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Biochemistry

Utilizzo della microscopia a microfluidica e fluorescenza per studiare la dinamica di assemblaggio di singoli filamenti e fasci di actina

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63891
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université Paris Cité, CNRS, Institut Jacques Monod

Summary

Presentiamo protocolli per semplici saggi microfluidici di filamenti di actina, in combinazione con la microscopia a fluorescenza, che consentono di monitorare con precisione i singoli filamenti di actina in tempo reale esponendoli sequenzialmente a diverse soluzioni proteiche.

Abstract

Al fine di decifrare i complessi meccanismi molecolari che regolano l'assemblaggio e lo smontaggio dei filamenti di actina, è una grande risorsa monitorare le singole reazioni dal vivo in condizioni ben controllate. Per fare ciò, negli ultimi 20 anni sono emersi esperimenti dal vivo a singolo filamento, per lo più utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) e hanno fornito una miniera di risultati chiave. Nel 2011, al fine di espandere ulteriormente le possibilità di questi esperimenti ed evitare artefatti problematici ricorrenti, abbiamo introdotto semplici microfluidiche in questi test. Questo studio descrive in dettaglio il nostro protocollo di base, in cui i singoli filamenti di actina sono ancorati da un'estremità alla superficie passivata del coverslip, si allineano con il flusso e possono essere successivamente esposti a diverse soluzioni proteiche. Presentiamo anche i protocolli per applicazioni specifiche e spieghiamo come possono essere applicate forze meccaniche controllate, grazie alla resistenza viscosa della soluzione scorrevole. Evidenziamo gli avvertimenti tecnici di questi esperimenti e presentiamo brevemente i possibili sviluppi basati su questa tecnica. Questi protocolli e spiegazioni, insieme alla disponibilità odierna di apparecchiature di microfluidica facili da usare, dovrebbero consentire ai non specialisti di implementare questo test nei loro laboratori.

Introduction

L'assemblaggio e lo smontaggio di filamenti di actina e reti di filamenti di actina sono controllati da diverse reazioni biochimiche e dipendono dal contesto meccanico. Al fine di ottenere informazioni su questi complessi meccanismi, è inestimabile essere in grado di osservare le singole reazioni sui singoli filamenti (in numero sufficientemente grande). Negli ultimi decenni, l'osservazione di filamenti dinamici di actina in tempo reale, per lo più utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF), è emersa come una tecnica chiave e ha fornito un elenco impressionante di risultati che non avrebbero potuto essere ottenuti con i saggi biochimici di soluzione di massa1.

Per raggiungere questo obiettivo, è necessario mantenere filamenti di actina marcati fluorescentemente vicino alla superficie del coverslip del microscopio mentre li si espone a soluzioni di proteine leganti l'actina (ABP), che possono anche essere etichettate fluorescentemente. Ciò fornisce un mezzo per monitorare gli eventi che si verificano su singoli filamenti in condizioni biochimiche ben controllate e quindi quantificare le velocità di reazione. Tuttavia, dovrebbero essere prese in considerazione una serie di limitazioni specifiche. Mantenere artificialmente i filamenti vicini alla superficie, spesso grazie a più punti di ancoraggio o utilizzando un agente di affollamento come la metilcellulosa, può alterare il loro comportamento (ad esempio, causando pause nella loro polimerizzazione e depolimerizzazione2). Tracciare il contorno di ciascun filamento può essere difficile, in particolare se nuovi filamenti o frammenti di filamento si accumulano nel campo visivo nel tempo. Le reazioni avvengono in un volume finito in cui la concentrazione di monomeri di actina e ABP può variare nel tempo, rendendo potenzialmente difficile ricavare costanti di velocità accurate. Infine, rinnovare o modificare la soluzione di ABP è difficile da ottenere in meno di 30 s e spesso porterà a un contenuto proteico disomogeneo nel campione.

Poco più di 10 anni fa, ispirati da quanto già fatto per studiare i singoli filamenti di Acido Desossiribonucleico (DNA)3, abbiamo introdotto una nuova tecnica basata sulla microfluidica per osservare e manipolare i singoli filamenti di actina4. Permette di aggirare le suddette limitazioni delle tecniche classiche a singolo filamento. In questi saggi di microfluidica, i filamenti di actina vengono coltivati da semi di spettrina-actina adsorbiti sul coperchio. I filamenti sono quindi ancorati da un'estremità solo al fondo della camera microfluidica e fluttuano sopra la superficie senza attaccarsi. I filamenti si allineano con il flusso delle soluzioni in entrata, facilitando così il monitoraggio della loro lunghezza del contorno e mantenendoli in una regione poco profonda sopra il coperchio in cui è possibile utilizzare TIRF. Diverse soluzioni vengono simultaneamente fatte fluire nella camera senza miscelazione e i filamenti possono essere esposti a loro in sequenza e rapidamente.

Qui, proponiamo una serie di protocolli di base per impostare saggi di microfluidica a filamento singolo di actina in laboratorio. Coverslips e camere microfluidiche possono essere preparati in anticipo (in mezza giornata) e l'esperimento stesso, in cui è possibile testare diverse condizioni biochimiche, viene eseguito in meno di un giorno.

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Protocol

1. Preparazione della camera microfluidica

  1. Selezionate uno stampo master SU-8 con diversi modelli di camera. Le camere tipiche sono a forma di croce con tre ingressi e un'uscita, 20 μm di altezza e 800 μm di larghezza (Figura 1). Tali stampi master possono essere acquistati da aziende esterne o realizzati in laboratori accademici (ad esempio, Gicquel, Y. et al.5).
  2. Posizionare il nastro attorno al bordo dello stampo.
    1. Metti ~ 50 cm di lunghezza, 19 mm di larghezza, nastro da ufficio trasparente standard (vedi Tabella dei materiali) su una panca, lato appiccicoso verso l'alto. Posizionare lo stampo verticalmente a un'estremità e lungo la linea mediana del nastro.
    2. Arrotolare lo stampo all'altra estremità del nastro per creare un bordo di 1 cm attorno allo stampo. Piegare il nastro sul fondo dello stampo.
  3. Preparare la soluzione di polidimetilsilossano (PDMS).
    1. In una pesata monouso, versare direttamente 25-30 g di base PDMS (Table of Materials). Aggiungere il 10% di peso/peso dell'agente polimerizzante PDMS (Tabella dei materiali) con una pipetta Pasteur in plastica monouso.
    2. Mescolare manualmente e accuratamente con un bastoncino di plastica. Assicurarsi che l'agente polimerizzante sia ben incorporato nella base PDMS, anche se l'agitazione crea molte bolle.
  4. Degasare la soluzione PDMS in un essiccatore sottovuoto (Table of Materials) per almeno 5 min a temperatura ambiente (RT). Le bolle si espanderanno, saliranno in superficie e scoppieranno quando il vuoto si romperà.
  5. Versare la soluzione PDMS sullo stampo SU-8. Utilizzare un bastoncino di plastica per raschiare e trasferire il più possibile la miscela.
  6. Degas PDMS per la seconda volta (5 min nell'essiccatore sottovuoto). Assicurati di sbarazzarti della maggior parte delle bolle (alcune piccole bolle sulla superficie superiore vanno bene).
  7. Posizionare lo stampo in forno a 70 °C per almeno 5 ore affinché il PDMS reticoli e solidifichi.
  8. Rimuovere le camere PDMS solide dallo stampo.
    ATTENZIONE: i wafer di silicio per stampi SU-8 sono estremamente fragili, quindi è necessario prestare molta attenzione quando si separa il PDMS dai wafer. Lavora su una superficie dura e piana e mantieni il wafer piatto sulla superficie.
    1. Con una lama di rasoio, effettuare un taglio circolare nel PDMS, a circa 1 cm di distanza dal bordo dello stampo. Tutti i modelli devono essere di almeno 0,5 cm all'interno del taglio. Staccare delicatamente il blocco PDMS centrale con delicati rimorchiatori.
      ATTENZIONE: Quando si stacca, mantenere lo stampo SU-8 piatto sul piano di lavoro per evitare di romperlo.
    2. Posizionare PDMS su un foglio di alluminio pulito, la superficie stampata rivolta verso il foglio di alluminio, per proteggere la sua superficie dalla polvere e per rendere i modelli più visibili.
  9. Scegli e taglia una camera con una lama di rasoio ad almeno 0,5 cm di distanza dal modello. Il blocco PDMS risultante è alto circa 0,5 cm, largo 1,5 cm e lungo 3 cm. Forare tre ingressi e un'uscita con un punzone per biopsia 0,75 mm ID (Tabella dei materiali).
  10. Pulire la camera PDMS con etanolo ultrapuro (Table of Materials) e asciugare all'aria utilizzando una pistola di sicurezza (Table of Materials). Posizionare il PDMS con il motivo rivolto verso l'alto in una capsula di Petri pulita e chiudere il piatto con il coperchio.

2. Pulizia del coperchio del vetro

NOTA: Qui, una procedura standard di pulizia del coverslip, basata su una serie di passaggi di sonicazione, è dettagliata. Altre procedure di pulizia del coperchio del vetro sono state descritte in molte altre pubblicazioni che possono ottenere risultati soddisfacenti simili 6,7,8,9.

  1. Posizionare 10-20 coverslips (40 mm di lunghezza) su un supporto in politetrafluoroetilene (PTFE) (Tabella dei materiali). Sonicare i coperchi in 0,5 L di soluzione detergente per vetro al 2% (Tabella dei materiali) in un becher di vetro da 1 L (35 °C, 30 min).
  2. Smaltire la soluzione detergente per vetri e risciacquare abbondantemente i coperchi con dH2O in almeno tre bagni successivi da 0,5 L.
  3. Preparare 0,5 L di 2 M KOH in un becher di vetro da 1 L. Sonicare i coverslips in KOH (RT, 30 min). Smaltire KOH e risciacquare i coverslip con dH2O in almeno tre bagni da 0,5 L.
    ATTENZIONE: utilizzare dispositivi di protezione di sicurezza di laboratorio appropriati (guanti, occhiali e camice da laboratorio).
  4. Trasferire e sonicare i coverslip in 0,5 L di etanolo ultrapuro (RT, 30 min). Coverslips può essere mantenuto in etanolo per un massimo di 2 settimane. Chiudere il becher con film termoplastico (Table of Materials) per evitare l'evaporazione. Prima dell'uso, asciugare il coperchio con flusso d'aria.

3. Assemblaggio della camera PDMS

  1. Preriscaldare la piastra calda a 100 °C. Posizionare fino a tre camere PDMS pulite e coperture in vetro in una capsula di Petri pulita. Posizionare la capsula di Petri aperta in un detergente ultravioletto (UV) profondo (λ = 185 nm, vedere Tabella dei materiali) ed esporla alla luce UV per 3-5 minuti.
    NOTA: In alternativa, le camere PDMS e i coverslip possono essere esposti all'aria o al plasma di ossigeno per 30 s.
  2. Posizionare delicatamente la camera PDMS sopra il coperchio. Assicurarsi che le due superfici messe a contatto siano state esposte direttamente ai raggi UV. Il PDMS si attacca automaticamente al vetro e la camera diventa chiaramente visibile.
  3. Per rimuovere l'aria intrappolata nell'interfaccia PDMS-coverslip, premere delicatamente la superficie con un dito. Per un incollaggio più stretto, premere più forte su angoli e lati. Assicurarsi che il soffitto della camera non entri in contatto con la superficie del vetro.
  4. Posizionare la camera con il fondo di vetro rivolto verso la piastra calda a 100 °C per 5 minuti. Dopo questo passaggio, i legami vetro-PDMS diventano permanenti e le camere possono essere utilizzate solo una volta. Utilizzare immediatamente la camera o conservarla in una capsula di Petri pulita per un massimo di una settimana.

4. [OPZIONALE] Passivazione diretta e funzionalizzazione

NOTA: A seconda dell'applicazione, le camere possono essere passivate e funzionalizzate una volta collegate al dispositivo di controllo microfluidico (vedere Tabella dei materiali) o iniettando manualmente soluzioni direttamente nella camera con una pipetta prima del suo collegamento al dispositivo microfluidico. Quest'ultimo offre il vantaggio di consumare meno reagente ed evitare potenziali contaminazioni facendo scorrere la soluzione attraverso il tubo in polietere etere chetone (PEEK) del dispositivo microfluidico. In tutti i passaggi seguenti, le soluzioni vengono iniettate attaccando direttamente la punta della pipetta nell'uscita. Per evitare di creare bolle all'interno della camera, assicurarsi di avere una piccola goccia che sporge dalla punta della pipetta quando si collega la punta all'uscita della camera PDMS. Allo stesso modo, rimuovere la punta della pipetta prima che l'intero volume sia stato iniettato.

  1. Iniettare 20 μL di PLL-PEG (1 mg/mL in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)). Incubare per un minimo di 1 ora (o durante la notte) a RT. Per evitare l'evaporazione, posizionare la camera PDMS in una scatola umida (ad esempio, una scatola di punta vuota con acqua nel compartimento inferiore e la camera PDMS sulla piattaforma di tenuta della punta).
  2. Iniettare 20 μL di 100 pM di semi di spettrina-actina (in F-buffer, vedere Tabella 1 e Tabella 2). Attendere non più di 1 minuto. Regola la concentrazione e i tempi del seme per regolare la densità della superficie del seme, abbastanza alta per statistiche di grandi dimensioni e abbastanza bassa da non sovrapporre i filamenti.
    NOTA: In alternativa, se i semi di spettrina-actina non sono disponibili, utilizzare segmenti di filamento corto funzionalizzati alla biotina che saranno immobilizzati su una coverliprivestita di streptavidina 9,10.
  3. [FACOLTATIVO] Iniettare 20 μL di albumina sierica bovina al 5% (BSA) in F-buffer. Lasciare a RT per 10 min.
  4. [FACOLTATIVO] Iniettare 20 μL di 1 mg/mL β-caseina in F-buffer. Lasciare a RT per 10 min.
    NOTA: seguire i passaggi 4.3 e/o 4.4 per passivare ulteriormente la camera. La scelta della passivazione dipende dalle proteine utilizzate e non funziona ugualmente bene su tutti gli ABP. Quando si utilizza l'actina da sola, PLL-PEG o BSA è sufficiente.

5. Collegare il dispositivo microfluidico

NOTA: Utilizzare un sistema microfluidico basato sulla pressione con un massimo di quattro canali per controllare i flussi nella camera microfluidica (Figura 1A, vedere Tabella dei materiali). Per evitare la formazione di bolle nel tubo microfluidico e perturbare la stabilità del flusso, degasare tutte le soluzioni. Posizionare 5 mL di dH20 e 10 mL di F-buffer stock in un essiccatore per vuoto collegato a una pompa per vuoto (vuoto finale <250 mbar) e degassare per almeno 1 ora a RT.

  1. Risciacquare ingressi + tubi di uscita con dH2O (500 μL, 300 mbar).
  2. Riempire tutti i tubi del serbatoio da 2 mL (vedere Tabella dei materiali) con 300 μL di F-buffer. Impostare la pressione a 300 mbar e lasciare che da cinque a otto gocce vadano sprecate. Ripetere l'operazione per ogni canale e impostare la pressione su 0.
  3. Collegare la presa e risciacquare ampiamente la camera.
    1. Impostare la pressione per il tubo del serbatoio 4 (uscita) a 50 mbar. Una volta che una goccia esce dall'estremità del tubo, collegare il tubo all'uscita della camera PDMS. Il liquido si riempie nella camera ed esce da tutte le prese.
    2. [FACOLTATIVO] Se la camera è stata passivata direttamente (sezione 4), impostare la pressione su 100 mbar per risciacquare la camera con 50-100 μL di F-buffer (3-5 min). Rimuovere il liquido in eccesso alle prese con un fazzoletto detergente.
    3. Impostare la pressione su 20 mbar.
  4. Collegare gli ingressi.
    1. Impostare la pressione per il tubo del serbatoio da 1 a 50 mbar. Per evitare l'introduzione di bolle d'aria, assicurarsi che una goccia esca dal tubo e dall'ingresso PDMS.
    2. Collegare il tubo all'ingresso 1 (le due goccioline si fondono durante il collegamento). Impostare la pressione su 30 mbar.
    3. Ripetere i passaggi 5.4.1-5.4.2 per collegare gli ingressi 2 e 3.
  5. Impostare la pressione di tutte le prese a 20 mbar e la pressione di uscita a 0 mbar. Assicurarsi che le portate nelle prese d'ingresso siano approssimativamente uguali (vedere la sezione Risoluzione dei problemi).

Figure 1
Figura 1: Iniezione di soluzioni attraverso una camera microfluidica. (A) Configurazione microfluidica standard per esperimenti di filamenti di actina singola. Le soluzioni proteiche, collocate nei serbatoi 1-3, vengono spinte nella camera regolando la pressione nella fase gassosa. Le portate generate sono misurate da misuratori di portata. All'interno delle camere microfluidiche, le soluzioni non si mescolano e occupano spazio a seconda delle pressioni relative applicate (qui, uguale pressione su tutte le prese). Dimensioni tipiche: i tubi del serbatoio contengono fino a 2 ml di soluzione. Il tubo in PEEK (diametro interno 0,25 mm) collega i serbatoi ai misuratori di portata (dopo 10 cm di tubo) e quindi alla camera PDMS (dopo altri 70 cm). Tubi in silicone e accoppiatori per tubi in acciaio inossidabile vengono utilizzati per collegare il tubo PEEK agli ingressi PDMS. Il canale microfluidico principale è alto 20-60 μm, largo circa 1 mm e lungo 1 cm. (B,C) Profili di flusso all'interno della camera microfluidica. (B) Il fluido genera un profilo parabolico attraverso l'altezza della camera: v(z) = 6z(h-z)R/h3w, dove h e w sono l'altezza e la larghezza della camera, e R è la portata totale. In basso: singolo filamento di actina polimerizzato da semi di spettrina-actina ancorati alla superficie. (C) Quando la larghezza della camera è considerevolmente maggiore della sua altezza, il flusso è quasi uniforme in tutta la camera, tranne che sulle superfici PDMS, dove va a zero. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Configurazione del setup con portate standard

NOTA: Il sistema di pressione controllato da computer consente una regolazione facile e precisa delle pressioni di tutte le prese/uscite collegate alla camera PDMS, quindi il controllo delle portate in entrata e in uscita. Le configurazioni preimpostate possono essere salvate e attivate / disattivate con un solo clic del mouse. Di seguito sono riportate le configurazioni consigliate (se non diversamente specificato, la pressione di uscita è impostata su 0 mbar). Vedere la Tabella 3 per le portate previste per queste configurazioni preimpostate. Le pressioni qui indicate devono essere regolate in base alla geometria della camera e alla configurazione del sistema.

  1. Modifica: utilizzare questo predefinito quando si cambiano uno o più serbatoi. Crea un lieve flusso all'indietro nel tubo di interesse per prevenire l'introduzione di bolle.
    1. Impostare tutte le pressioni di ingresso su 12 mbar e la pressione di uscita su 5 mbar (Figura 2B).
  2. High Flow 'All': utilizzare questo preset per iniettare rapidamente tre soluzioni in parallelo. Raggiungeranno la camera entro 4 minuti.
    1. Impostare tutte le pressioni di ingresso su 150 mbar.
  3. High Flow 'x': utilizzare questo preset per iniettare rapidamente una soluzione. Raggiungerà la camera entro 3 minuti (Figura 3A-C).
    1. Impostare la pressione di ingresso 'x' a 150 mbar (~15 μL/min). La pressione nelle altre prese viene regolata a circa 100 mbar, in modo tale che la portata risultante in queste prese sia di ~ 500 nL / min.
  4. Mid Flow 'All': usa questo preset per mettere in pausa il sistema.
    1. Impostare tutte le prese su 20 mbar (Figura 2A).
  5. Mid Flow 'x': utilizzare questo predefinito per consentire alla soluzione 'x' di riempire la maggior parte della larghezza del canale principale (vedere la Figura 2C,D), limitando al contempo le altre soluzioni di ingresso ai lati del canale. I filamenti di actina nella camera saranno quindi esposti alla condizione biochimica imposta dalla sola soluzione 'x'.
    1. Impostare la pressione di ingresso 'x' a 12 mbar. Impostare la pressione negli altri ingressi e regolare a ~ 9 mbar, in modo tale che le rispettive portate siano ~ 150 nL / min.

Figure 2
Figura 2: La pressione applicata a ciascun serbatoio controlla la distribuzione divisoria/spaziale delle soluzioni all'interno della camera microfluidica. (A) A parità di pressione applicata ai serbatoi, ogni soluzione occupa un terzo della camera. (B) Quando si cambia un tubo del serbatoio (qui serbatoio 3), la pressione effettiva scende a zero, creando un flusso all'indietro. (C,D) L'aumento della pressione relativa su uno dei serbatoi consente l'esposizione della superficie del vetro a una singola soluzione. Il campo visivo al centro della camera può essere esposto in sequenza alle soluzioni 1 e 2 alternando la configurazione Mid Flow 1 (C) e Mid Flow 2 (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Modifica della soluzione 'x'

NOTA: come mostrato nella Figura 3A-C, è importante tenere presente che le soluzioni impiegano pochi minuti per fluire da un tubo del serbatoio al canale principale della camera. Questo tempo minimo di "morte" è imposto dal volume di liquido contenuto nel tubo e dal profilo di flusso all'interno del tubo (Figura 3A-C).

  1. Preparare 200-300 μL di soluzione in un nuovo tubo del serbatoio. Impostare la pressione su Modifica impostazione (vedere paragrafo 6).
  2. Svitare il tubo del serbatoio di ingresso 'x'. La soluzione nel tubo scorrerà lentamente all'indietro, dalla camera alla punta libera del tubo. La portata misurata diventa negativa (Figura 2B).
  3. Una volta che una piccola goccia si è formata sulla punta del tubo, avvitare il nuovo tubo con la soluzione fresca. Una volta che il tubo è correttamente stretto al sistema di pressione, la portata dell'ingresso ritorna positiva.
  4. Impostare l'impostazione della pressione su High Flow 'x'.
  5. A seconda della configurazione microfluidica e della geometria della camera, attendere 3-5 minuti affinché la soluzione riempia completamente il tubo e raggiunga la camera.
  6. [FACOLTATIVO] Seguire questo processo misurando l'aumento della fluorescenza nel tempo (Figura 3C).

Figure 3
Figura 3: Arrivo ritardato delle soluzioni dai serbatoi alla camera PDMS e rapido cambiamento delle condizioni biochimiche. (A-C) Arrivo ritardato delle soluzioni dai serbatoi alla camera PDMS. (A) A seconda della geometria della camera, della lunghezza del tubo e della pressione applicata all'ingresso o agli ingressi, la sostituzione di una soluzione con un'altra non è istantanea. Dopo aver sostituito il tubo del serbatoio con uno contenente una soluzione fluorescente (0 min), la soluzione riempie progressivamente il tubo (0,4 min) e la camera PDMS (1-2 min). La temporizzazione indicativa è data per una pressione applicata di 150 mbar, un tubo peek da 80 cm e una camera PDMS larga 1600 μm e alta 20 μm. (B) Il profilo di flusso parabolico all'interno del tubo peek genera un gradiente efficace di fluorescenza lungo il profilo radiale del tubo e all'interno della camera (vedere anche Figura 1B). (C) L'arrivo ritardato delle soluzioni può essere quantificato misurando il segnale di epifluorescenza di fondo nella camera in funzione del tempo. Condizioni sperimentali: 0,5 μM 10% G-actina marcata Alexa-568 viene iniettata con 150 mbar attraverso un flussometro e un tubo PEEK da 80 cm. (D,E) Rapido cambiamento delle condizioni biochimiche. (D) Modello delle soluzioni in entrata in due condizioni di flusso medio. (E) Aumento della fluorescenza di fondo come lettura della concentrazione di actina. Il tempo t = 0 è impostato all'inizio dell'aumento della fluorescenza. Soluzione 1: 0,5 μM 10% G-actina etichettata con Alexa-488, soluzione 2: F-buffer. (C,E) Camera PDMS: alta 20 μm e larga 1600 μm. L'intensità dell'epifluorescenza, ~2 μm sopra la superficie, è stata quantificata facendo la media del segnale sull'intero campo visivo, normalizzato a 0 in assenza di fluoroforo e 1 alla massima intensità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

8. Esperimento di base a singolo filamento: depolimerizzazione dell'estremità dell'adenosina difosfato (ADP) -actina

NOTA: questa sezione presuppone una camera non funzionalizzata (solo sezione 5). Se la camera è stata funzionalizzata direttamente (sezione 4), iniziare dal punto 8.4.

  1. Funzionalizzazione superficiale con semi di filamento di actina:
    1. Modificare la soluzione da 3 a 200 μL di semi di 50 pM di spettrina-actina11 in F-buffer (vedere paragrafo 7).
      NOTA: In alternativa, se i semi di spettrina-actina non sono disponibili, si possono utilizzare segmenti di filamento corto funzionalizzati alla biotina che saranno immobilizzati su una copertura rivestita di streptavidina (fare riferimento a 9,10 per i dettagli).
    2. Iniettare per 2 minuti con High Flow 3.
      NOTA: Regolare la concentrazione e il tempo in base alla densità finale del seme.
  2. Passivazione superficiale:
    1. Cambiare il tubo 3 con 300 μL del 5% di BSA in F-buffer.
    2. Iniettare per 5 minuti ad High Flow 3, seguito da 5 min a Mid Flow 3. Durante questa seconda fase, ridurre la pressione nei canali 1 e 2 a 7-8 mbar per ottenere un controcorrente ~ -100 nL / min, in modo che l'intera superficie della camera sia passivata BSA.
      NOTA: Poiché la soluzione BSA è più viscosa, le pressioni devono essere regolate di conseguenza.
  3. Cambiare il tubo 3 in F-buffer e risciacquare il canale (5 min, High Flow 3).
  4. Preparare le seguenti soluzioni da 200-300 μL, tutte le proteine diluite in F-buffer:
    Ingresso 1, soluzione di polimerizzazione: 1 μM 10% Alexa-488 marcato G-actina, 1 μM profilina (Tabella 1).
    Ingresso 2, soluzione di invecchiamento: 0,15 μM 10% Alexa-488 etichettato G-actina.
    Ingresso 3, soluzione di depolimerizzazione: solo F-buffer.
    NOTA: Profilina è qui usato per prevenire la nucleazione spontanea e per mantenere una concentrazione costante di G-actina.
  5. Cambiare i tubi da 1 a 3 (sezione 7). Iniettare utilizzando il preset High Flow All per 3-4 min. Le tre soluzioni hanno ora riempito il tubo in PEEK e raggiunto la camera (Figura 3A). La superficie del vetro può essere esposta a qualsiasi soluzione di ingresso senza tempo morto (<1 s, Figura 3D,E).
  6. Accendere il microscopio. Impostare le impostazioni: laser di eccitazione 150 mW 488 nm al 10% -20% di potenza, tempo di esposizione della fotocamera 100-200 ms, profondità di penetrazione TIRF 200-300 nm, obiettivo 60x. Queste impostazioni sono utilizzate in tutto il manoscritto.
  7. Polimerizzazione del filamento (Figura 4A):
    1. Impostare l'impostazione della pressione su Mid Flow 1 per ~ 10 min.
    2. [FACOLTATIVO] Polimerizzazione record (1 frame/20 s, TIRF). I filamenti dovrebbero polimerizzare a circa 10 subunità/secondo (sub/s)1,12.
  8. Invecchiamento del filamento: impostare l'impostazione della pressione su Mid Flow 2 per 15 minuti. Alla concentrazione critica, 0,15 μM G-actina, la lunghezza del filamento rimarrà costante e i filamenti si trasformeranno in >99% ADP-F-actina4.
  9. Depolimerizzazione (Figura 4A):
    1. Avviare l'acquisizione a 1 frame/5 s, in modalità epifluorescenza. Poiché nei canali 2 e 3 è presente uno sfondo a fluorescenza molto bassa, non è necessario utilizzare TIRF.
    2. Dopo uno o due fotogrammi, passare a Mid Flow 3. I filamenti dovrebbero depolimerizzare a circa 10 sub/s (riferimento12).
  10. Per ripristinare l'esperimento, rompere tutti i filamenti etichettati in modo fluorescente esponendoli continuamente al laser alla massima potenza per ~ 2 minuti. Per testare condizioni diverse, cambiare le soluzioni 1, 2 o 3 e iniettarle (High Flow, 3-4 min). Ripetere i passaggi da 8.7 a 8.9.

9. Altri esperimenti a filamento singolo

  1. Test delle interazioni degli ABP con F-actina
    NOTA: La microfluidica è stata utilizzata con successo per quantificare l'attività di diversi ABP leganti lateralmente, come cofilina, tropomiosina e Arp2/3. Seguendo il protocollo di cui al paragrafo 8:
    1. Cambia canale 3 con l'ABP fluorescente di interesse in F-buffer. Iniezione (High Flow 3, 3 min).
    2. Polimerizzazione del filamento: impostare l'impostazione della pressione su Mid Flow 1 per 10 min.
    3. ABP binding: Inizia l'acquisizione con TIRF. Regola la frequenza dei fotogrammi in base alla concentrazione ABP. Dopo 1-2 fotogrammi, passare a Mid Flow 3.
      NOTA: a seconda dell'ABP, può anche essere possibile passare rapidamente (ad esempio, per meno di 5 s) a Mid Flow 2 per ridurre ulteriormente la fluorescenza di sfondo quando si scatta un'immagine.
    4. ABP unbinding: mentre continua l'acquisizione, passa a Mid Flow 2.
  2. Polimerizzazione con formina all'estremità libera spinata
    NOTA: Formins ha dimostrato di influenzare la polimerizzazione dell'estremità spinata del filamento. La microfluidica è particolarmente adatta per misurare i tassi di legame e slegamento della formina e il loro impatto sull'allungamento del filamento.
    1. Preparare le soluzioni seguenti:
      Canale 1: 10 nM formin in F-buffer (Tabella 1).
      Canale 2: 1 μM 10% Alexa-488 marcato G-actina, 4 μM profilina.
      Canale 3: F-buffer.
    2. Cambiare i tubi 1, 2 e 3 (sezione 7). Iniettare utilizzando il preset High Flow All per 3-4 min.
    3. Avviare la polimerizzazione del filamento: impostare l'impostazione della pressione su Mid Flow 2 per 2 min.
    4. Legame Formin all'estremità spinata del filamento: impostare le impostazioni di pressione su Mid Flow 1 per 30 s.
    5. Polimerizzazione mediata da formin: impostare l'impostazione della pressione su Mid Flow 2. Con formin mDia1 alla loro estremità spinata, i filamenti dovrebbero polimerizzare a circa 50 sub / s 13,14,15.
  3. Polimerizzazione/depolimerizzazione da formina ancorata in superficie
    NOTA: È stato dimostrato che i tassi di polimerizzazione e depolimerizzazione delle estremità spinate decorate con formina dipendono dalla tensione applicata al filamento. In microfluidica, l'attrito del flusso del fluido lungo il lato del filamento genera una tensione proporzionale alla lunghezza del filamento e alla portata14,16.
    1. Utilizzare il metodo descritto nella sezione 8 sopra descritta, sostituendo i passaggi 8.1, 8.2 e 8.3 per la passivazione superficiale con:
      1. Cambiare il tubo da 3 a 1 μg/mL anticorpo anti-His in F-buffer. Iniettare per 2 minuti con High Flow 3.
      2. Cambio tubo 3 con BSA al 5% in F-buffer. Iniettare per 5 minuti ad High Flow 3, seguito da 5 min a Mid Flow 3. Durante questa seconda fase, ridurre la pressione nei canali 1 e 2 a 7-8 mbar per ottenere un controflusso ~ -100 nL / min in modo che l'intera superficie della camera sia passivata BSA.
      3. Cambia il tubo da 3 a 100 nM His-tagged formin in F-buffer. Iniettare per 5 minuti con High Flow 3. Cambiare il tubo 3 con F-buffer. Iniettare per 5 minuti con High Flow 3 per garantire che non rimangano formin nel tubo.
    2. Preparare e iniettare le seguenti soluzioni (200-300 μL ciascuna, in F-buffer):
      Canale 1: 1 μM 10% Alexa-488 etichettato G-actina.
      Canale 2: 1 μM G-actina non etichettata, 4 μM profilina.
      Canale 3: solo F-buffer.
    3. Nucleazione del filamento: esporre le formine ancorate alla superficie alla G-actina (impostazione Mid Flow 1).
    4. Polimerizzazione del filamento: Esporre la camera alla profilina-actina utilizzando Mid Flow 2.
    5. Inizio acquisizione: 1 frame/2 s, epifluorescenza. Con formin mDia1, i filamenti dovrebbero polimerizzare a 50-80 sub/s, a seconda della lunghezza del filamento e della portata14.
    6. Depolimerizzazione del filamento: Avvio dell'acquisizione (1 frame/4 s, epifluorescenza). Dopo 1-2 fotogrammi, esporre i filamenti all'F-buffer, Mid Flow 3. Con formin mDia1, i filamenti dovrebbero depolimerizzare a 5-15 sub/s, a seconda della lunghezza del filamento e della portata14.
  4. Filamenti di actina con segmenti non etichettati
    NOTA: l'etichettatura fluorescente dell'actina crea diversi artefatti, come le pause durante la depolimerizzazione17 e il legame alterato della tropomiosina18. Una soluzione alternativa per questi artefatti consiste nell'utilizzare la microfluidica per assemblare filamenti che mostrano segmenti senza etichetta.
    1. Preparare e iniettare le seguenti soluzioni (200-300 μL in F-buffer):
      Canale 1: 1 μM G-actina non etichettata, 1 μM profilina.
      Canale 2: 0,3 μM 10% Alexa-488 etichettato G-actina.
    2. Esporre in sequenza la superficie al canale 2 (5 min), al canale 1 (10 min) e al canale 2 (15 min) per generare segmenti ADP-actina non etichettati con segmenti marcati in modo fluorescente a ciascuna estremità.
  5. Filamenti spinati ancorati all'estremità con gelsolina
    NOTA: Con i semi di spettrina-actina, i filamenti polimerizzano alla loro estremità spinata libera mentre l'estremità appuntita è stabilizzata dal seme di spettrina-actina. Un'alternativa è quella di ancorare i filamenti con un tappo terminale spinato come la gelsolina.
    1. Preparare una soluzione di F-actina di 4 μM 10% Alexa-488 marcata G-actina in 20 μL di F-buffer. Lasciare che l'actina nucleanti spontaneamente e polimerizzi a RT per almeno 30 minuti sul banco. Avvolgere il tubo in un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce.
    2. Nel frattempo, preparare la camera microfluidica e passivare la superficie con una miscela di 5% BSA e 1% biotina-BSA (vedi passo 8.2).
    3. Risciacquare il canale 3 con F-buffer (2 min ad Alta Portata 3). Iniettare 10 μg/mL neutravidina in F-buffer (4 min ad alta portata 3).
    4. Cambia i tubi in:
      Canale 1: 10 nM biotina-gelsolina (Tabella 1).
      Canale 2: F-buffer.
      Canale 3: 0,4 μM di F-actina prepolimerizzata.
    5. Iniettare tutte le soluzioni insieme utilizzando l'impostazione High Flow All per 3 min.
    6. Esporre l'intera camera alla gelsolina (Mid Flow 1, 30 s).
    7. Attaccare i filamenti alla superficie (Low Flow 3: Canale 3 a 3 mbar, Canali 1 e 2 a ~ 2 mbar, per circa 2 min).
    8. [FACOLTATIVO] Se la densità del filamento è troppo bassa, ripetere i passaggi 9.5.6 e 9.5.7.
    9. Depolimerizzazione dell'estremità appuntita: acquisizione iniziale (1 frame/30 s, epifluorescenza). Dopo 1-2 fotogrammi, esporre i filamenti solo al buffer, Mid Flow 2. I filamenti dovrebbero depolimerizzare a circa 0,2 sub/s.

10. Formazione e smontaggio di fasci di filamenti indotti da fascin da ADF / cofilin

NOTA: Per formare fasci di filamenti di actina, assicurarsi di avere una densità di semi di filamento sufficientemente elevata sulla superficie della camera. Se esposti alla proteina fascina, i filamenti vicini che fluttuano lateralmente saranno dinamicamente reticolati da proteine fascine. Poiché il fascio si slega rapidamente dal lato del filamento19, il fascio deve essere costantemente presente nella soluzione principale che scorre per mantenere l'impacchettamento del filamento.

  1. Seguire i passaggi 8.1-8.3.
  2. Preparare le seguenti soluzioni (200-300 μL in F-buffer):
    Canale 1, soluzione di polimerizzazione: 1 μM 10% Alexa-488 marcato G-actina, 1 μM profilina.
    Canale 2, Soluzione bundling: fascina 200 nM (Tabella 1), 0,15 μM 10% Alexa-488 marcata G-actina.
    Canale 3, Soluzione di smontaggio: 200 nM ADF/cofilin (Tabella 1), 100 nM fascina, 0,15 μM 10% Alexa-488 etichettato G-actina.
  3. Cambiare i tubi da 1 a 3 (sezione 7). Iniettare utilizzando il preset High Flow All , per 3-4 min.
  4. Polimerizzazione del filamento: impostare l'impostazione della pressione su Mid Flow 1 per ~ 10 min. La polimerizzazione può essere ripresa con TIRF.
  5. Raggruppamento di filamenti (Figura 4C): avviare l'acquisizione di immagini (1 fotogramma/5 s, epifluorescenza). Dopo 1-2 fotogrammi, impostare l'impostazione della pressione su Mid Flow 2 e osservare il raggruppamento dei filamenti.
  6. Frammentazione del bundle: inizia l'acquisizione dell'immagine (1 frame/5 s, epifluorescenza). Dopo 1-2 fotogrammi, impostare l'impostazione della pressione su Mid Flow 3 e osservare lo smontaggio indotto dalla cofilina sia dei singoli filamenti che dei fasci.

11. Procedura di pulizia del dispositivo microfluidico

NOTA: per evitare qualsiasi contaminazione da un esperimento all'altro, è fondamentale pulire e asciugare completamente tutti i tubi e i misuratori di portata dopo ogni esperimento.

  1. Scollegare tutti i tubi dalla camera PDMS ed eliminare la camera.
  2. Per pulire i tubi in PEEK e i misuratori di portata, inserire il tubo in un tubo di plastica vuoto da 15 ml e iniettare le seguenti soluzioni alla massima pressione fino a quando il serbatoio non è quasi vuoto:
    400 μL di F-buffer.
    400 μL di 0,5 M NaOH.
    400 μL di acqua pura.
    200 μL di isopropanolo.
  3. Sostituire con un serbatoio vuoto e soffiare aria fino a quando i tubi sono completamente asciutti (~ 2-4 min, pressione massima).

12. Analisi delle immagini

NOTA: Mentre questo manoscritto si concentra sul metodo per assemblare, manipolare e visualizzare singoli filamenti di actina in microfluidica, un breve metodo per analizzare i film acquisiti è fornito qui. L'analisi viene eseguita su immagini a 16 bit, utilizzando ImageJ, seguendo la sezione 8.

  1. Il trattamento dell'immagine è minimo:
    1. Importare lo stack di immagini di polimerizzazione o depolimerizzazione.
    2. [FACOLTATIVO] Omogeneizza l'intensità dell'immagine con la funzione Sottrai sfondo (impostazioni predefinite (ad esempio "Raggio della palla rotante" = 50 pixel)). Ciò è particolarmente utile se la fluorescenza di fondo cambia nel corso di un filmato o se l'illuminazione a fluorescenza non è omogenea sul campo visivo.
    3. Regola luminosità e contrasto (sfondo vicino allo zero, filamenti vicini al massimo).
  2. Crea il kymograph a filamento:
    1. Selezionare un filamento che non si fermi, non si rompa o non si stacchi. Non selezionare in base al comportamento in altro modo. Disegna una linea 1-2 pixel sopra (strumento Linea retta). Salva il numero del filamento (Aggiungi ROI Manager).
    2. Applicare la funzione Reslice (Conteggio sezioni: 5 pixel). Calcolare l'intensità massima (funzione Zprojection).
  3. Misurare il tasso di polimerizzazione/depolimerizzazione:
    1. Sul kymograph, disegnare una linea lungo l'estremità spinata del filamento (strumento Linea retta , Figura 4A). Misurare la larghezza e l'altezza della linea (funzione Misura).
  4. Ripetere i passaggi 12.2-12.3 su più filamenti. Calcolare i tassi di polimerizzazione/depolimerizzazione (Figura 4A):
    Equation 1, dove v è la velocità (in sub/s), w la larghezza della linea (pixel), pix la dimensione dei pixel (nm), h l'altezza della linea (fotogrammi) e dt il tempo tra i fotogrammi (in secondo). Qui, 2,7 nm corrispondono al contributo effettivo di una subunità di actina alla lunghezza del filamento.

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Representative Results

Per tutti gli esperimenti sopra descritti, i filamenti di actina marcati fluorescentemente dovrebbero essere chiaramente visibili, con un buon contrasto, indicativo di una bassa fluorescenza di fondo dalla superficie (Figura 4, vedere il file supplementare 1 per la risoluzione dei problemi comuni). Anche i filamenti di actina non dovrebbero attaccarsi alla superficie: quando la portata dominante è bassa, le fluttuazioni laterali dei filamenti di actina dovrebbero essere percepibili quando li si osserva dal vivo e consentire di determinare chiaramente che sono ancorati solo da una delle loro estremità. Allo stesso modo, quando si utilizza l'imaging TIRF, le loro fluttuazioni verticali dovrebbero essere visibili da cambiamenti di intensità lungo la loro lunghezza e tempo. A seconda delle portate applicate, potrebbe essere necessario regolare la profondità di penetrazione TIRF per ottimizzare la qualità dell'immagine dei filamenti di actina acquisiti da TIRF.

Quando si espongono i filamenti a condizioni di polimerizzazione (vedere paragrafo 8), l'allungamento del filamento deve essere regolare (cioè, l'allungamento all'estremità del filamento non è ostacolato dall'interazione superficiale o dall'incollaggio permanente). Inoltre, la velocità di allungamento dell'estremità spinata del filamento misurata deve corrispondere al valore atteso in base alla concentrazione di actina nel tubo 1,20, indicando che la soluzione del tubo è stata correttamente fatta scorrere fino alla camera microfluidica (Figura 4A). Allo stesso modo, se esposti a una soluzione tampone, i filamenti dovrebbero depolimerizzare costantemente a una velocità che rifletta il loro contenuto di ADP4 (Figura 4A). Quando si espongono filamenti di actina già coltivati a una soluzione di cofilina marcata fluorescentemente, i cluster di cofilina saranno nucleati e cresceranno verso entrambe le estremità appuntite e spinate (Figura 4B) ad una velocità che dipende dalla concentrazione di cofilin. Quando si valuta una potenziale attività di reticolazione di un ABP, come la fascina (Figura 4C), i filamenti di actina vicini che formano fasci saranno facilmente rilevati dalla loro maggiore intensità di fluorescenza e da un cambiamento nelle loro fluttuazioni laterali.

Il flusso di liquido applica una forza di attrito viscosa sui filamenti di actina che sono ancorati alla superficie della camera microfluidica. Il coefficiente di forza di attrito su F-actina è η = 6,10-4 pN·s/μm2, espresso per filamento micron di lunghezza14. A portate intermedie, poiché l'altezza del filamento oscilla intorno a una media costante di 250 nm sopra la superficie, esiste un gradiente di forza dalla fine fluttuante fino al punto di ancoraggio del filamento. Si può quindi calcolare la tensione applicata in qualsiasi punto lungo il filamento, usando F = 6ηπLv, dove v è la velocità del flusso locale 250 nm sopra la superficie (Figura 1B) e L è la lunghezza del segmento del filamento a valle (cioè dal punto considerato fino all'estremità libera). Per portate più elevate, l'altezza media del filamento non è costante ma aumenta linearmente dal punto di ancoraggio all'estremità libera, rimane in media inferiore a 250 nm e varierà a seconda delle portate, portando così a un profilo di forza di tensione più complesso lungo il filamento21.

Figure 4
Figura 4: Risultati rappresentativi. Esperimenti tipici in cui i filamenti di actina sono polimerizzati da semi di spettrina-actina ed esposti a diversi ABP. Per motivi di chiarezza, viene mostrata solo una frazione del campo visivo. (A) Risultato dell'esperimento di polimerizzazione-depolimerizzazione di base (sezione 8). I filamenti sono polimerizzati con una soluzione di 0,8 μM 10% Alexa-488 marcata G-actina, invecchiata per 15 minuti per convertire tutte le subunità in ADP-actina (non mostrata) e depolimerizzata quando esposti solo a F-buffer. In basso: kymografi utilizzati per quantificare i tassi di polimerizzazione e depolimerizzazione. Acquisito a 1 frame/5 s, tempo di esposizione 200 ms, laser 150 mW 488 nm al 9% di potenza, TIRF (profondità di penetrazione laser 250 nm). (B) Frammentazione di singoli filamenti di actina di 500 nM mCherry-cofilin-1. L'actina è etichettata con ATP-ATTO48822 (giallo) e la cofilina-1 è fusa con mCherry (blu). In alto: frazione di un campo visivo. Nota: aggregati proteici sulla superficie. In basso: kymograph che mostra il legame di cofilin-1 a un filamento (le punte di freccia mostrano eventi di nucleazione del dominio cofilin-1), portando a un evento di frammentazione (simbolo del fulmine). Acquisito a 1 frame/4 s, esposizione 200 ms, laser 150 mW 488 nm al 16% e laser 100 mW 561 nm al 12% di potenza, epifluorescenza. C) Raggruppamento di filamenti di actina mediante fascina (punto 10.5). I filamenti sono stati inizialmente polimerizzati con 0,8 μM 5% Alexa-488 etichettato G-actina e in bundle con fascina 200 nM. Rispetto ai singoli filamenti, i fasci di filamenti appaiono da due a tre volte più luminosi e non perfettamente allineati con il flusso. Acquisito a 1 frame/10 s, esposizione 200 ms, intensità lampada Mercury 20% 200 W, epifluorescenza. (A-C) Lo sfondo è stato sottratto con la funzione ad hoc di ImageJ. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome della proteina specie Uniprot ref (sequenza) protocollo di purificazione originale rif. Commenti
actina coniglio P68135 (lunghezza intera) 23 Per l'etichettatura fluorescente, vedere rif 24
profilin1 Umano P07737 (lunghezza intera) 25 vedi anche rif 11
Seme di spettrina-actina Umano N/D 26, 27 vedi anche rif 11
cofilina1 topo P18760 (lunghezza intera) 28
gelsolina Umano P06396 (lunghezza intera) 29
mDia1 formin topo O08808 (aa 552–1255) 13 protocollo più dettagliato nel riferimento 24
fascina1 Umano Q16658 (lunghezza intera) 30

Tabella 1: Actina e proteine leganti l'actina 23,24,25,26,27,28,29,30

Reagente concentrazione
Tris-HCl pH 7,4 5 mM
Kcl 50 metri quadrati
MgCl2 1 mM
EGTA 0,2 mM
ATP 0,2 mM
DTT · 10 mM
DABCO · 1 mM

Tabella 2: Composizione del tampone F. DABCO e una concentrazione relativamente elevata di DTT sono utilizzati per limitare i danni fotoindotti ai filamenti dovuti all'esposizione alla luce durante gli esperimenti di microscopia a fluorescenza.

Impostazione dei nomi Pressione (mBar) Portata (nL/min)
Pressione massima 300 ~ 30 000 (nel canale dominante)
Alta pressione 150 ~ 15 000 (nel canale dominante)
Media pressione 12 ~ 1500 (nel canale dominante)
Pressione "mutevole" 12 per tutte le insenature,
5 per presa		 ~ 500 (in ogni ingresso)

Tabella 3: Corrispondenza tra le pressioni applicate e le portate misurate. Le portate risultanti dipendono fortemente dalla configurazione sperimentale. I valori sono dati per una camera microfluidica con un canale principale lungo 1 cm di sezione trasversale 20 μm x 800 μm (altezza x larghezza), collegato a ciascun serbatoio con tubo peek lungo 80 cm.

File supplementare 1: problemi, cause e soluzioni classiche. Hanno comunemente riscontrato problemi quando si lavora con microfluidica e / o filamenti di actina singola. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Rispetto ai metodi standard a filamento singolo in cui i filamenti di actina sono ancorati alla superficie da più punti lungo la loro lunghezza o mantenuti vicino ad essa da un agente di affollamento come la metilcellulosa, la microfluidica offre una serie di vantaggi. Poiché le interazioni con la superficie sono minime, vengono evitate le pause artificiali che queste interazioni possono indurre sia durante l'allungamento che durante la depolimerizzazione. I filamenti sono allineati dal flusso, paralleli tra loro, facilitando il loro monitoraggio e la misurazione delle loro lunghezze. La soluzione intorno ai filamenti viene costantemente rinnovata, esponendoli a concentrazioni proteiche costanti. Essere in grado di passare rapidamente (<1 s, Figura 3D, E) tra diverse soluzioni proteiche a cui sono esposti i filamenti consente di eseguire esperimenti sequenziali controllati nel tempo, che sono spesso strumentali per gli studi cinetici. Infine, la resistenza viscosa esercitata dalla soluzione fluida sui filamenti può essere sfruttata per applicare sollecitazioni meccaniche controllate sui filamenti (sezione Risultati Rappresentativi). Si dovrebbe notare che i flussi di fluido moderati (impostazioni di pressione Mid Flow ) portano i filamenti abbastanza vicini alla superficie (~ 250 nm) per visualizzarli in modo efficiente con TIRF generando una tensione minima (<1 pN)14.

Rispetto ai classici saggi a filamento singolo, tuttavia, la microfluidica richiederà volumi maggiori di soluzioni proteiche: in genere pochi 100 μL, quando un esperimento standard potrebbe essere fatto con meno di 10 μL. Questa può essere una limitazione quando si utilizzano proteine preziose. Gli esperimenti classici possono essere utilizzati per aiutare a stabilire le condizioni sperimentali rilevanti (ad esempio, concentrazioni assolute o relative di diverse proteine) prima di iniziare una serie di esperimenti microfluidici. Un'altra limitazione, come per qualsiasi altra tecnica a singolo filamento in vitro, deriva dalla passivazione imperfetta della superficie del coverslip. La riproducibilità nella pulizia del coverslip e nel legame dello strato di passivazione (BSA, PEGylation, ecc.) è sempre difficile da controllare. Una tecnica di passivazione one-step basata sul trattamento superficiale PEG-silano è diventata la tecnica di scelta in molti laboratori 7,15. Pertanto, la densità effettiva dei semi di filamento può variare tra gli esperimenti di circa due volte, anche se ripetuta nel modo più accurato possibile. Si dovrebbe mirare a una gamma soddisfacente di densità superficiale del filamento ed essere pronti a ripetere l'esperimento, se necessario. I problemi comunemente riscontrati quando si lavora con microfluidica e / o filamenti di actina singola sono discussi nel file supplementare 1.

Per il protocollo di base qui presentato, si dovrebbe notare che i semi di spettrina-actina, che possono essere visti come brevi filamenti stabilizzati, sono orientati in modo casuale mentre si attaccano alla superficie. Di conseguenza, poiché i filamenti cresciuti da questi semi si allineano con il flusso, la loro porzione più vicina al seme sarà bruscamente piegata, ognuno con il proprio angolo. La lunghezza su cui i filamenti sono piegati è solitamente molto piccola quando i filamenti sono esposti a flussi medi o alti. In effetti, questa lunghezza sarà generalmente inferiore al limite di diffrazione (~ 200 nm) e quindi non sarà facilmente rilevabile. È importante sottolineare che gli ABP sensibili alla curvatura del filamento si legheranno e funzioneranno in modo diverso in questa regione altamente piegata. Per evitare risultati distorti, il più semplice è escludere questa regione dall'analisi21.

Prima di iniziare a usare la microfluidica per manipolare e visualizzare singoli filamenti di actina, era già stato usato per studiare i singoli filamenti di DNA3, che sono molto più flessibili. Ciò può dare origine a notevoli differenze, poiché il flusso può srotolare drasticamente il DNA e cambiare drasticamente la sua lunghezza apparente. La microfluidica può anche essere utilizzata, in modo molto simile al metodo qui presentato, per studiare i microtubuli; questi sono molto più rigidi ma possono comunque essere fatti allineare con il flusso al fine di misurare il loro allungamento e depolimerizzazione, sfruttando il rapido cambio di condizioni31,32, o essere piegati da un flusso perpendicolare per misurare la plasticità dei microtubuli7.

Abbiamo presentato qui il protocollo per l'esperimento di base, dove i filamenti sono ancorati da una sola estremità e dove la direzione del flusso nel campo visivo è la stessa durante l'esperimento. Queste due caratteristiche possono essere variate. Ad esempio, i filamenti possono essere ancorati da più punti per generare un diverso profilo di forza lungo il filamento. Allo stesso modo, la direzione del flusso può essere variata (in prossimità della giunzione tra i canali di ingresso, nella camera di flusso) per piegare localmente i filamenti, poiché la parte non ancorata punterà in una direzione diversa rispetto al segmento di filamento ancorato21. I filamenti che si allungano da semi di spettrina-actina ancorati casualmente possono anche essere esposti a proteine reticolanti per formare fasci33 (vedere paragrafo 10). Combinando la microfluidica con altre tecniche (micropatterning, pinzette ottiche, ecc.) o progettando camere microfluidiche con compartimenti per modificare le linee di flusso, è possibile creare più configurazioni per studiare l'attività specifica dell'ABP su singoli filamenti o per formare piccole reti di actina34. Il numero di combinazioni, insieme al vantaggio e alla versatilità della microfluidica, offre molti strumenti ai ricercatori per decifrare la regolazione spazio-temporale delle reti di actine su scala molecolare.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Siamo grati a B. Ladoux e R.-M. Laboratorio Mège per l'uso delle loro apparecchiature di pulizia UV, e J. Heuvingh e 0. du Roure per la formazione iniziale che abbiamo ricevuto sulla preparazione di stampi su wafer di silicio e fornendo suggerimenti sulla microfluidica. Riconosciamo i finanziamenti della sovvenzione del Consiglio europeo della ricerca StG-679116 (ad A.J.) e delle sovvenzioni agence Nationale de la Recherche Muscactin e Conformin (a G.R.-L.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-Casein Merck C6905 Used at 8 mg/mL
Biopsy punch (with plunger) Ted Pella 15115-2 ID 0.75 mm, OD 1.07 mm
Biotin-BSA Merck A8549 Used at 1 mg/mL
BSA Merck A8022 Used at 50 mg/mL
Coverslip Mini-Rack
Teflon holder		 Invitrogen C14784 for 8 coverslips
Coverslips 22x40mm
Thickness #1.5		 Menzel Gläser 631-1370
DABCO Merck D27802 component in f-buffer
DTT Euromedex EU0006-D component in f-buffer
Ester NHS Alexa Fluor 488 Invitrogen A20000 Fluorophore for actin labeling on Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific 21338 To biotinylate actin on Lys328
Hellmanex III Hellma 9-307-011-4-507 Glass cleaning detergent
ImageJ NIH N/A open source software
Laboport KNF 811kn.18 vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)
Magic invisible tape Scotch 7100024666 standard transparent office tape
Micrewtube Simport T341-6T 2 mL microfluidic reservoir tubes
Microfluidic device Part 1: Flow Unit S Fluigent FLU-S-D-PCKB Flowmeter
Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL Fluigent 14002001PCK Reservoir holder
Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ Fluigent EZ-11000001
EZ-00345001		 Pressure controller
Model 42 - UVO-Cleaner Jelight Inc. 42-220 Ultraviolet cleaner
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 Jena Bioscience NU-805-488 ATP-ATTO used to label actin
neutravidin Thermo Scientific 31000
PLL-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) Use at 1 mg/mL in PBS.
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer Dow Corning 1673921 Contains PDMS base and curing agent
Polyetheretherketone (PEEK) tubing Merck Z226661 “Blue” : I.D. = 0.25 mm
Safety blow gun Coilhose Pneumatics 700-S filtered air
Silicon tubing VWR 228-0701P connect PEEK to coupler
Stainless steel catheter coupler Prime Bioscience SC22/15 Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing
Thermoplastic film Sigma Aldrich PM996 Standard "parafilm"
Ultrapure ethanol VWR 64-17-5
Ultrasonic cleaning bath VWR USC200TH To accomodate 1 L beakers
Vacuum dessicator SP Bel-Art F42022-0000 to degas the PDMS or solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biochimica Numero 183
Utilizzo della microscopia a microfluidica e fluorescenza per studiare la dinamica di assemblaggio di singoli filamenti e fasci di actina
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Wioland, H., Ghasemi, F.,… More

Wioland, H., Ghasemi, F., Chikireddy, J., Romet-Lemonne, G., Jégou, A. Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63891, doi:10.3791/63891 (2022).

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