırasında neden olabileceği yapay duraklamalardan kaçınılır. Filamentler, birbirlerine paralel olarak akış tarafından hizalanır, izlenmelerini ve uzunluklarının ölçülmesini kolaylaştırır. Filamentlerin etrafındaki çözelti sürekli yenilenir ve onları sabit protein konsantrasyonlarına maruz bırakır. Filamentlerin maruz kaldığı farklı protein çözeltileri arasında hızlı bir şekilde (<1 s, Şekil 3D, E) geçiş yapabilmek, kinetik çalışmalar için genellikle etkili olan zaman kontrollü sıralı deneyler gerçekleştirmeye izin verir. Son olarak, akan çözelti tarafından filamentler üzerinde uygulanan viskoz sürtünme, filamentlere kontrollü mekanik gerilim uygulamak için kullanılabilir (Temsili Sonuçlar bölümü). Orta dereceli sıvı akışlarının (Orta Akış basıncı ayarları), minimum gerilim (<1 pN)14 üretirken TIRF ile verimli bir şekilde görüntülemek için filamentleri yüzeye yeterince yaklaştırdığı (~ 250 nm) unutulmamalıdır.

Bununla birlikte, klasik tek filament analizleriyle karşılaştırıldığında, mikroakışkanlar daha büyük miktarlarda protein çözeltileri gerektirecektir: standart bir deney 10 μL'den daha az bir miktarla yapılabildiğinde, tipik olarak birkaç 100 μL. Bu, değerli proteinleri kullanırken bir sınırlama olabilir. Klasik deneyler, bir dizi mikroakışkan deneye başlamadan önce ilgili deney koşullarının (örneğin, farklı proteinlerin mutlak veya göreceli konsantrasyonları) oluşturulmasına yardımcı olmak için kullanılabilir. Başka bir sınırlama, in vitro diğer tek filament tekniklerinde olduğu gibi, kapak kayma yüzeyinin kusurlu pasivasyonundan kaynaklanmaktadır. Kapak kaymasının temizlenmesinde ve pasivasyon tabakasının (BSA, PEGilasyon, vb.) bağlanmasında tekrarlanabilirliğin kontrol edilmesi her zaman zordur. PEG-silan yüzey işlemine dayanan tek adımlı pasivasyon tekniği birçok laboratuvarda tercih edilen teknik haline gelmiştir 7,15. Bu nedenle, filament tohumlarının etkili yoğunluğu, deneyler arasında, mümkün olduğunca doğru bir şekilde tekrarlandığında bile, kabaca iki kat değişebilir. Tatmin edici bir filament yüzey yoğunluğu aralığı hedeflenmeli ve gerekirse deneyi tekrarlamaya hazır olunmalıdır. Mikroakışkanlar ve/veya tek aktin filamentleri ile çalışırken sık karşılaşılan sorunlar Ek Dosya 1'de tartışılmıştır.

Burada sunulan temel protokol için, kısa stabilize filamentler olarak görülebilen spektrin-aktin tohumlarının, yüzeye yapıştıkça rastgele yönlendirildiğine dikkat edilmelidir. Sonuç olarak, bu tohumlardan yetiştirilen filamentler akışla hizalandıkça, tohuma en yakın kısımları, her biri kendi açısına sahip keskin bir şekilde bükülecektir. Filamentlerin büküldüğü uzunluk, filamentler orta veya yüksek akışlara maruz kaldığında genellikle çok küçüktür. Aslında, bu uzunluk genellikle kırınım sınırından (~ 200 nm) daha küçük olacak ve bu nedenle kolayca tespit edilmeyecektir. Önemli olarak, filament eğriliğine duyarlı ABP'ler, bu yüksek oranda bükülmüş bölgede bağlanacak ve farklı şekilde çalışacaktır. Önyargılı sonuçlardan kaçınmak için, en basit olanı bu bölgeyi analizden hariç tutmaktır21.

Tek aktin filamentlerini manipüle etmek ve görselleştirmek için mikroakışkanlar kullanmaya başlamadan önce, çok daha esnek olan tek DNA filamentlerini3 incelemek için zaten kullanılmıştı. Bu, kayda değer farklılıklara yol açabilir, çünkü akış DNA'yı dramatik bir şekilde gevşetebilir ve görünür uzunluğunu çarpıcı bir şekilde değiştirebilir. Mikroakışkanlar, burada sunulan yönteme çok benzer şekilde, mikrotübülleri incelemek için de kullanılabilir; bunlar çok daha serttir, ancak yine de31,32 koşullarının hızlı değişiminden yararlanarak uzamasını ve depolimerizasyonunu ölçmek için akışla aynı hizaya getirilebilir veya mikrotübül plastisitesini ölçmek için dik bir akışla bükülebilir7.

Burada, filamentlerin sadece bir uçla demirlendiği ve görüş alanındaki akış yönünün deney boyunca aynı olduğu temel deney için protokolü sunduk. Bu iki özellik değişebilir. Örneğin, filamentler, filament boyunca farklı bir kuvvet profili oluşturmak için birden fazla nokta tarafından sabitlenebilir. Benzer şekilde, akış yönü (giriş kanalları arasındaki bağlantının yakınında, akış odasında) filamentleri yerel olarak bükmek için değiştirilebilir, çünkü ankrajsız kısım ankrajlı filament segmenti21'den farklı bir yöne işaret edecektir. Rastgele demirlenmiş spektrin-aktin tohumlarından uzamış filamentler,demet 33'ü oluşturmak için çapraz bağlanan proteinlere de maruz kalabilir (bkz. bölüm 10). Mikroakışkanları diğer tekniklerle (mikrodesenleme, optik cımbız, vb.) birleştirerek veya akış hatlarını değiştirmek için bölmeli mikroakışkan odalar tasarlayarak, belirli ABP aktivitesini tek filamentler üzerinde incelemek veya küçük aktin ağları oluşturmak için çoklu konfigürasyonlar oluşturulabilir34. Kombinasyonların sayısı, mikroakışkanların avantajı ve çok yönlülüğü ile birlikte, moleküler ölçekte aktin ağlarının mekansal-zamansal düzenlemesini deşifre etmek için araştırmacılara birçok araç sunmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

B. Ladoux ve R.-M.'ye minnettarız. UV temizleyici ekipmanlarının kullanımı için Mège laboratuvarı ve J. Heuvingh ve 0. du Roure, silikon gofretler üzerinde kalıp hazırlama ve mikroakışkanlar hakkında ipuçları sağlama konusunda aldığımız ilk eğitim için. Avrupa Araştırma Konseyi Grant StG-679116 (A.J.'ye) ve Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin and Conformin'den (G.R.-L.) gelen fonları kabul ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-Casein Merck C6905 Used at 8 mg/mL
Biopsy punch (with plunger) Ted Pella 15115-2 ID 0.75 mm, OD 1.07 mm
Biotin-BSA Merck A8549 Used at 1 mg/mL
BSA Merck A8022 Used at 50 mg/mL
Coverslip Mini-Rack
Teflon holder		 Invitrogen C14784 for 8 coverslips
Coverslips 22x40mm
Thickness #1.5		 Menzel Gläser 631-1370
DABCO Merck D27802 component in f-buffer
DTT Euromedex EU0006-D component in f-buffer
Ester NHS Alexa Fluor 488 Invitrogen A20000 Fluorophore for actin labeling on Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific 21338 To biotinylate actin on Lys328
Hellmanex III Hellma 9-307-011-4-507 Glass cleaning detergent
ImageJ NIH N/A open source software
Laboport KNF 811kn.18 vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)
Magic invisible tape Scotch 7100024666 standard transparent office tape
Micrewtube Simport T341-6T 2 mL microfluidic reservoir tubes
Microfluidic device Part 1: Flow Unit S Fluigent FLU-S-D-PCKB Flowmeter
Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL Fluigent 14002001PCK Reservoir holder
Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ Fluigent EZ-11000001
EZ-00345001		 Pressure controller
Model 42 - UVO-Cleaner Jelight Inc. 42-220 Ultraviolet cleaner
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 Jena Bioscience NU-805-488 ATP-ATTO used to label actin
neutravidin Thermo Scientific 31000
PLL-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) Use at 1 mg/mL in PBS.
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer Dow Corning 1673921 Contains PDMS base and curing agent
Polyetheretherketone (PEEK) tubing Merck Z226661 “Blue” : I.D. = 0.25 mm
Safety blow gun Coilhose Pneumatics 700-S filtered air
Silicon tubing VWR 228-0701P connect PEEK to coupler
Stainless steel catheter coupler Prime Bioscience SC22/15 Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing
Thermoplastic film Sigma Aldrich PM996 Standard "parafilm"
Ultrapure ethanol VWR 64-17-5
Ultrasonic cleaning bath VWR USC200TH To accomodate 1 L beakers
Vacuum dessicator SP Bel-Art F42022-0000 to degas the PDMS or solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).
  2. Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).
  3. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  4. Jégou, A., et al. Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin. PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).
  5. Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
  6. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  7. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  8. Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins. Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).
  9. Funk, J., et al. Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth. eLife. 8, 50963 (2019).
  10. Pandit, N. G., et al. Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).
  11. Wioland, H., et al. ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends. Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).
  12. Pollard, T. D., Mooseker, M. S. Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores. The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).
  13. Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin. Cell. 124 (2), 423-435 (2006).
  14. Jégou, A., Carlier, M. -F., Romet-Lemonne, G. Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments. Nature Communications. 4, 1883 (2013).
  15. Breitsprecher, D., et al. Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging. Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).
  16. Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).
  17. Niedermayer, T., et al. Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).
  18. Gateva, G., et al. Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro. Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).
  19. Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia. Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).
  20. Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. The Journal of Cell Biology. 103, Pt 2 2747-2754 (1986).
  21. Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).
  22. Colombo, J., et al. A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics. Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).
  23. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  24. Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly. Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).
  25. Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms. European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).
  26. Lin, D. C., Lin, S. Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).
  27. Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments. The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).
  28. Kremneva, E., et al. Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres. Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).
  29. Le Clainche, C., Carlier, M. -F. Actin-based motility assay. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 12 1-20 (2004).
  30. Vignjevic, D., et al. Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).
  31. Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. eLife. 5, 13470 (2016).
  32. Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
  33. Suzuki, E. L., et al. Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity. Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).
  34. Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).

Tags

Biyokimya Sayı 183
Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wioland, H., Ghasemi, F.,… More

Wioland, H., Ghasemi, F., Chikireddy, J., Romet-Lemonne, G., Jégou, A. Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63891, doi:10.3791/63891 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter